他克莫司陽離子微乳原位凝膠的制備及體外釋放研究

林 昕，張佳良，宋洪濤, （. 福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院/第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 35008；. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 35005）

免疫介導(dǎo)的炎性眼前段疾?。╥mmune-mediated inflammatory anterior ocular diseases, IIAODs）是一類常見的眼科疾病，包括過敏性角結(jié)膜炎、前葡萄膜炎等。這類疾病可能引起某些嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥，是主要的致盲原因之一[1]。他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）是治療IIAODs 的一種強(qiáng)力而有效的免疫抑制劑。然而，其水溶性差（3 μg/ml）[2]、生物利用度低，是限制其用于眼科臨床的主要障礙。為此，人們研究了許多新型他克莫司眼用制劑，如軟膏劑[3-5]、膠束[6]、納米乳[7]、混懸液[8]等，但其生物利用度仍未得到明顯改善。目前，他克莫司眼用制劑在國內(nèi)上市劑型為混懸液（Talymus?，日本千壽藥業(yè)），其藥效較常規(guī)滴眼液有一定程度的提高，但仍然容易受到淚液沖刷而流失大量藥物。因此，研發(fā)一種眼部高滯留FK506 制劑是一個(gè)亟待解決的問題。

本研究以陽離子納米乳（cationic nanoemulsion,CNE）作為他克莫司的載體，以泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188 作為凝膠基質(zhì)，制備了他克莫司陽離子微乳凝膠（FK506-loaded cationic nanoemulsion-based in-situ gel, FK506 CNE GEL）。該制劑兼具陽離子納米乳及溫敏型原位凝膠的雙重特性，不僅改善了他克莫司低水溶性問題，而且其所帶的正電荷能與角膜所帶的負(fù)電荷發(fā)生靜電相互作用，以及凝膠對眼黏膜的強(qiáng)親和力均大大延長了眼部滯留時(shí)間。本研究根據(jù)適宜的膠凝溫度篩選出最優(yōu)凝膠基質(zhì)處方并對最優(yōu)處方制備的他克莫司微乳凝膠進(jìn)行體外釋藥研究，為后期進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；AL204 電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；NS1001L 型高壓均質(zhì)機(jī)（意大利Niro Soavi 公司）；JEM-1230 透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；ZHWY-200D 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；TADiscovery II 旋 轉(zhuǎn) 流 變 儀（美 國TA 儀 器 公 司）；OS20-Pro 電動(dòng)攪拌器（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；YAOHUA 1306 精密溫度計(jì)（耀華儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑

他克莫司對照品（含量99.3%，福建科瑞藥業(yè)有限公司）；蓖麻油（湖南宏康制藥股份有限公司）；中鏈脂肪酸甘油酯（鐵嶺北亞藥用油有限公司）；吐溫-80（四川金山制藥有限公司）；泊洛沙姆188（德國BASF 公司）；泊洛沙姆407（德國BASF 公司）；西他氯胺（Sigma-Aldrich）；甘油（湖南爾康制藥有限公司）；注射用水（明澈D24UV）；異丙醇、磷酸、乙腈、二水氯化鈣（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；碳酸氫鈉（上海虹光化工廠有限公司）；氯化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；氯化鉀（天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；其他藥品和試劑均為藥用規(guī)格或分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱： Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.5）（65∶35，V∶V）；波長：210 nm；柱溫：50 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取他克莫司對照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加適量異丙醇溶解并稀釋至刻度，制成1.0 mg/ml 的儲(chǔ)備液，4 ℃下避光保存。精密移取3.0 ml 儲(chǔ)備液，置于10 ml 量瓶中，加適量異丙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得。

2.2.2 供試品溶液的配制

取他克莫司微乳凝膠樣品3 g，加入異丙醇溶解并稀釋至10 ml，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液的配制

取空白陽離子微乳凝膠樣品 3 g，加入異丙醇溶解并稀釋至10 ml，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取他克莫司儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 ml，置于10 ml 量瓶中，用異丙醇稀釋至刻度制成系列濃度的他克莫司溶液，搖勻后取上述溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄對應(yīng)色譜圖。以他克莫司色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，以他克莫司濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：

結(jié)果表明他克莫司在20～1000 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算他克莫司色譜峰面積的RSD 值為1.78%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批他克莫司微乳凝膠6 份，在上述色譜條件下測定，計(jì)算他克莫司微乳凝膠中他克莫司含量的RSD 值為2.41%。表明儀器精密度及方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

他克莫司低、中、高3 個(gè)濃度的提取回收率分別為(97.78±0.64)%、(98.22±0.51)%、(98.70±0.69)%，符合《中國藥典》2015 年版四部通則9101 的要求，方法回收率良好，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.7 他克莫司微乳凝膠的處方篩選

2.7.1 他克莫司陽離子納米乳的制備

精密量取0.1 g 他克莫司、0.02 g 西他氯胺、6 g中鏈脂肪酸甘油酯、4 g 蓖麻油放入燒杯A 中，在50 ℃下加熱溶解作為油相；精密量取1 g 吐溫-80、0.1 g 泊洛沙姆188、2.2 g 甘油放入燒杯B 中，加入適量注射用水并加熱至50 ℃作為水相。將油相緩慢逐滴加入水相中，勻速攪拌同時(shí)避免乳滴濺出，控制攪拌速度為500 r/min。在50 ℃下繼續(xù)攪拌30 min 制得初乳，加入注射用水至100 ml，經(jīng)600 bar 高壓均質(zhì)8 次后用0.1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至7.4 制得他克莫司納米乳（0.1%，W/V）。

2.7.2 他克莫司陽離子微乳凝膠的制備

精密稱取10 ml 他克莫司納米乳，緩慢加入一定量的泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188，冰浴條件下充分?jǐn)嚢枋鼓z基質(zhì)均勻分散于微乳溶液，再置于4 ℃恒溫冰箱中溶脹24 h，取出攪拌均勻即得他克莫司微乳凝膠。

2.7.3 模擬淚液（simulated tear fluid, STF）的制備[9]

稱取6.78 g 氯化鈉，1.38 g 氯化鉀，2.18 g 碳酸氫鈉及0.084 g 二水合氯化鈣，加入純化水至1000 ml。

2.7.4 加入STF 前膠凝溫度的測定

采用“玻璃瓶倒置法”[10]，將裝有10 ml 他克莫司微乳凝膠的玻璃瓶靜置于恒溫磁力攪拌水浴鍋中，設(shè)置初始溫度為10 ℃，初始平衡20 min。放入轉(zhuǎn)子以確保溫度均勻擴(kuò)散，控制升溫速度為0.5～1.0℃/min，每次升溫平衡1 min，期間不斷將玻璃瓶傾斜60°～90°并觀察瓶內(nèi)溶液是否流動(dòng)，將其不流動(dòng)時(shí)的溫度記為膠凝溫度（T1），每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次取平均值。

2.7.5 加入STF 后膠凝溫度的測定

量取10 ml 他克莫司微乳凝膠于玻璃瓶中，再加入1.75 ml STF[11]，按“2.7.4”項(xiàng)下方法測定并記錄膠凝溫度（T2），每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次取平均值。

2.7.6 聯(lián)合使用泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188 對膠凝溫度的影響

以泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188 共同作為溫敏型他克莫司微乳凝膠的凝膠基質(zhì)，考察不同凝膠基質(zhì)濃度的他克莫司微乳凝膠對膠凝溫度的影響，從而篩選出他克莫司微乳凝膠最終處方。

理想的微乳凝膠，其膠凝溫度應(yīng)高于室溫，確保以滴入形式給藥，并且經(jīng)淚液稀釋后仍能在低于眼表溫度下35～36℃形成凝膠，以確保到達(dá)用藥部位后立即轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，因此合適的膠凝溫度應(yīng)在30～36℃之間。當(dāng)泊洛沙姆407 濃度小于22%或大于26%時(shí)，在30～36℃溫度范圍內(nèi)難以形成凝膠。由圖1 可見，他克莫司微乳凝膠的膠凝溫度隨泊洛沙姆407 濃度的增加幾乎呈線性降低。保持泊洛沙姆407 濃度不變，隨著溶液中泊洛沙姆188 濃度的增加，膠凝溫度呈現(xiàn)上升趨勢。利用SPSS 軟件對膠凝溫度（T）與泊洛沙姆407 濃度（C407）及泊洛沙姆188 濃度（C188）進(jìn)行多元線性回歸分析，求得加入STF 前后多元回歸方程（2）和（3）分別為：

在回歸方程（2）中，泊洛沙姆188 濃度在11.89%處達(dá)到極值；在回歸方程（3）中，泊洛沙姆188 濃度在12.24%處達(dá)到極值，此時(shí)泊洛沙姆188 升高膠凝溫度的效果最好。因此，將處方中的泊洛沙姆188 濃度擬定為12%，泊洛沙姆407 濃度為26%。根據(jù)上述方程計(jì)算得到膠凝溫度理論值T1為30.5 ℃，T2為36.0 ℃，兩者均處于30～36℃，既滿足室溫下處于液態(tài)，又滿足在眼表溫度下形成凝膠。按照優(yōu)化后的凝膠基質(zhì)（26%泊洛沙姆407 和12%泊洛沙姆188）制備他克莫司微乳凝膠，測得其加入STF 前后分別于(31±0.17)℃、(35.7±0.26)℃發(fā)生膠凝，與理論值接近，說明上述方程預(yù)測結(jié)果可信且實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合要求。

2.7.7 他克莫司微乳凝膠的最優(yōu)處方及制備工藝

Y=16.92684+0.46505X2+0.01757X3-0.24287X4+0.44454X5-2.59299X6

按照“2.7.1”項(xiàng)下方法制備100 ml 他克莫司陽離子納米乳（0.2%，W/V），將其與100 ml 泊洛沙姆溶液（含52% 泊洛沙姆407 和24% 泊洛沙姆188）混勻，在冰浴條件下用機(jī)械攪拌器攪拌，使凝膠基質(zhì)均勻分散于微乳溶液，直至得到無團(tuán)塊、分散均勻的他克莫司微乳凝膠（0.1%，W/V）。

2.8 他克莫司微乳凝膠的表征

2.8.1 外觀及透射電鏡形態(tài)學(xué)

制得的他克莫司微乳凝膠在室溫下為乳白色液體，具有一定流動(dòng)性；當(dāng)升溫至膠凝溫度時(shí)，他克莫司微乳凝膠發(fā)生膠凝，呈半固體凝膠狀且不具有流動(dòng)性。采用磷鎢酸負(fù)染法通過透射電鏡觀察他克莫司微乳凝膠的稀釋形態(tài)，由圖2 可見其呈分布較均勻的球形。

2.8.2 他克莫司微乳凝膠流變學(xué)研究

采用TA-Discovery II 旋轉(zhuǎn)流變儀，設(shè)置振蕩頻率為1 Hz，升溫速率為1 ℃/min，振蕩模式下考察他克莫司微乳凝膠加入STF 前后在5～50℃溫度范圍內(nèi)凝膠相轉(zhuǎn)變過程。

由圖3 可知，他克莫司微乳凝膠的相轉(zhuǎn)變過程可以通過黏彈性模量的急劇增大而清晰地呈現(xiàn)。當(dāng)溫度較低時(shí)彈性模量G′和黏性模量G′′變化不大，趨勢平穩(wěn)，此時(shí)G′′＞G′，呈液態(tài)特征。當(dāng)上升至一定溫度時(shí)，G′=G′′，體系開始由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠態(tài)。隨著溫度繼續(xù)升高，G′＞G′′，直至彈性模量G′和黏性模量G′′變化曲線趨于平緩，完成相轉(zhuǎn)變。若將此時(shí)溫度定義為膠凝溫度，則與玻璃瓶倒置法測定結(jié)果相近。由加入STF 前后G′、G′′曲線對比可知，加入STF 后他克莫司微乳凝膠的膠凝溫度升高[加入STF 前后膠凝溫度分別為(32±0.31)℃、(35±0.26)℃]，G′、G′′均降低，說明體系受STF 稀釋需要更高的溫度完成相轉(zhuǎn)變，與玻璃瓶倒置法測定結(jié)果一致。加入STF 前后黏彈性模量增長速率相近，說明STF 的加入不改變凝膠膠凝機(jī)制。

2.9 他克莫司微乳凝膠體外釋放研究

2.9.1 他克莫司微乳凝膠的溶蝕動(dòng)力學(xué)

精密量取2 g 他克莫司微乳凝膠倒入表面積為 1.99 cm2的加蓋玻璃瓶，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，35 ℃條件下加熱15 min，使之完全形成凝膠。加入2.4 ml STF 作為釋放介質(zhì)，在100 r/min 振蕩條件下恒溫振蕩30 min 后傾出釋放介質(zhì)，稱量玻璃瓶重量并記錄。重復(fù)上述操作直至剩余凝膠不足10%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，作凝膠經(jīng)時(shí)溶蝕曲線圖。凝膠經(jīng)時(shí)溶蝕曲線經(jīng)動(dòng)力學(xué)方程擬合后得到方程：

由圖4 可見，凝膠溶蝕以恒定的速率進(jìn)行，與時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.9.2 他克莫司微乳凝膠中藥物的釋放

將“2.9.1”項(xiàng)下得到的釋放介質(zhì)倒入10 ml 容量瓶，取適量異丙醇溶解至刻度，超聲處理15 min，10000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，HPLC 測定藥物濃度。以累積藥物釋放量對時(shí)間作圖，得到藥物釋放曲線。釋藥曲線經(jīng)動(dòng)力學(xué)方程擬合后，方程為：

由圖5 可見，藥物釋放曲線與時(shí)間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，顯示出零級(jí)動(dòng)力學(xué)特征。

2.9.3 凝膠溶蝕與藥物釋放的相關(guān)性分析

以累積凝膠溶蝕率為橫坐標(biāo)，以累積藥物釋放率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖6 所示，曲線擬合后得到方程：

其斜率接近于1，說明凝膠溶蝕速率是影響體外釋藥速率大小的關(guān)鍵因素。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)前期使用乙腈破乳，但其破乳能力較弱，需要較大量才能使陽離子納米乳完全破乳，對樣品的稀釋較大，不利于后期定量測定，所以選擇破乳能力更強(qiáng)的異丙醇。此外，他克莫司在異丙醇中較穩(wěn)定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用異丙醇的破乳效果較好且他克莫司濃度處于定量范圍內(nèi)，輔料峰與他克莫司峰分離度＞1.5，他克莫司峰形較好，輔料等對其測定無干擾。

3.2 凝膠基質(zhì)的特性

選擇非離子型表面活性劑泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188 作為凝膠基質(zhì)是由于陰離子材料可與陽離子納米乳發(fā)生相互作用，因而不宜作為凝膠基質(zhì)，而陽離子材料具有較大毒性，通常也不適用于眼科使用。而所以選擇兩者共同作為凝膠基質(zhì)是由于低濃度的泊洛沙姆407 膠凝溫度較高，不易形成凝膠，而高濃度的泊洛沙姆407 在室溫條件下即可形成凝膠。因此，泊洛沙姆407 不宜單獨(dú)作為凝膠基質(zhì)[12]。泊洛沙姆溶液發(fā)生膠凝是由于親水性聚氧化乙烯(PEO)包裹在疏水性聚氧化丙烯(PPO)內(nèi)核的外部形成膠束，且膠束間相互聚集、纏繞的結(jié)果。通常增加親水性PEO 含量可升高膠凝溫度，因此為避免室溫下形成凝膠，在泊洛沙姆407 溶液中加入泊洛沙姆188，從而增加PEO 含量，得到適宜的膠凝溫度。