環(huán)孢素注射液在腎移植患者中的血藥濃度與基因多態(tài)性的相關性研究

張艷霞，陳泉金，宋洪濤 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥學科，福建 福州 350025）

環(huán)孢素（cyclosporine A, CsA）是腎移植術后三聯(lián)免疫抑制方案中的基礎用藥之一。環(huán)孢素個體差異大、治療窗窄，靜脈給藥雖能更快達到目標濃度，但也更容易使血藥濃度偏離治療窗。研究表明，環(huán)孢素血藥濃度的個體間差異受患者生理、病理、遺傳等因素的影響[1]，尤其是與其體內(nèi)過程相關的基因多態(tài)性，如CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677T/A、C3435T）、POR*28、PXR（ C5705T、 C39823T） 和 NFKB1-94 ins/del ATTG 等。然而，目前如何根據(jù)基因型調(diào)整用藥尚不明確，且針對環(huán)孢素注射液基因多態(tài)性的研究尚未見報道。因此，探究基因多態(tài)性對環(huán)孢素注射液血藥濃度的影響，嘗試建立以基因多態(tài)性為基礎的個體化給藥方案對優(yōu)化臨床用藥具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集了某三甲醫(yī)院泌尿外科收住的行腎移植術的患者144 例。納入標準：①患者年齡≥18 歲；②住院期間使用環(huán)孢素注射液聯(lián)合霉酚酸類藥物和糖皮質(zhì)激素。排除標準：①嚴重肝功能不全者（ALT 或AST 值≥3 倍正常上限）；②無法獲取病案資料的患者；③同時服用顯著影響環(huán)孢素血藥濃度的藥物，如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑及地爾硫?。

1.2 全血谷濃度測定

環(huán)孢素注射液連續(xù)多次給藥后應用酶增強免疫分析法（EMIT）測定全血谷濃度，取穩(wěn)態(tài)時的濃度作為最終的谷濃度（C0）。將劑量以體表面積進行校正，計算劑量校正谷濃度（C0/D′），即環(huán)孢素血藥谷濃度/劑量×體表面積。

1.3 基因分型

采用離心柱型全血DNA 快速提取試劑盒提取全血樣本中的基因組DNA，獲得DNA 樣本濃度為10～60 ng/ml。基因分型采用Sequenom Mass ARRAY?SNP 檢測系統(tǒng)進行檢測，由上海吉凱基因化學技術公司完成。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 環(huán)孢素注射液的臨床療效分析

入組患者共144 例，其中男性109 例，女性35 例，患者基本信息見表1。

表1 研究對象的一般臨床資料（n=144）

對患者環(huán)孢素注射液C0及用藥后的血肌酐降低幅度進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，單獨使用環(huán)孢素注射液（單獨用藥組）后肌酐降低的患者比例為68.8%；聯(lián)合使用環(huán)孢素注射液和糖皮質(zhì)激素沖擊治療（聯(lián)合用藥組）后肌酐降低的患者比例為85.0%。單獨用藥組比聯(lián)合用藥組具有更高的C0〔（189.50±38.56）ng/ml vs（172.87±44.27）ng/ml〕，經(jīng)獨立樣本T 檢驗，兩組患者C0的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。然而，對兩組患者的肌酐降低幅度進行Mann-Whitney U 檢驗發(fā)現(xiàn)，單獨用藥組患者的肌酐降低幅度顯著低于聯(lián)合用藥組〔19.27（22.84）% vs 45.25（50.38）%；P＜0.01〕（見表2）。

2.2 哈迪-溫伯格平衡檢驗和基因型分布情況

入 組 患 者 的 CYP3A4*18B、 CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、 ABCB1 G2677T/A、 ABCB1 C3435T、PXR C5705T、PXR C25385T、NFKB1 -94 ins /del ATTG 及POR*28（僅64 例患者）等9 個SNPs 的基因型頻率分布及HWE 遺傳平衡吻合度計算見表3。9 個SNPs 均符合HWE（P＞0.05），說明研究對象來自同一孟德爾群體，具有良好的群體代表性。

表2 單獨用藥與聯(lián)合用藥方案的血肌酐降低幅度差異

表3 腎移植患者中9 個SNPs 基因分型以及等位基因頻率(n=144)

2.3 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液血藥濃度的相關性

各位點不同基因型患者之間使用環(huán)孢素注射液的C0/D′的差異見表4。在9 個SNPs 中，CYP3A4*18B 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液的C0/D′具有顯著相關性，*1/*1 基因型患者的C0/D′顯著高于*18B/*18B 基因型患者（P＜0.05）；CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 G2677T/A、ABCB1 C3435T、 PXR C5705T、 PXR C39823T、NFKB1-94 ins/del ATTG 及POR*28 基因多態(tài)性均與腎移植患者環(huán)孢素注射液的C0/D′無顯著相關性（P＞0.05）。

2.4 環(huán)孢素注射液個體化給藥模型的建立

參考單因素和多因素分析方法，將3 個人口統(tǒng)計學指標（性別、年齡、體重）、3 個臨床指標（血紅蛋白、血細胞比容、供體類型）和上述9 個SNPs 基因多態(tài)性定義為自變量，與環(huán)孢素注射液的C0/D′進行單因素相關分析。結(jié)果顯示，在以上指標中，血紅蛋白、血細胞比容和CYP3A4*18B 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液的C0/D′呈正相關，CYP3A4*18B 與環(huán)孢素注射液的C0/D′呈負相關。其他12 個指標與環(huán)孢素注射液C0/D′均沒有顯著相關性，詳見表5。

對上述3 個相關因素與環(huán)孢素注射液C0/D′進行的初步多重逐步回歸分析，排除存在共線性問題的因素，得到最佳模型。在最佳回歸模型中，血紅蛋白和CYP3A4*18B 基因多態(tài)性對環(huán)孢素注射液C0/D′均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.000 和0.024）。根據(jù)最佳回歸模型得到的回歸方程即環(huán)孢素注射液C0/D′的預測算法，方程式如下：

表4 各位點不同基因型對環(huán)孢素C0/D′的影響

式中因變量Y為環(huán)孢素注射液C0/D′，因此，應用環(huán)孢素注射液的腎移植患者環(huán)孢素注射液維持劑量預測模型為：

公式中：X1代表用藥前患者的血紅蛋白含量，X2代表CYP3A4*18B 基因多態(tài)性；CYP3A4 *1/*1型患者X2=0，CYP3A4*1/*18B 型患者X2=1，CYP3A4*18B/*18B 型患者X2=2；C 為臨床TDM 目標谷濃度值。

3 討論

糖皮質(zhì)激素沖擊治療是腎移植術后發(fā)生急性排斥反應的一線治療方案。然而，由于糖皮質(zhì)激素沖擊治療不良反應多且發(fā)生率高，對于臨床上僅發(fā)生或疑似發(fā)生亞臨床或臨界排斥反應的患者可能并不是最佳用藥。蔡治濤等[2]收錄在《2012 年中國器官移植大會論文匯編》中的研究指出以靜脈環(huán)孢素為基礎的免疫抑制治療方案是一種安全、有效的治療手段。為探究環(huán)孢素注射液在臨床上的療效，本研究對兩種治療方案（環(huán)孢素注射液單藥vs 環(huán)孢素注射液和糖皮質(zhì)激素聯(lián)合用藥）對腎移植術后發(fā)生亞臨床或臨界排斥反應的臨床療效進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素注射液單藥組在降低患者肌酐水平方面的療效不及環(huán)孢素注射液和糖皮質(zhì)激素聯(lián)合用藥組〔肌酐降低比例：68.8% vs 85.0%；肌酐降低幅度：19.27（22.84）% vs 45.25（50.38）%；P＜0.01〕，但單藥組具有更高的穩(wěn)態(tài)谷濃度C0〔（189.50±38.56）ng/ml vs （172.87±44.27）ng/ml〕。該研究結(jié)果表明對于腎移植術后發(fā)生亞臨床或臨界排斥反應的患者，單用環(huán)孢素注射液仍然具有較好的臨床療效，且血藥濃度處于比較安全的劑量范圍，可能是比較適合該類患者的治療方案。

表5 各觀察指標與環(huán)孢素注射液C0/D′的相關性

大量研究表明，遺傳因素如編碼藥物轉(zhuǎn)運體、代謝酶、作用靶點和核受體的基因多態(tài)性[3]是引起藥物在人體內(nèi)的處置和藥物反應的個體性差異的主要原因，其中CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677T/A、C3435T）、POR*28、PXR（ C5705T、 C39823T） 以 及 NFKB1-94 ins/del ATTG 對環(huán)孢素藥動學的影響較為重要。

CYP3A4 和CYP3A5 是環(huán)孢素的主要代謝酶，其編碼基因的多態(tài)性可能影響酶的表達，進而影響環(huán)孢素的藥動學。研究表明，CYP3A4*18B（或稱CYP3A4*1G，82266G＞A；rs2242480），是與環(huán)孢素的體內(nèi)代謝相關的SNPs 之一，在中國人群中突變頻率為29.5%[4]，該位點的突變可能會提高CYP3A4的活性[5]，增加環(huán)孢素的代謝從而降低其血藥濃度。Li 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶CYP3A4*18B/*18B 基因型患者的環(huán)孢素血藥濃度顯著低于*1/*1 及*1/*18B 基因型患者，但*1/*1 與*1/*18B 基因型患者間差異無統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示，*1/*1 基因型患者的環(huán)孢素注射液的C0/D′顯著高于*18B/* 18B 基因型患者（P＜0.05），但*1/*1 與*1/*18B 基因型患者間差異無統(tǒng)計學意義。該結(jié)果與文獻報道一致。CYP3A5*3（6986A＞G；rs776746）是另一個與環(huán)孢素的體內(nèi)代謝相關的SNP，在中國人群中的突變頻率高達75.4%[7]。當*1 突變?yōu)?3 時可導致mRNA 剪接發(fā)生改變和蛋白質(zhì)截斷，使CYP3A5 酶活性降低或消失，減少環(huán)孢素經(jīng)CYP3A5 酶的代謝，從而使環(huán)孢素血藥濃度升高。目前該位點基因多態(tài)性與環(huán)孢素血藥濃度相關性的研究結(jié)論尚不統(tǒng)一[8-11]。本研究結(jié)果顯示，CYP3A5*3 基因多態(tài)性均與環(huán)孢素注射液的C0/D′無相關性。出現(xiàn)這一結(jié)果可能主要是環(huán)孢素由CYP3A 酶系中的CYP3A4 代謝，其對環(huán)孢素的清除率是CYP3A5 的2.3 倍[12]所導致。

P 糖蛋白（P-gp）在環(huán)孢素的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著重要作用，靜脈給藥可被肝臟P-gp 將藥物轉(zhuǎn)移至膽道使藥物膽汁排泄增加，從而使血藥濃度降低。Pgp 是多重耐藥基因ABCB1 編碼的產(chǎn)物，因此ABCB1 基因多態(tài)性可影響P-gp 的表達從而影響環(huán)孢素的血藥濃度。本研究結(jié)果顯示，ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T 和ABCB1 G2677T/A 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液的C0/D′無相關性，分析原因可能是由于P-gp 主要位于小腸黏膜成熟上皮細胞的刷狀緣上，只有小部分分布于肝細胞，因此，由ABCB1 基因多態(tài)性導致的P-gp 表達和活性的改變對環(huán)孢素注射液血藥濃度的影響較小。

孕烷X 受體（PXR）編碼基因多態(tài)性很可能會影響PXR 表達或功能，進而影響CYP3A 酶及P-gp的表達，從而影響環(huán)孢素的藥動學。研究報道[13-14]，C5705T（ rs3814055） 、 C39823T（ rs2276707） 與CYP3A4 表型、活性和含量有關，且二者在中國人群中的突變頻率分別是38.06%和78.95%[15]。但截至目前，PXR 基因多態(tài)性是否與環(huán)孢素藥動學具有相關性尚存在爭議。本研究結(jié)果顯示，PXR C5705T 及C39823T 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液血藥濃度無相關性。

NFKB1-94 ins/del ATTG 中ATTG 4 個堿基的缺失(deletion)引起啟動子活性的降低，進而降低NF-κB 的表達和功能，較少炎癥反應的發(fā)生，從而減少對環(huán)孢素代謝的影響。Zhang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NFKB1 -94ATTG 插入突變的純合子個體（-94ATTG ins/ins）環(huán)孢素的C0/D'顯著高于缺失突變（-94ATTG del/del）的個體〔（75.9±32.9）vs.（55.1±15.1）ng/ml per mg/kg，P=0.026〕。然而，本研究卻發(fā)現(xiàn)缺失突變純合子患者的C0/D′高于插入突變純合子患者，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是該基因?qū)Νh(huán)孢素的血藥濃度的影響主要是通過受NF-κB 的炎癥反應而實現(xiàn)的，屬于間接作用，所以可能對環(huán)孢素注射液的C0/D′影響較小，在其他主要影響因素的作用下導致缺失突變純合子患者的C0/D′高于插入突變純合子患者。

POR*28 在中國人群中突變率為29.6%[16]。有研究報道，POR*28 能夠增加CYP3A 的活性，從而增加環(huán)孢素經(jīng)CYP3A 的代謝使得其血藥濃度降低。Elens 等[17]分析了174 例腎移植患者的POR*28 的基因型及環(huán)孢素的部分藥動學參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， POR*28/*28 患 者 的C0/D'較POR*1/*28 和*1/*1 患者低15.1%（CI 95%=224.8～24.2%；P=0.03），但POR*1/*28 型和POR*1/*1 型間無顯著性差異。然而，本研究結(jié)果顯示，POR*28/*28 基因型患者環(huán)孢素的C0/D′與POR*1/*28 和*1/*1 基因型患者間并無顯著性差異。

本研究所建立的給藥劑量模型，只納入血紅蛋白和CYP3A4*18B 基因多態(tài)性兩個因素，經(jīng)檢驗模型是有意義的（F=23.85，P＜0.001），但該模型只能解釋25.3%（R2=0.253）的個體差異，可能存在其他的對環(huán)孢素注射液C0/D′具有顯著影響的因素，如藥物相互作用（保肝藥物、胃黏膜保護藥物以及活血藥物等）、患者術后內(nèi)環(huán)境變化等，這些都可能影響環(huán)孢素注射液的體內(nèi)藥動學過程。這也是本研究存在的不足之處。

綜上所述，本研究首次研究了基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液血藥濃度的相關性并發(fā)現(xiàn)只有CYP3A4*18B 基因多態(tài)性與環(huán)孢素注射液C0/D′呈顯著相關，而其他8 個SNPs 基因多態(tài)性對環(huán)孢素注射液C0/D′無影響。但由于目前國內(nèi)外關于環(huán)孢素注射液的相關研究幾乎空白，現(xiàn)有參考資料較少，本研究作為初探，其結(jié)果仍需進一步進行大樣本量的臨床驗證，對模型進行優(yōu)化。