自制復方酮康唑軟膏的藥效學和安全性研究

嚴 佳，吳 博,2，陶 春，宋洪濤 （. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥學科，福建 福州 350025；2. 福建醫(yī)科大學藥學院，福建 福州 35008）

頭癬、體癬、手癬等皮膚病多由淺部真菌感染引起，發(fā)病率高，可達全部皮膚病的25%左右。常用的市售制劑存在多個問題，首先，藥效不全面。淺部真菌感染常合并有細菌感染[1-2]，因此單純給予抗真菌藥物無法根治疾病。其次，耐藥性。市售復方酮康唑乳膏雖然結合了抗真菌和抗細菌藥物，但選用的硫酸新霉素易導致細菌產(chǎn)生耐藥性。最后，皮膚安全性。為產(chǎn)生抗過敏作用，市售復方酮康唑乳膏中添加了丙酸氯倍他索，但易導致皮膚燒灼感、瘙癢刺痛和皮膚萎縮，長期大面積用藥可導致高血糖、尿糖等不良反應[3]。對此，前期研究制備并優(yōu)化了新型復方酮康唑軟膏，含有酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松[4]。其中，莫匹羅星是新型抗菌藥物，通過結合細菌異亮氨酸轉RNA 合成酶，阻斷異亮氨酸的供給，導致細菌死亡，具有廣譜、高效、不易發(fā)生過敏、不易發(fā)生交叉耐藥和多重耐藥等優(yōu)勢[5-6]?？匪崮姿蓪儆趶娦瞧べ|激素，皮膚不良反應極為少見。

在此基礎上，本課題重點研究自制的復方酮康唑軟膏的體外抑菌作用，并對其皮膚刺激性和變態(tài)反應進行考察，從而證明自制制劑的有效性和安全性，并說明選擇3 種藥物的合理性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

生物安全柜（HFsafe1200 型，上海力申科學儀器有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（303-6B 型，南通科學儀器廠）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-160 型，上海躍進醫(yī)療器械廠）；LDZX-40KBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

自制復方酮康唑軟膏（第九〇〇醫(yī)院藥學科制備，含酮康唑，莫匹羅星，糠酸莫米松，批號20171220）；復方酮康唑乳膏（含酮康唑，丙酸氯倍他索，硫酸新霉素，批號1408028，上海寶龍藥業(yè)有限公司）；莫匹羅星軟膏（含莫匹羅星，批號20161006，人福醫(yī)藥有限公司）；酮康唑乳膏（含酮康唑，批號150302，福建太平洋制藥有限公司）。

1.3 菌種

紅色毛癬菌CMCC(F)T1a、須癬毛癬菌CMCC(F)T5a、斷發(fā)毛癬菌CMCC(F)T4b、犬小孢子菌CMCC(F)M3d、石膏樣小孢子菌CMCC(F)M2c、裴氏著色真菌CMCC(F)M2c，均購自中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所。

2 方法與結果

2.1 軟膏的制備

參考前期研究制備軟膏[4]，酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松的含量依次為2%、2%和0.1%。同時，制備缺酮康唑的陰性對照軟膏、缺莫匹羅星的陰性對照軟膏分別用于抗真菌試驗、抗細菌試驗。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 方法

取直徑9 cm 的培養(yǎng)皿，加入20 ml 培養(yǎng)液，制成培養(yǎng)基平板。細菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1～3 d；真菌用沙堡弱培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。菌落形成后，挑取一定量的菌落，加入1 ml 滅菌蒸餾水，充分混合均勻。采用紫外分光光度計調整菌懸液濁度為0.5，相當于5×10 CFU/ml。用無菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于實驗用培養(yǎng)基平皿表面。

采用定性濾紙制成直徑7 mm 的圓形紙片、經(jīng)滅菌，爾后分別浸入空白軟膏（不含藥）、自制復方酮康唑軟膏、以及市售的復方酮康唑乳膏、酮康唑乳膏和莫匹羅星軟膏的甲醇溶液中，待藥液完全浸潤紙片后，取出紙片放置于已涂布菌懸液的培養(yǎng)基表面。細菌置隔水式恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3 d，真菌置霉菌培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察各藥敏紙片周圍抑菌圈，并測定其直徑值（長徑與短徑的平均值, mm），每株菌同時做3 個平板。

2.2.2 統(tǒng)計方法

2.2.3 對真菌抗菌試驗結果

實驗結果表明，莫匹羅星軟膏和空白軟膏的紙片均被真菌包圍，而其余3 種制劑的紙片均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈。自制軟膏、市售的酮康唑乳膏和復方酮康唑乳膏的抑菌圈直徑相當（P＞0.05），對不同真菌的抑菌圈直徑大小為：斷發(fā)毛癬菌＞石膏樣小孢子菌＞裴氏著色真菌＞須癬毛癬菌＞犬小孢子菌＞紅色毛癬菌。由此可知，各制劑的抑菌圈直徑大小順序為：自制復方酮康唑軟膏=復方酮康唑乳膏=酮康唑乳膏＞莫匹羅星軟膏=陰性對照軟膏。提示自制復方酮康唑軟膏對真菌的抑菌活性與市售單成分酮康唑乳膏、復方成分的復方酮康唑乳膏相當，結果見表1。

2.2.4 對細菌抗菌試驗結果

在2 種細菌的培養(yǎng)皿中，各組對銅綠假單胞菌均未產(chǎn)生抑菌圈；對金黃色葡萄球菌，空白軟膏和市售的酮康唑乳膏未產(chǎn)生抑菌圈，其余制劑產(chǎn)生了明顯的抑菌圈。自制軟膏與市售莫匹羅星軟膏的抑菌圈直徑均為20 mm 左右（P＞0.05），且均顯著大于復方酮康唑乳膏（P＜0.01）。由此可知，各制劑的抑菌圈直徑大小順序為：自制酮康唑軟膏=莫匹羅星軟膏＞復方酮康唑乳膏＞酮康唑乳膏=陰性對照組軟膏，結果見表2。

2.3 皮膚安全性實驗[10-12]

2.3.1 單次刺激性試驗

取雌雄各半的健康家兔4 只，于試驗前24 h，在家兔背部脊柱兩側對稱劃定左、右各3 cm×3 cm 的相同區(qū)域。用電剪刀剔除兔毛后，用硫化鈉溶液進行脫毛處理，并于脫毛24 h 后，檢查去毛處皮膚是否損傷，排除損傷皮膚。采用同體左右側自身對比法，設給藥組（自制復方酮康唑軟膏）與對照組（空白軟膏）。家兔背部左側皮膚涂布空白軟膏，右側皮膚涂布0.5 g 復方酮康唑軟膏，然后用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再用膠布和繃帶加以固定。

表1 自制與市售制劑對幾種皮膚真菌抑菌試驗結果（抑菌圈直徑/mm）

表2 自制與市售制劑對兩種細菌的抑菌試驗結果（抑菌圈直徑/mm）

采用封閉實驗，貼敷時間為4 h。實驗結束后除去受試藥品并用溫水清潔給藥部位，在自然光線下觀察皮膚反應。于清洗后的1、24、48、72 h 觀察涂抹部位皮膚反應，按表3 進行皮膚刺激反應評分，并計算受試動物積分的平均值，按表4 判斷皮膚刺激強度。

觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組僅有1 只家兔出現(xiàn)勉強可見的輕微紅斑，其余均未出現(xiàn)紅斑、充血、水腫等刺激癥狀。根據(jù)表3 評分，對照組皮膚刺激反應平均積分值為0，而實驗組的分值小于0.5（表5），根據(jù)表4 可認為復方酮康唑軟膏單次給藥對皮膚無刺激性。

表3 皮膚刺激反應評分

2.3.2 多次刺激性試驗

多次刺激性試驗中家兔的處理方法和初次給藥方法與“2.3.1”項下相同，不同的是，對照組和給藥組每天涂抹1 次，給藥時間持續(xù)涂抹14 d。從第2 天開始，每次涂抹前修剪毛，用溫水清除殘留受試物1 h 后觀察，按表3 評分。最后按公式每天每只動物平均積分=紅斑和水腫積分總和/（受試動物×14），計算平均積分，以表4 判斷皮膚刺激強度分級。

多次給藥后定期觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的家兔在各時間均未出現(xiàn)紅斑、充血和水腫等皮膚刺激。實驗組有2 只家兔在8、12、13 和14 d 時出現(xiàn)極輕微的紅斑，平均分值為0.25，在其余時間所有家兔無紅斑、充血等刺激癥狀（表6），根據(jù)表4 可認為復方酮康唑軟膏多次給藥對皮膚無刺激性。

表4 皮膚刺激強度分級

表5 自制復方酮康唑軟膏皮膚單次刺激性試驗評分結果

表6 自制復方酮康唑軟膏皮膚多次刺激性試驗評分結果

2.3.3 皮膚變態(tài)反應試驗

采用豚鼠為試驗動物，試驗前約24 h，將豚鼠背部左側2 cm×2 cm 區(qū)域的毛剔短后，用硫化鈉溶液進行脫毛處理。脫毛后24 h，檢查去毛處皮膚是否損傷，有損傷的皮膚不宜進行試驗。

試驗分為2 個階段，首先在誘導接觸階段，將約0.5 g 樣品涂于豚鼠皮膚上，用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再以膠布封閉固定6 h；第7 天和14 天同法重復一次。在激發(fā)接觸階段，于末次誘導接觸后14～28 d，將約0.2 g 的樣品涂于豚鼠背部右側2 cm×2 cm 去毛區(qū)（接觸前24 h 脫毛），然后用一層玻璃紙和二層紗布覆蓋，再以無刺激膠布固定6 h。激發(fā)接觸后24 h 和48 h 觀察皮膚反應，按表3 評分，當受試組動物出現(xiàn)皮膚反應積分≥2時，認為該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(陽性)，按表7判定受試物的致敏強度。

表7 致敏強度分級

將豚鼠隨機分為3 組，實驗組和陽性對照組均含20 只豚鼠，陰性對照組含10 只豚鼠。實驗組采用上述的復方酮康唑軟膏，陽性對照組和陰性對照組的處理方法與實驗組基本相同，但陽性對照組采用2,4-二硝基氯代苯為樣品，而陰性對照組在誘導接觸時不給予任何樣品，在激發(fā)接觸時給予自制復方酮康唑軟膏。實驗結果如表8 所示，自制復方酮康唑軟膏致敏率為0，無皮膚變態(tài)反應。

2.3.4 組織學考察

在單次、多次刺激性試驗和皮膚變態(tài)反應試驗之后，將試驗動物處死，并取左右側皮膚，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋及切片后，進行HE 染色，最后在倒置相差顯微鏡下觀察皮膚。如圖1、2、3 所示，在單次、多次刺激性試驗和皮膚變態(tài)反應試驗中，給予自制軟膏后，皮膚的各層結構完整，與對照組的正常皮膚組織基本一致。

3 討論

淺部真菌病主要由毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬引起[13-14]，其中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌是手、足癬中最常見的真菌，70%以上的病例中均可檢出[15]，本研究中抗真菌實驗選擇的菌種均為皮膚癬菌病的最常見的致病菌。酮康唑是抑制真菌的常用藥物，本實驗顯示，自制軟膏抗真菌活性與市售制劑相當，特別是在斷發(fā)毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌方面表現(xiàn)出較強的殺菌活性。

表8 自制復方酮康唑軟膏對豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗結果

在抗細菌方面，常見淺表局限性皮膚及軟組織感染，其引起的病原菌相對簡單和明確，主要是金葡菌和化膿性鏈球菌[16]。限于實驗室條件，本實驗僅選取現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌兩種細菌為試驗菌種。實驗顯示，銅綠假單胞菌不在莫匹羅星抗菌譜中；而含有莫匹羅星的自制軟膏在抗金黃色葡萄球菌活性上大大優(yōu)于市售酮康唑類產(chǎn)品，說明莫匹羅星是本處方較為理想的選擇。

淺部真菌感染經(jīng)治療后極易復發(fā)的重要原因之一是合并細菌感染。有報道稱將市售的復方酮康唑乳膏與莫匹羅星軟膏交替使用，可對真菌性皮膚潰瘍患者有更好的治療作用[17]。本研究表明自制復方酮康唑軟膏兼具顯著的抗真菌和細菌作用，優(yōu)于多數(shù)市售制劑，且單次給藥和多次給藥的刺激性試驗和皮膚變態(tài)反應試驗表明，自制軟膏具有良好的安全性。

自制復方酮康唑軟膏的藥物組成為淺部真菌感染提供了一種更加簡便、有效的治療手段。綜合藥效結果和安全性結果，自制軟膏有望成為在皮膚淺部真菌感染疾病中，替代市售制劑成為更加優(yōu)越的選擇。