來氟米特通過調(diào)節(jié)miR-449a 在肺纖維化中的機制研究

劉 冬，賴偉男 （. 陸軍軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院藥劑科，重慶 400037；. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院風濕免疫科，廣東 廣州

510515）

成纖維細胞的增殖和活化引起的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的累積是肺纖維化的主要病理基礎[1]。肺纖維化治療難度大，且發(fā)展到晚期纖維化過程不可逆轉(zhuǎn)，而一些藥物的長期使用會提高肺纖維化的發(fā)生風險，對于這臨床的一類并發(fā)癥應格外重視。來氟米特（leflunomide，LEF）是治療類風濕性關節(jié)炎的常用藥物，但是有臨床報道稱，長期服用LEF 可能提高肺纖維化的發(fā)生風險，但是也有研究認為LEF 對肺纖維化影響不大[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）長度約為18～22 個核苷酸，雖然不具備編碼功能，但是可通過識別和堿基配對的方式與靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，從而參與基因表達的調(diào)控[3]。miR-449a 具有抑制腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡的作用[4]，并且最新研究發(fā)現(xiàn)miR-449a 可能與肺纖維化有關，在二氧化硅誘導的肺纖維化模型中，miR-449a 可通過調(diào)節(jié)自噬緩解纖維化[5]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白，其磷酸化后可通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)控細胞生物學行為[6]。本文發(fā)現(xiàn)了miR-449a 的過表達會顯著緩解由LEF 引起的肺成纖維細胞的增殖，而沉默miR-449a 對細胞的影響相反，這可能是LEF 引起肺纖維化的機制之一，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人肺成纖維細胞MRC-5 購自美國ATCC；LEF（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，國藥準字H20000550）；RPMI-1640 培養(yǎng)基以及血清購自美國Gibco 公司；miR-449a mimic 和inhibitor 質(zhì)粒由Genepharma 公司構(gòu)建；

LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司）；熒光顯微鏡（Olympus BX51）；Model 680 酶標儀（Bio-Rad，美國）；流式細胞儀（BD FACScanto II，Becton Dickinson，美國）。CCK-8 試劑盒（武漢華美公司）；凋亡試劑盒（美國Thermo Fisher）；PVDF 膜（美國Bio-Rad 公司）；抗體購自美國Abcam 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa 和SYBR Prellix Ex TaqTM 實時PCR 試劑盒購自TaKaRa（日本）。

1.2 細胞分組和轉(zhuǎn)染

MRC-5 細胞在RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。細胞被分為6 組，即對照組、LEF 組、LEF+mimic 組、mimic 組、LEF+inhibitor 組和inhibitor 組。其中LEF+mimic 組和mimic 組 通 過 轉(zhuǎn) 染miR-449a mimic 質(zhì) 粒 過 表 達miR-449a 的水平，LEF+inhibitor 組和inhibitor 組通過轉(zhuǎn)染miR-449a inhibitor 質(zhì)粒使miR-449a 的水平降低。對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。LEF 組、LEF+mimic組和LEF+inhibitor 組分別在5 mg/L LEF 的條件下培養(yǎng)48 h。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 qPCR 檢測miR-449a

將細胞裂解后收集總RNA 并檢測純度，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后進行PCR 反應，步驟如下：95 ℃下2 min，95 ℃下15 s，60 ℃下25 s和72 ℃下60 s，共進行40 個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法分析miR-449a 水平。引物序列如下（5′-3′），miR-449a 上游引物：TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC，下游引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6 上游引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT，下游引物：TATGGCTAGCATGACTGGT。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力

將細胞調(diào)節(jié)至2×104個細胞/ml 的密度，接種于96 孔板中，100 μl/孔。再培養(yǎng)24、48 和72 h 后將10 μl 的CCK-8 試劑加入至每孔中，37 ℃下培養(yǎng)2 h。在酶標儀上測量450 nm 處的吸光度（A），計算相對細胞活力。

1.3.3 克隆形成檢測細胞增殖能力

分別將各組細胞200 個細胞在6 孔板中培養(yǎng)，每3 天補充一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 周。用PBS 洗滌細胞并加入甲醇固定15 min，加入使用結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下觀察克隆形成的數(shù)目，≥50 個細胞的集落為一個克隆形成。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將細胞洗滌后重懸于結(jié)合緩沖液中，使細胞濃度為2.5×105個/ml。根據(jù)試劑盒說明書將試劑加入細胞中，并通過流式細胞術分析細胞凋亡情況。

1.3.5 免疫熒光染色

通過免疫熒光染色檢測α 平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和膠質(zhì)蛋白I（collagen I，Col I）的表達情況分析細胞的表型和細胞外基質(zhì)。然后將細胞在4 ℃下使用α-SMA 的抗體染色過夜，用異硫氰酸四甲基羅丹明的山羊抗兔抗體染色30 min。然后再于避光條件下利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）對細胞核染色10 min，通過熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 Western blot 檢測蛋白表達

通過Western blot 檢測JNK 和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的水平。將細胞裂解、離心收集總蛋白并檢測蛋白濃度。使用10%的SDS-PAGE 凝膠用于電泳分離蛋白，電泳后使用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。分別加入一抗（稀釋1:1 000）室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗（稀釋1:5 000），孵育3 h。通過Quantity One軟件分析條帶的灰度值并以GAPDH 為參照計算目標蛋白質(zhì)的表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19 軟件進行處理，實驗結(jié)果以平均值±標準偏差（SD）表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，統(tǒng)計學顯著性表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞miR-449a 表達水平

使用qPCR 檢測各組細胞中miR-449a 表達水平。結(jié)果顯示mimic 組miR-449a 水平顯著高于對照組，inhibitor 組的miR-449a 表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染實驗成功。LEF 組的miR-449a 水平顯著低于對照組（P＜0.05），并且LEF+mimic組的miR-449a 的表達水平顯著高于LEF 組，LEF+inhibitor 組的miR-449a 顯著低于LEF 組（P＜0.05）。表明LEF 可抑制人成纖維細胞中miR-449a 的表達，見表1。

表1 各組miR-449a 表達水平比較

2.2 各組細胞的細胞活力比較

使用CCK-8 法檢測各組細胞的相對細胞活力。結(jié)果顯示在第48 小時和第72 小時，LEF 組和inhibitor 組的細胞活力顯著高于對照組（P＜0.05），而mimic 組的細胞活力顯著低于對照組（P＜0.05）。此外，LEF+mimic 組的細胞活力顯著低于LEF 組，LEF+inhibitor 組的細胞活力顯著高于LEF 組（P＜0.05），過表達miR-449a 可部分逆轉(zhuǎn)LEF 對促進人成纖維細胞的細胞活力的作用，而降低miR-449a 的水平會進一步促進細胞活力，見表2。

表2 各組細胞的相對細胞活力比較（%）

2.3 各組細胞增殖和凋亡情況比較

LEF 組和inhibitor 組的克隆形成數(shù)目顯著高于對照組而細胞凋亡率低于對照組（P＜0.05），mimic 組的克隆形成數(shù)目顯著低于對照組而細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05）。此外，LEF+mimic組的克隆形成數(shù)目顯著低于LEF 組而細胞凋亡率顯著高于LEF 組（P＜0.05），LEF+inhibitor 組的克隆形成數(shù)目在LEF 的基礎上進一步升高而細胞凋亡率進一步降低（P＜0.05）。過表達miR-449a 可逆轉(zhuǎn)LEF 促進肺成纖維細胞增殖和抑制凋亡的作用，而低表達miR-449a 會加劇LEF 的作用，見表3。

表3 各組細胞增殖和凋亡情況比較

2.4 各組細胞中α-SMA 和Col I 水平比較

本次研究通過免疫熒光技術檢測了各組α-SMA 的水平來分析細胞向肌細胞轉(zhuǎn)化情況，檢測Col I 的水平來分析ECM 水平。其中藍色熒光為細胞核，紅色熒光為α-SMA 或Col I 蛋白。LEF 組和inhibitor 組的熒光強度顯著高于對照組（P＜0.05），而mimic 組的相對熒光強度低于對照組（P＜0.05）。此外，LEF+mimic 組的相對熒光強度顯著低于LEF 組（P＜0.05），LEF+inhibitor 組的相對熒光強度顯著高于LEF 組（P＜0.05）。過表達miR-449a 可部分逆轉(zhuǎn)LEF 對促進人成纖維細胞α-SMA 和Col I 表達的促進作用，見圖1、圖2 和表4。

2.5 各組p-JNK/JNK 水平比較

LEF 組和inhibitor 組的p-JNK/JNK 水平高于對照組，mimic 組的p-JNK/JNK 水平顯著低于對照組（P＜0.05），并且LEF+mimic 組中p-JNK/JNK 水平顯著低于LEF 組（P＜0.05），LEF+inhibitor 組中p-JNK/JNK 水平顯著高于LEF 組（P＜0.05）。過表達miR-449a 可逆轉(zhuǎn)LEF 促進JNK 蛋白磷酸化的作用，見表5。

3 討論

肺纖維化是一種慢性進行性肺部疾病，但是臨床上尚無治療肺纖維化的特效方法和藥物，目前用于進行性肺纖維化的唯一有效治療方法是肺移植[7]，若患者未接受肺移植，通常在診斷后的3 至5 年內(nèi)出現(xiàn)肺功能喪失導致呼吸衰竭和死亡。肺纖維化的病理特征包括纖維增生和ECM 沉積過多，但是這個過程較為漫長，并且在早期癥狀不明顯，也缺乏相應的診斷手段，在患者確診為肺纖維化時再采取治療效果有限。因此雖然LEF 是否會引起肺纖維化尚無定論，但是由于肺纖維化的惡性預后和致死率，LEF 治療過程中的肺纖維化風險仍是臨床重點關注的問題。研究LEF 促進肺纖維化的機制是尋找診斷和治療肺纖維化新方法的重要途徑。

表4 各組細胞α-SMA 相對熒光強度比較

表5 各組p-JNK/JNK 相對水平比較

LEF 是一種調(diào)節(jié)免疫的藥物，其作用機制通過抑制二氫乳清酸脫氫酶來抑制T 淋巴細胞和其他類型細胞的細胞周期進程[8]。LEF 引起的肺纖維化并導致患者死亡的病例隨著LEF 使用時間的增加而升高[9]。一項長期的調(diào)查隨訪報告指出，在5911 例使用LEF 治療的患者中，共出現(xiàn)了80 例間質(zhì)性肺病，其中有27 例患者死亡，并且結(jié)果判定其中有18 例患者的死亡是由于LEF 直接導致[10-11]。在肺纖維化的過程中，成纖維細胞向成肌纖維細胞轉(zhuǎn)化和ECM 的累積是兩大特點[12]。因此本文主要分析了LEF 對人肺成纖維細胞的影響，結(jié)果顯示LEF 可顯著促進成纖維細胞的細胞活力和增殖，抑制其凋亡，并誘導細胞表達大量的α-SMA 蛋白和ECM 累積。α-SMA 是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的檢測指標之一，也是體外研究肺纖維化的最常用指標，而Col I 是ECM 的主要成分[13]。作者提示了LEF 可通過活化成纖維細胞和促進其增殖參與肺纖維化。

為進一步分析LEF 調(diào)節(jié)肺成纖維細胞增殖和表達α-SMA 的機制，我們檢測了miR-449a 在其中的作用。miR-449a 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，研究已經(jīng)證實了其可通過靶向并誘導靶基因mRNA 降解，抑制肺癌細胞的增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[14-15]。本次研究結(jié)果顯示LEF 可抑制miR-449a 的表達水平，并且過表達miR-449a 可抑制成纖維細胞的細胞活力、細胞增殖能力，抑制α-SMA 和Col I 蛋白的表達，并促進其凋亡。過表達miR-449a 會逆轉(zhuǎn)由LEF 引起的細胞活化、增殖以及α-SMA 和Col I 蛋白的表達，而抑制miR-449a的水平會進一步加劇LEF 的促纖維化作用。Zhang等[16]的研究結(jié)果也顯示miR-449a 具有調(diào)節(jié)α-SMA 蛋白表達的作用。通過進一步的研究我們還發(fā)現(xiàn)LEF 可促進JNK 的磷酸化，過表達miR-449a 會抑制JNK 磷酸化水平并顯著逆轉(zhuǎn)LEF 促進JNK 磷酸化的作用。JNK 的活化在促進肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用已經(jīng)被廣泛證實，此外，JNK 可活化可能通過活化肝星狀細胞引起肝纖維化[17]。Yang 等[18]的研究結(jié)果顯示阻斷JNK 途徑可抑制成纖維細胞樣滑膜細胞的活性，并抑制遷移和侵襲。Shingyochi 等[19]的研究結(jié)果也顯示了激活JNK 通路會促進成纖維細胞的增殖和遷移。這提示LEF 可能通過miR-499a 促進JNK 蛋白的磷酸化，從而促進肺成纖維細胞的活化和增殖，并促進細胞向肌纖維細胞轉(zhuǎn)化和ECM 的累積，進而引起肺纖維化。

綜上所述，LEF 可能通過抑制肺成纖維細胞中miR-449a 的表達激活JNK 途徑，促進α-SMA的表達和ECM 的累積，從而誘導成纖維細胞的活化和增殖，抑制其凋亡，從而引起肺纖維化。但是，關于LEF 調(diào)節(jié)miR-449a 的機制和miR-449a 在JNK 途徑中的作用仍需要進一步的研究。