HPLC法快速測(cè)定艾附暖宮丸中α-香附酮的含量

★ 王麗瓊（樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 四川 樂(lè)山 614000）

艾附暖宮丸主治理氣補(bǔ)血，暖宮調(diào)經(jīng)。用于子宮虛寒，月經(jīng)量少，經(jīng)期腹痛，腰酸帶下，用于子宮內(nèi)膜異位癥和宮內(nèi)感染［1-2］。由艾葉、醋香附、當(dāng)歸、制吳茱萸、川芎等十味藥材制成，有小蜜丸和大蜜丸兩種規(guī)格。醋香附為臣藥，處方用量最大，香附為莎草科莎草屬植物莎草的干燥根莖，主要成分為揮發(fā)油，α-香附酮是主要有效成分之一，可作為艾附暖宮丸的特征性成分。《中國(guó)藥典》2015年版一部中“艾附暖宮丸”［3］項(xiàng)下只采用α-香附酮對(duì)照品薄層鑒別，含量測(cè)定項(xiàng)下只控制了芍藥苷，比較單一，不符合中藥多指標(biāo)控制的要求。參閱相關(guān)文獻(xiàn)，曹玫等對(duì)不同產(chǎn)地香附中總黃酮含量進(jìn)行比較研究［4］，趙昕等采用α-香附酮定性鑒別香蘇胃痛膠囊中香附藥材［5］，李道明等采用HPLC法測(cè)定舒筋活血片中山奈素、4-甲氧基水楊醛和α-香附酮的含量［6］，有采用HPLC法測(cè)定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸［7］和吳茱萸次堿［8］的含量，還有采用離子色譜法測(cè)定艾附暖宮丸中9種無(wú)機(jī)陰離子的含量［9］，還有采用 GC 法測(cè)定 α- 香附酮的含量［10］，未見(jiàn)HPLC法控制艾附暖宮丸中α-香附酮的含量。為了有效控制含香附制劑質(zhì)量，本文采用超聲直接提取，HPLC法快速測(cè)定艾附暖宮丸中α-香附酮的含量，為更全面控制其質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent）；XS205梅特勒-托利多電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多，十萬(wàn)分之一）；CQ-100B超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試藥 α-香附酮對(duì)照品（110748-201513，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.7%）；艾附暖宮丸（市售，A廠，批號(hào)分別為20181203，20190101，20180101（大蜜丸）；B廠，批號(hào)為12181001）；甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；磷酸（分析純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）；試驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：waters XTerra C18（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)：249nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品α-香附酮23.29 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇使溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備溶液；精密吸取對(duì)照品貯備溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品小蜜丸，粉碎，取約3 g，精密稱(chēng)定；或取重量差異項(xiàng)下的大蜜丸，剪碎，取約3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白試驗(yàn) 按處方比例制備不含醋香附的陰性樣品，并按“2.3”方法制備陰性樣品溶液。取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時(shí)間和紫外光譜圖定性，液相色譜圖見(jiàn)圖1，α-香附酮與相鄰峰分離度大于1.5，陰性樣品溶液在對(duì)照品溶液α-香附酮峰位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，其他共存成分無(wú)干擾。

圖1 對(duì)照品溶液（A）、艾附暖宮丸（B）和陰性樣品（C）色譜圖

2.5 線性與范圍 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性第一點(diǎn)溶液；分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液0.5、1、2、4、8 mL，分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得線性系列濃度溶液；照“2.1”色譜條件測(cè)定峰面積。以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=33.880C+ 0.619，r= 1.0000。表明α-香附酮在0.93～74.30μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD為0.9%（n= 6），表明精密度符合要求。

2.7 重復(fù)性 取批號(hào)為20181203的艾附暖宮丸，照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果艾附暖宮丸中α-香附酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.156mg/g，RSD（n=6）為1.7%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率 取批號(hào)為20181203的艾附暖宮丸粉末約1.5g，共6份，精密稱(chēng)定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備液1 mL，按“2.3”方法提取，照“2.1”色譜條件測(cè)定6份供試品溶液的α-香附酮含量，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。α-香附酮平均加樣回收率為98.9%，RSD 1.1%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 溶液的穩(wěn)定性 精密吸取“2.7”項(xiàng)下的艾附暖宮丸溶液，室溫，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果艾附暖宮丸中RSD（n=7）為0.4%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.10 含量測(cè)定 精密稱(chēng)取4批艾附暖宮丸樣品，每批平行測(cè)定3份，照“2.3”方法制備樣品溶液，照“2.1”色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，α-香附酮在249 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且其他成分在此無(wú)干擾，所以選擇249 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)中比較了浸泡+超聲處理、直接超聲處理對(duì)α-香附酮提取效果的影響，兩者結(jié)果相似，最后采用較簡(jiǎn)便的直接超聲提取方法。

醋香附是艾附暖宮丸的主要成分之一，其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)其質(zhì)量指標(biāo)α-香附酮含量進(jìn)行控制。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定其α-香附酮的含量，通過(guò)對(duì)4個(gè)批次樣品共2個(gè)規(guī)格（小蜜丸和大蜜丸）進(jìn)行檢驗(yàn)，表明方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單快速，可作為艾附暖宮丸的含量測(cè)定方法。本文涉及的4個(gè)批次艾附暖宮丸中，α-香附酮的含量為0.087～0.157 mg/g，質(zhì)量穩(wěn)定，可考慮收集更多的樣本，制定控制艾附暖宮丸中α-香附酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。