黃蜀葵和秋葵不同部位黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定方法研究

★ 李婧 劉玉翠 高宇丹 范如玉 肖井雷*（.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長(zhǎng)春 307；.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 長(zhǎng)春 300）

黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.） Medic.和秋葵Abelmoschus esculentu（L.）Moench均為錦葵科秋葵屬一年生或多年生草本植物，黃蜀葵花具有清利濕熱、消腫解毒的作用［1］。而黃蜀葵種子具有清熱解毒、涼血消腫的功效，可用于淋證、水腫、便秘、乳汁不通、癰腫、跌打損傷的治療，為“催生及利小便之要藥”［2］。國(guó)外研究種子油有多種醫(yī)療保健作用，但國(guó)內(nèi)對(duì)其開(kāi)發(fā)利用報(bào)道較少［3］。秋葵是一種保健蔬菜，其中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、游離氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生物堿等多種生物活性成分［4-5］。具有抗疲勞、健胃保肝、能減少肺損傷、提高機(jī)體免疫力、抗癌作用、利尿、增強(qiáng)血管擴(kuò)張力、保護(hù)心臟等保健功能［6］。

據(jù)報(bào)道黃蜀葵和秋葵中主要含有黃酮類(lèi)成分，且部分成分尚未建立適宜的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃蜀葵花、種子，秋葵花、種子、果實(shí)中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，為黃蜀葵、秋葵的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究提供了理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-2030高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；FA1004B十萬(wàn)分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；JA2603B萬(wàn)分之一天平（上海天美天平儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，CAS：48236-0）；槲皮素對(duì)照品（北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，CAS：117-39-5）；楊梅素（北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，CAS：529-44-2）。甲醇（分析純，北京化工廠(chǎng)）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；磷酸（分析純，天津市福晨化工試劑廠(chǎng)）；水為純凈水。

1.3 藥材 樣品采自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)七星百草園。經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷副教授鑒定：黃蜀葵花、種子為錦葵科黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic.的干燥花和種子；秋葵花、種子、果實(shí)為錦葵科秋葵Abelmoschus esculentu（L.） Moench的干燥花、種子和果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流速 在色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫30℃條件下，考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)黃酮類(lèi)成分分離的影響。結(jié)果表明，流速為1.0 mL/min時(shí)，系統(tǒng)壓力適中，靈敏度高，分離度好。故該方法確定流速為1.0 mL/min。

2.1.2 流動(dòng)相 在色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫30℃、流速為1.0 mL/min條件下，考察了不同梯度的乙腈-0.4%磷酸溶液（23∶77、25∶75、28∶72、30∶70）對(duì)黃酮類(lèi)成分分離的影響。結(jié)果表明，黃蜀葵花采用乙腈-0.4%磷酸溶液（28∶72）洗脫，而黃蜀葵種子、秋葵采用乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫（0～30 min 23∶77；30～35 min 27：73）

上述研究確定黃蜀葵花的色譜條件（Ⅰ）為：色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸溶液（28∶72）；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；流速1.0mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量4 μL。黃蜀葵種子、秋葵的色譜條件（Ⅱ）為：色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸溶液；梯度洗脫（0～30 min 23∶77；30～35 min 27∶73）流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫30℃ ；進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 混合對(duì)照品的制備 精密稱(chēng)定金絲桃苷、楊梅素、槲皮素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg、0.05 mg、0.05 mg的混合溶液（Ⅰ），含0.07 mg、0.03 mg、0.002 5 mg的混合溶液（Ⅱ），即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取供試品各1.000 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min（250 W，30 KHz），放冷，稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失重量并搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液Ⅰ4，8，12，16，20 μL，按色譜條件Ⅰ進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。金絲桃苷，楊梅素、槲皮素的回歸方程分別為Y=266 476X+86 820，Y=13 210X+1 146.9，Y=18 188X-1 296.1；相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 8、0.999 9、0.999 9 ；線(xiàn)性范圍分別為 0.4～2.0 μg，0.2 ～1.0 μg，0.2～1.0 μg。

取混合對(duì)照品溶液Ⅱ2，4，6，8，10 μL，按色譜條件Ⅱ進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。金絲桃苷，楊梅素、槲皮素的回歸方程分別為Y=211 710X-371.4，Y=140 332X+4 841.3，Y=10 708X-1 173.4；相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 7、0.999 6、0.999 5；線(xiàn)性范圍分別為 0.14～0.7 μg，0.06～0.3 μg，0.005～0.025 μg。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品Ⅰ4 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算金絲桃苷、楊梅素、槲皮素RSD分別為1.05%，1.16%，1.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取黃蜀葵花供試品4 μL，室溫下分別放置0，2，4，8，12，24 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算黃蜀葵花中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的RSD（n=6）分別為1.7%、1.5%、1.1%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取1.000 g黃蜀葵花干燥粉末6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件Ⅰ下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的RSD（n=6）分別為1.6%、1.7%、1.9%，，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取黃蜀葵花供試品粉末6份，分別精密加入一定量3種對(duì)照品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件Ⅰ下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD。結(jié)果金絲桃苷、楊梅素和槲皮素的平均回收率分別為101.36%、97.89%和99.63%，RSD分別為1.39%、1.18%和1.54%，表明該方法加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

2.5 樣品測(cè)定 分別精密吸取各供試品溶液Ⅰ（4 μL）、Ⅱ（10 μL），注入高效液相色譜儀，測(cè)定各成分含量。HPLC圖見(jiàn)圖1。

測(cè)定結(jié)果顯示，金絲桃苷含量：黃蜀葵花（12.7 mg/g）＞秋葵花（0.052 6 mg/g）＞黃蜀葵種子（0.005 2 mg/g）＞秋葵果實(shí)（0.004 1 mg/g）＞秋葵種子（0.002 5 mg/g）；楊梅素含量：僅存于黃蜀葵花中（0.41 mg/g）；槲皮素含量：黃蜀葵花（0.197 mg/g）＞秋葵花（0.015 mg/g）＞黃蜀葵種子（0.007 2mg/g）＞秋葵種子（0.005 1 mg/g）。本研究表明三種黃酮類(lèi)成分在黃蜀葵和秋葵不同部位的含量存在明顯差異，以花中三種成分含量最多，其次是種子，最后為果實(shí)。本次研究為黃蜀葵和秋葵高效資源化分析利用提供了依據(jù)。

圖1 各樣品溶液HPLC圖

3 小結(jié)與討論

（1）本方法首先參照2015版《中國(guó)藥典》中測(cè)定金絲桃苷含量的色譜條件進(jìn)行三種成分的洗脫，即乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），結(jié)果顯示金絲桃苷的峰且出峰時(shí)間在42min左右，楊梅素出峰時(shí)間在60 min左右，出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)［7-8］。進(jìn)而更改流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%磷酸溶液20∶80，出峰時(shí)間雖縮短但拖尾嚴(yán)重；為消除拖尾現(xiàn)象又將0.1%的磷酸溶液改成0.4%磷酸溶液，并依次用不同比例的乙腈-0.4%磷酸溶液摸索出最佳色譜條件。

（2）采用HPLC法單獨(dú)測(cè)定金絲桃苷、槲皮素、楊梅素含量的報(bào)道較多［9-11］，但同時(shí)測(cè)定黃蜀葵和秋葵中三種成分含量的方法卻未見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)優(yōu)化色譜條件，建立了同時(shí)測(cè)定金絲桃苷、槲皮素、楊梅素含量的方法，且該法結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠?qū)S蜀葵和秋葵不同部位中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的含量進(jìn)行定量分析，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。