白介素6、程序性死亡因子配體在胃食管反流病中的作用

阿麗葉古麗·艾皮熱 買買提·依斯熱依力 葉勒丹·馬漢 克力木·阿不都熱依木

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是一種以胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管為特點，反酸、燒心、噯氣等癥狀為典型表現(xiàn)的常見消化系統(tǒng)疾病[1]。病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與抗反流防御機(jī)制的削弱、食管黏膜屏障的完整性破壞及胃十二指腸內(nèi)容物反流對食管黏膜的剌激有關(guān)。而最新研究證實，人類GERD的發(fā)生并不是反流物直接“酸蝕”的結(jié)果，而是通過刺激細(xì)胞因子調(diào)控的炎癥反應(yīng)，并最終引起食管損傷[2]。在此之前，一項動物試驗研究也發(fā)現(xiàn)，反流性食管炎并不從食管粘膜表面的化學(xué)性損傷開始，而是從粘膜下層的淋巴細(xì)胞浸潤開始，逐漸發(fā)展到粘膜表面的損傷[3]。體外培養(yǎng)試驗也提示，輕度暴露于酸化的膽汁酸鹽溶液中，對人類食管上皮細(xì)胞并無直接殺傷作用，而只是刺激其分泌炎癥因子。在本課題組前期的組織學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管黏膜上皮均有不同程度的增厚，炎細(xì)胞數(shù)目增加明顯，而且隨著食管炎癥加深，炎癥因子白介素6（interleukin6，IL?6）表達(dá)水平升高[4]。

程序性死亡因子配體1（Programmed death?ligand 1，PD?L1）是B7家族共刺激分子的一員，其在免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的功能和多種炎性細(xì)胞因子的分泌。而炎癥因子能刺激引起PD?L1的表達(dá)增高。故在本研究中，通過在體外建立食管上皮細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)體系，用胃食管反流物（膽汁酸和胰酶的混合物）刺激誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，觀察PD?L1的表達(dá)水平，探討IL?6、PD?L1在胃食管反流病發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、主要材料

SD大鼠購自湖北省疾控中心，6～8周；大鼠食管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基、大鼠脾臟淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CD4單克隆抗體、FITC均購自eBioscience；胎牛血清、青霉素?鏈霉素均購自GIBCO；胰蛋白酶購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鵝去氧膽酸購自sigma公司；大鼠IL?6 ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

二、食管上皮細(xì)胞的分離

取大鼠頸椎脫臼處死后，75%酒精浸泡5 min，移至超凈工作臺內(nèi)，仰臥固定大鼠；剪開頸部、胸部皮膚，打開胸腔，取出食管，用顯微鑷剝離食管外層肌層，留取內(nèi)層粘膜層組織，縱向剖開粘膜層，放入含雙抗的PBS中，反復(fù)沖洗5次。將食管粘膜層放入離心管，加入消化液浸泡食管，37℃孵育，1 h；取出離心管，用吸管反復(fù)吹打組織，消化液經(jīng)200目過濾，收集濾液，經(jīng)100 g離心5 min，棄上清，保留細(xì)胞沉淀。

三、細(xì)胞培養(yǎng)方法

用大鼠食管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于鼠尾膠原預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)基，以后每3天換液1次。以免疫熒光CK?18鑒定。

四、脾臟淋巴細(xì)胞的分離方法

大鼠脾臟研磨用200目篩網(wǎng)過篩后，1500 rpm離心5 min，細(xì)胞沉淀用紅細(xì)胞裂解液裂解去除紅細(xì)胞，獲得的淋巴細(xì)胞用PBS重懸，用于后續(xù)檢測。CD4+T細(xì)胞檢測取分離后的細(xì)胞，計數(shù)；100 μl 0.5%牛血清白蛋白的PBS含重懸至1×106個待測細(xì)胞；2000 rpm離心3 min，棄上清液，100 μl PBS（含0.5%牛血清白蛋白）沖洗2次；待測管加入0.5 μg CD4抗體，4℃避光孵育30 min；2000 rpm離心3 min，棄上清液，100 μl PBS（含0.5%牛血清白蛋白）沖洗2次；以含0.5%牛血清白蛋白的0.5 ml PBS重懸后流式細(xì)胞儀檢測分析。

五、細(xì)胞處理分組

A組為大鼠食管上皮細(xì)胞組，常規(guī)培養(yǎng)，無共培；B組為CD4+T細(xì)胞組，常規(guī)培養(yǎng)，無共培；C組為大鼠食管上皮細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)組；取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的大鼠食管上皮細(xì)胞，以5×105個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，分離得到的大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，以15×105個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。三組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h，不予任何的刺激，測定其基礎(chǔ)狀態(tài)下IL?6、PD?L1的表達(dá)水平。三組先用鵝去氧膽酸（濃度為200 nmol/L）聯(lián)合胰酶（活性為10 U/ml）共處理12 h后，再用鹽酸溶液將培養(yǎng)基pH分別調(diào)節(jié)為4、5、6，培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后分別收集下室細(xì)胞和上下室上清待測。

六、檢測方法

1.IL?6：采用ELISA法檢測。OD值測定，應(yīng)用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度，繪制IL?6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出IL?6的濃度（pg/ml）。

2.PD?L1：采用Western blot檢測各組中PD?L1的表達(dá)水平。取上述細(xì)胞懸液離心后棄上清液，37℃消化。取細(xì)胞懸液洗滌后裂解細(xì)胞，于4℃下12000 rpm離心5 min，取上清液用白蛋白含量檢測試劑盒測定樣品蛋白濃度。取上清液與上樣緩沖液混合（體積比按照4:1混合）后100℃水浴10 min，室溫冷卻，每孔取40 μg樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，封閉2 h。以α?tubulin作為內(nèi)參，加入一抗（稀釋比例1∶2000）4℃孵育過夜，加入二抗（稀釋比例1∶50000）室溫?fù)u床孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光和與X線片定影。使用BandScan分析膠片灰度值，以PD?L1與α?tubulin灰度值比值表示PD?L1的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

七、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示?？傮w比較采用重復(fù)測量方差分析，對于滿足球形檢驗數(shù)據(jù)無需校正，如需校正采用Greenhouse?Geisser校正。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、體外上皮細(xì)胞與CD4+細(xì)胞分離及共培養(yǎng)體系的建立

在體外建立上皮細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)體系是研究免疫細(xì)胞對上皮細(xì)胞功能影響以及上皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的一種有效手段。本研究成功分離出了大鼠上皮細(xì)胞及CD4+細(xì)胞，并成功建立了上皮細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)體系。見圖1和圖2。

圖1 免疫熒光鑒定食管上皮細(xì)胞（400X）

圖2 流式細(xì)胞儀的鑒定結(jié)果，A：CD4+FITC，B：陰性對照1，C：陰性對照2

二、各細(xì)胞組中IL?6的表達(dá)

食管上皮細(xì)胞組（A組），CD4+T細(xì)胞組（B組），及食管上皮細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培體系組（C組）基礎(chǔ)狀態(tài)下（無任何處理，原代培養(yǎng)24 h），及用鵝去氧膽酸和胰酶等生物化學(xué)物質(zhì)處理后，用ELISA法檢測其IL?6的表達(dá)水平。球性檢驗，χ2=3.046（P＞0.05），說明數(shù)據(jù)符合球形對稱，不需進(jìn)行校正。發(fā)現(xiàn)隨著pH濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長，IL?6在各細(xì)胞中的表達(dá)量增高，其中IL?6在C組的表達(dá)量最高，表明酸可能刺激免疫細(xì)胞增加IL?6的表達(dá)。見表1和表2。

表1 IL?6在不同處理條件的表達(dá)水平

表2 IL?6重復(fù)測量方差分析結(jié)果

三、各組細(xì)胞中PD?L1的表達(dá)

球性檢驗，χ2=75.857（P＜0.05），說明數(shù)據(jù)不符合球形對稱，需進(jìn)行校正，采用Greenhouse & Geisser方法進(jìn)行校正后，整理重復(fù)測量資料的方差分析。隨著pH濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長，PD?L1在各細(xì)胞中的表達(dá)量增高，其中PD?L1在C組的表達(dá)量最高（見圖3、表3?4）。

表4 PD?L1重復(fù)測量方差分析結(jié)果

討 論

GERD是一種以胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管為特點，反酸、燒心、噯氣等癥狀為典型表現(xiàn)的常見消化系統(tǒng)疾病[1]。當(dāng)前，全世界約有10%～40%的成年人患有GERD。由于地域、人種、飲食等因素的差異性，GERD在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有所不同[5]。我國GERD患病率不僅存在性別差異、職業(yè)差異，還呈現(xiàn)西高東低的趨勢，其中以新疆地區(qū)尤為顯著，甚至有報道其患病率是我國其他地區(qū)的5倍之多，特別是維吾爾族中，該病患病率高達(dá)25%[6]。GERD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與抗反流防御機(jī)制的削弱、食管黏膜屏障的完整性破壞及胃十二指腸內(nèi)容物反流對食管黏膜的刺激有關(guān)。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為是食管黏膜受到胃和十二指腸內(nèi)容物包括食物、胃酸、消化酶等物質(zhì)的刺激而出現(xiàn)的一系列改變，是由于食管上皮細(xì)胞受到化學(xué)性腐蝕作用而發(fā)生的性狀改變[7]。在酸性條件下，反流出來的胃蛋白酶被活化，導(dǎo)致食管上皮表面的眾多連接蛋白和細(xì)胞受到損傷。但最新研究發(fā)現(xiàn)胃酸、胃蛋白酶及膽汁酸鹽等反流物并不能直接對食管構(gòu)成損傷，而是通過刺激細(xì)胞因子調(diào)控的炎癥反應(yīng)，并最終引起食管損傷[2]。與此同時，隨著越來越多的試驗研究開始關(guān)注GERD患者體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的變化，特別是炎癥因子、白介素以及氧化應(yīng)激反應(yīng)與GERD的關(guān)系正日漸明朗。有研究顯示，GERD暴露能導(dǎo)致正常食管上皮細(xì)胞中IL?6、IL?8和環(huán)氧化酶2的釋放增加[8?9]。其中，食管粘膜內(nèi)白細(xì)胞介素1β（interleukin1β，IL?1β）、白細(xì)胞介素8（interleukin8，IL?8）、白細(xì)胞介素10（interleukin10，IL?10）、IL?6、血小板活化因子（Platelet Activating Factor，PAF）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）等促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的增加被證實與GERD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10?11]。

在體外建立上皮細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)體系是研究免疫細(xì)胞對上皮細(xì)胞功能影響以及上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的一種有效手段。本研究中，發(fā)現(xiàn)單獨培養(yǎng)的大鼠食管上皮細(xì)胞低劑量IL?6，且大鼠食管上皮細(xì)胞+CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后IL?6的表達(dá)量更高，并且隨著pH濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長，IL?6的表達(dá)量會更高，結(jié)果說明胃食管反流物能導(dǎo)致正常食管上皮細(xì)胞中IL?6的釋放增加，此與先前研究相符[8?9]。同時說明，免疫細(xì)胞也影響上皮細(xì)胞，導(dǎo)致上皮細(xì)胞中炎癥因子IL?6分泌的增加。

炎癥因子持續(xù)高表達(dá)可能引發(fā)食管病變，并造成GERD相關(guān)癥狀及并發(fā)癥的出現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠食管上皮細(xì)胞+CD4+T細(xì)胞共培后，IL?6表達(dá)量增高的同時，PD?L1的表達(dá)水平也增加，說明炎癥因子IL?6可能誘導(dǎo)PD?L1的表達(dá)。PD?L1參與PD?1/PD?L1信號通路。PD?1/PD?L1是一條在免疫炎性反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用的負(fù)性調(diào)節(jié)信號通路，參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的功能和多種細(xì)胞因子的分泌。一些常見的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2、IL?6、白細(xì)胞介素15等受體家族和干擾素都能增強(qiáng)PD?1的表達(dá)，PD?L1、PD?L2和受體PD?1結(jié)合后，趨化含SH2功能域磷酸酶1和2，通過去磷酸化削弱相應(yīng)信號分子作用，抑制T細(xì)胞增殖活化并使其喪失免疫功能[12]。IL?6 是 Janus激酶(JAK)/轉(zhuǎn)錄激活因子 3(STAT3)信號通路的重要的炎性因子，其傳導(dǎo)也依賴于STAT3的參與。Wolfle等[13]研究發(fā)現(xiàn)刺激IL?6的表達(dá)后可導(dǎo)致STAT3的表達(dá)上調(diào)，繼而引起抗原提成細(xì)胞上的PD?L1的表達(dá)，并且證實STAT3可結(jié)合在PD?L1的啟動子區(qū)域，從而調(diào)控PD?L1的表達(dá)。此外，Loos等[14]采用免疫組織化學(xué)對101例Barrett食管癌中PD?L1的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PD?L1在Barrett食管腫瘤組織中表達(dá)，且與腫瘤TNM分期相關(guān)，腫瘤組織中表達(dá)PD?L1的患者中位生存期是36個月，而不表達(dá)者中位生存期為136個月[15]。

綜上所述，IL?6、PD?L1可能參與了由細(xì)胞因子調(diào)控的炎癥反應(yīng)機(jī)制最終引起食管損傷，因此減少局部T淋巴細(xì)胞浸潤并控制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，可能通過阻止食管粘膜發(fā)生的一系列組織學(xué)變化，進(jìn)而治愈GERD或延緩其進(jìn)展。本研究只探討了胃食管反流物對炎性反應(yīng)的影響以及炎性環(huán)境對PD?L1的表達(dá)水平的影響，后期將進(jìn)一步研究細(xì)胞因子是如何通過信號通路影響PD?L1的表達(dá)，以及它們之間的相互作用關(guān)系。