中性鞘磷脂酶2對缺氧預處理間充質干細胞來源的外泌體生物學特性的影響

盧凱 王香云 羅玉寅

313000 湖州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科(盧凱、羅玉寅)，神經(jīng)內(nèi)科(王香云)

研究發(fā)現(xiàn)，干細胞治療可改善心肌梗死后心功能，可能通過促進梗死周邊血管再生、減少心肌細胞死亡來發(fā)揮作用[1]。其中，骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其易于獲得，免疫排斥較弱，已被廣泛用于研究[2]。但干細胞移植后存在凋亡快、歸巢率低等弊端，影響其療效。近年研究發(fā)現(xiàn)，干細胞可以分泌外泌體(exosome)，它是一種有膜的納米囊泡，直徑30～100 nm左右。外泌體的分泌及其對受體細胞的生物學作用可能在MSCs的旁分泌中扮演重要角色，其可能成為替代干細胞用于治療心肌梗死的新型生物制劑。外泌體可以減輕組織損傷、提高組織修復[3-4]，這可能與它的內(nèi)含物有關。有報道顯示，外泌體包含如細胞因子、蛋白、脂質、mRNA、微小RNA(microRNA，miR)等多種細胞成分[5-8]。外泌體中有益成分越多其生物學作用可能越好，但其內(nèi)容物的分泌方式目前尚未明確。中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2)參與外泌體的分泌過程，但缺氧條件下其對外泌體的影響尚未見報道，為此本研究首次探討缺氧條件下外泌體內(nèi)容物分泌的機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器與試劑

低溫超速離心機(美國，貝克曼)；熒光定量PCR儀(美國，ABI)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Corning)；胎牛血清(普飛生物)；Matri-gel(BD)；RNA提取：TRIzol(Life Technology)；GW4869(美國，Sigma-Aldrich)。

1.2 骨髓MSCs的培養(yǎng)和鑒定

取6周齡C57BL/6小鼠下肢長骨骨髓，采用全骨髓培養(yǎng)，傳代至第3～4代的小鼠MSCs，采用流式細胞術鑒定細胞表型，包括CD31、CD29、CD34和CD44。

1.3 骨髓MSCs的缺氧預處理

以第3～4代小鼠MSCs作為缺氧預處理對象，分為缺氧預處理組和常氧組，計數(shù)相同數(shù)量的細胞/培養(yǎng)皿，待細胞充分貼壁12 h后，觀察細胞狀態(tài)，確認細胞狀態(tài)良好后去除細胞上清，更換為無血清培養(yǎng)基，將缺氧預處理組放置于缺氧培養(yǎng)箱(0.5% O2，5% CO2)48 h，常氧組置于常氧下(21% O2，5% CO2)48 h。抑制nSMase2采用在缺氧預處理組中加入濃度為10 μM GW4869的培養(yǎng)基。

1.4 骨髓MSCs來源的外泌體提取和鑒定

同時收集缺氧預處理組和常氧組培養(yǎng)48 h后條件培養(yǎng)基(細胞上清)，通過超速離心法獲得外泌體。具體步驟：細胞上清在4℃下多步驟離心：300 g離心10 min、2 000g離心10 min、12 000 g離心30 min，分別去除死細胞、細胞碎片和細胞微泡；收集上清后再使用100 kD超濾管濃縮細胞上清，4 000 g離心15 min；再次收集上清并在超速離心機上4℃ 100 000 g離心1 h，觀察沉淀，輕輕棄去上清，用PBS重懸沉淀；之后繼續(xù)以相同條件離心1 h；獲得的最終沉淀用50～100 μl PBS重懸，凍存于-80℃待用及后續(xù)鑒定、實驗。通過蛋白質印跡實驗(Western Blot)檢測外泌體表面標記，如CD63和Alix等。通過電鏡觀察外泌體的典型形態(tài)和粒徑大小，并用Zetaszier Nano-S90儀器再次驗證外泌體的粒徑大小。

1.5 小鼠心肌梗死模型的建立和心功能的測定

參照文獻[9]，采用8周齡雄性C57BL/6小鼠，開胸后結扎冠狀動脈左前降支，建立心肌梗死模型。實驗分為4組：對照組(Sham組)，缺氧預處理來源外泌體組(ExoH組)，常氧來源外泌體組(ExoN組)和PBS組。每組實驗小鼠20只，實驗按雙盲進行，結扎后即刻于周圍心肌組織中注射外泌體(約收集自2×107MSCs)，PBS組注射相同劑量的PBS，分3點注射，10 μl/每點。于心肌梗死術后當天(0 d)、3 d、7 d、14 d和28 d，采用二維M型超聲心動圖對各組小鼠的心功能進行評價。

1.6 組織學分析

實驗按雙盲進行，收集心肌梗死后28 d各組小鼠的心臟，用甲醛固定、石蠟包埋，用于后續(xù)病理切片。梗死面積評估：以結扎線以下500 μm，對后續(xù)的組織切片用Masson’s trichrome染色來顯示心肌梗死面積，并用Image-pro Plus軟件分析每個心臟切面的梗死區(qū)域及整個左心室面積，將梗死區(qū)域面積除以整個左心室面積即可得出心肌梗死百分比。

1.7 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs)管腔形成實驗

在鋪有BD matrigel的96孔板上接種相同細胞數(shù)的HUVECSs，處理分為3組：ExoH組、ExoN組和DMEM/F12組。每隔1～2 h在相差顯微鏡下觀察管腔形成的情況并拍照記錄，最后統(tǒng)計管腔長度。

1.8 H9c2心肌細胞凋亡實驗

H9c2凋亡實驗(TUNEL實驗)在6孔板上進行，將H9c2細胞以1×105/孔接種，根據(jù)實驗分組處理24 h，根據(jù)TUNEL試劑盒染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞數(shù)，最后計算凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨髓MSCs來源的外泌體鑒定

傳代至第4代的小鼠MSCs通過流式細胞術鑒定，其結果為CD29、CD44陽性，CD31、CD34陰性。在電鏡下觀察到的外泌體形態(tài)類似杯狀結構，直徑約100 nm(圖1A)；Western Blot檢測顯示，外泌體表面相關標記物CD63、Alix均陽性(圖1B)；此外，通過動態(tài)光散射(DLS)分析外泌體的粒徑大小，直徑亦在100 nm左右，與電鏡結果基本相同。

A：電鏡下顯示外泌體形態(tài)類似杯狀結構(箭頭所示)；B：Western Blot檢測結果

2.2 缺氧預處理的骨髓MSCs來源的外泌體可保護小鼠心肌梗死后心功能

在小鼠心肌梗死后7、14和28 d，ExoH組小鼠心功能較ExoN組、PBS組均有明顯改善，其中28 d時ExoH組小鼠射血分數(shù)顯著高于ExoN組(44.12%±8.12%比20.73±7.32%，n=20，t=11.95，P<0.05，圖2A)，并且28 d組織學分析表明ExoH能顯著減少心肌梗死后瘢痕面積(各組梗死面積百分比：PBS組55.42%±4.32%，ExoN組44.62%±4.21%，ExoH組34.15%±5.32%，n=8，P<0.05，圖2B)。

A：心肌梗死后各組小鼠心功能比較(n=20)，與ExoN組比較，aP<0.05，與PBS組比較，bP<0.01；B：心臟組織Masson’s trichrome染色結果顯示，ExoH能顯著減少心肌梗死后瘢痕面積

2.3 缺氧增加nSMase2的表達可能是由缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)調(diào)控的

與常氧下比較，缺氧預處理后，MSCs中的nSMase2的表達明顯升高，nSMase2蛋白水平升高約1.5倍，而mRNA水平升高約5.4倍，n=10，P<0.05(圖3A)。我們已知Hif-1α可在缺氧狀態(tài)下被激活并參與重要調(diào)控。為進一步研究nSMase2與Hif-1α的關系，我們采用DMOG，一種HIF-1α羥化酶抑制劑，避免Hif-1α在常氧下分解。研究發(fā)現(xiàn)，加入DMOG后的MSCs中nSMase2和HIF-1α表達一致性增加，nSMase2和HIF-1α分別升高2.1倍和2.5倍，n=8，P<0.05(圖3B)，因此考慮nSMase2可能是由HIF-1α調(diào)控的。

A：缺氧增加nSMase2的表達；B：DMOG增加HIF-1α和nSMase2的表達

2.4 nSMase2抑制劑GW4869削弱ExoH的促血管新生能力

為進一步明確nSMase2對ExoH的影響，研究引入了GW4869，一種nSMase2抑制劑，同時提取缺氧預處理下加入GW4869的外泌體(ExoH+GW)。研究發(fā)現(xiàn)，與ExoN比較，ExoH具有更好的促血管新生能力，但加入GW4869后其作用明顯減弱(圖4)。

A：HUVECs管腔形成試驗顯示，ExoH對管腔形成的作用顯著；B：HUVECs管腔形成試驗分析顯示，aP<0.05，bP<0.05，cP<0.01(n=10)

2.5 nSMase2抑制劑GW4869削弱ExoH的心肌細胞保護能力

為進一步探討nSMase2對ExoH心肌細胞抗凋亡能力的影響，我們對比了ExoN、ExoH和ExoH+GW在H2O2誘導的心肌細胞凋亡實驗中的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與ExoN比較，ExoH具有更好的心肌細胞抗凋亡作用，但ExoH+GW的抗凋亡作用有所減弱，各組凋亡細胞百分比：Medium組30.21%±10.25%，ExoN組19.56%±6.78%，ExoH組12.34%±4.32%，ExoH+GW組24.56%±9.78%，n=8，P<0.05(圖5)。

A：TUNNEL染色結果，黃色箭頭所示即凋亡的心肌細胞；B：Cleaved-caspase 3蛋白印跡檢測結果，ExoH組的凋亡明顯減少

2.6 nSMase2可能參與調(diào)控ExoH中有益因子的含量

miR-210是一種缺氧調(diào)控的miRNA，由HIF-1α特異性調(diào)控[10]，具有促血管新生[11-13]、抗凋亡[12，14]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預處理后miR-210在細胞上清及外泌體的表達均顯著上升，分別約為4.8倍和4.5倍，但加入GW4869后明顯降低，分別降低至約0.48倍和0.45倍(n=8，P<0.05)。由此推測，nSMase2調(diào)控miR-210經(jīng)外泌體的轉運。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)外泌體能改善心肌梗死后心功能，并且ExoH組心肌梗死后心功能改善明顯。同時發(fā)現(xiàn)，缺氧預處理的MSCs中nSMase2的表達升高，其可能是由HIF-1α調(diào)控的。并且還發(fā)現(xiàn)，nSMase2的升高與ExoH的生物學作用存在一定的相關性，綜上可能存在HIF-1α-nSMase2-Exo生物學作用改變的調(diào)控信號通路。

最近研究發(fā)現(xiàn)，nSMase2可能參與外泌體的形成、釋放及miRNA、mRNA、蛋白等經(jīng)外泌體包裝及轉運的過程[13，15]，但是否對缺氧預處理來源的外泌體有影響未見報道。為進一步探討nSMase2的作用，我們比較了缺氧調(diào)控的miRNA的改變，如miR-210，其是一種缺氧調(diào)控的miRNA，在缺氧狀態(tài)下的細胞或組織中廣泛表達[16-17]，具有可以調(diào)節(jié)細胞周期[18-19]、促血管再生、有利于DNA損傷后修復[20-21]、改善線粒體代謝[22-23]、增強細胞抗凋亡能力等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預處理后MSCs分泌的miR-210在條件上清和外泌體中均顯著上升，但加入GW4869抑制nSMase2后，細胞條件上清和外泌體中miR-210的表達水平均顯著下降。由此推測，nSMase2對ExoH可能通過影響外泌體內(nèi)有益miRNA的含量來發(fā)揮生物學作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)缺氧預處理條件下MSCs中miR-210等有益因子表達升高，同時nSMase2的表達亦提升，其可能是由Hif-1α調(diào)控的。缺氧預處理骨髓MSCs來源的外泌體擁有更好的心臟保護能力，表現(xiàn)在體內(nèi)實驗中改善心肌梗死后小鼠心功能，體外實驗中具有更好的促管腔形成、增加心肌細胞抗凋亡能力等方面。可能的原因是在缺氧預處理條件下，MSCs中miR-210等有益因子的表達增加，同時nSMase2的表達增加有利于miR-210等有益因子經(jīng)外泌體的包裹及釋放來發(fā)揮生物學作用。本研究也證實了缺氧預處理是一種有效、安全的方式，可提升干細胞來源的外泌體對心肌梗死動物模型的生物療效，可為今后用于優(yōu)化外泌體替代治療療效的一種方法，但由于本研究存在一定局限性，樣本量少及檢測的微小RNA相對單一，因此需要進一步研究。

利益沖突：無