不同方法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)及提取工藝的優(yōu)化

肖瀟，周曉玲，陸呈宏，陸春霞，劉開莉，梁貴秋

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市530007）

長(zhǎng)久以來，肉類一直是人們獲取蛋白質(zhì)主要來源，蛋白質(zhì)資源短缺一直是當(dāng)今社會(huì)存在的普遍問題[1]。又由于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)市場(chǎng)中存在著衛(wèi)生、環(huán)境污染、動(dòng)物福利等問題，使得消費(fèi)者對(duì)替代蛋白質(zhì)食品的興趣日益增加。替代蛋白質(zhì)產(chǎn)品主要有3大類：植物蛋白、昆蟲蛋白、人造肉，其中昆蟲蛋白在食物轉(zhuǎn)化率、蛋白含量、生長(zhǎng)速度、環(huán)保、可工業(yè)化生產(chǎn)等方面都優(yōu)于其余兩者[2]。我國(guó)民間食用蠶蛹?xì)v史悠久，蠶蛹也被記載為醫(yī)食同源的昆蟲。蠶蛾作為蠶種生產(chǎn)后的副產(chǎn)物，因繁衍需要累積了大量蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分。蠶蛾蛋白質(zhì)含量高達(dá)45.74%，氨基酸組成豐富[3]，是一種經(jīng)濟(jì)且高質(zhì)量的蛋白資源[4]。此外，蠶蛾蛋白中含有豐富的抗菌肽、防御素、免疫蛋白、凝集素等活性肽物質(zhì)，還可以開發(fā)成藥品、保健品[5]等。

目前提取昆蟲蛋白的主要方法是抽提法，包括堿法、鹽法、有機(jī)溶劑法、Tris-HCl法、酶解法等[6]，其中堿法的蛋白質(zhì)提取率高、成本低，但堿濃度過高時(shí)易產(chǎn)生有害物質(zhì)。鹽法能保留蛋白質(zhì)活性成分，但提取效率較低。有機(jī)溶劑法和Tris-HCl法可以提取與脂質(zhì)緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)，但成本高，易殘留[7]。酶法溫和，能最大保留蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但易產(chǎn)生苦味，而且不適用未脫脂的樣品[8-9]。因此本文選擇鹽法和堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)。

為了避免獲取的雄蠶蛾蛋白殘留有機(jī)溶劑，采用不脫脂的雄蠶蛾干粉為提取對(duì)象。由于未找到雄蠶蛾蛋白質(zhì)組成成分的記載，參照蠶蛹的蛋白質(zhì)組成，由練釗等[10]對(duì)蠶蛹的4種蛋白分離提取所知，蠶蛹的蛋白組成主要為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，其中清蛋白和谷蛋白總體占蠶蛹蛋白質(zhì)量約96%，等電點(diǎn)均在pH 3.9，球蛋白等電點(diǎn)在pH 2.8，而清蛋白的溶解性和持水性最強(qiáng)，谷蛋白的疏水性最強(qiáng)。本研究在此基礎(chǔ)上，根據(jù)蠶蛹蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)鹽法和堿法的試驗(yàn)方案。鹽法提取蛋白試驗(yàn)中，添加的中性鹽離子破壞了蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜，使之鹽析出來，不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不一，析出的先后不同。鹽法中以水為溶劑，主要用于提取清蛋白、球蛋白，利用低濃度NaCl溶液溶解蛋白，高濃度（NH4）2SO4溶液在等電點(diǎn)將目標(biāo)蛋白析出。堿法提取蛋白試驗(yàn)中，NaOH可以破壞蛋白質(zhì)的次級(jí)鍵和氫鍵，使之溶解，主要用于提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白。蠶蛹蛋白中堿性蛋白占19.73%[11]，提取率受堿濃度影響，堿濃度過低蛋白質(zhì)不易溶解，過高使蛋白變性，有臭味。李健[11]用堿法提蠶蛹蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)提取率影響因素的影響程度依次為提取溫度＞液固比＞pH＞提取時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

樣品：選用兩廣二號(hào)家蠶品種的未交配雄蠶蛾，由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站提供；

試劑：Bradford蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NaOH、NaCl、（NH4）2SO4皆為食品級(jí)試劑；14 KD標(biāo)準(zhǔn)等級(jí)透析袋，購(gòu)于上海BBI生命科學(xué)有限公司。

儀器：RT6500全自動(dòng)酶標(biāo)儀，由深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；HC-2518高速離心機(jī)，由安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SHZ-A水浴恒溫振蕩器，由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；DFT-200A手提式中藥高速粉碎機(jī)，由溫嶺大德藥機(jī)有限公司生產(chǎn)；DHJ-9140（A）鼓風(fēng)干燥箱，由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PHSJ-5精密酸度計(jì)，由上海雷磁儀電科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；ESJ-B電子分析天平，由沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn)。

1.2 雄蠶蛾粉末的制備

提取樣品采用兩廣二號(hào)剛羽化1 h的雄蠶蛾，依次經(jīng)過以下程序：清洗，瀝干，60℃烘干2 d，取2 g樣品按照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3-2016直接干燥法測(cè)含水量，重復(fù)3次測(cè)定，去翅膀，打磨成粉，-20℃冷凍儲(chǔ)存。

1.3 蛋白質(zhì)的提取方法

1.3.1 鹽提蛋白質(zhì)方法 按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取0.5 g樣品分別加入10 mL的EP管中，每個(gè)EP管加入1 mL 4℃預(yù)冷的0.1 mol/L Na3PO4溶液。加入5 mL按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的NaCl溶液，再將樣品放置在40℃水浴鍋中4 h，期間時(shí)不時(shí)晃動(dòng)EP管。將鹽溶解的樣品于6℃冷藏沉淀2 h后于10 000 r/min離心15 min，取20 mL上清液于EP管中，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至3.9，用20%（NH4）2SO4進(jìn)行沉淀2 h，將所得的沉淀經(jīng)4 000 r/min離心，轉(zhuǎn)移至5 mL的EP管中，再調(diào)節(jié)pH至2.8，用40%（NH4）2SO4進(jìn)行沉淀2 h，將所得的沉淀經(jīng)4 000 r/min離心，轉(zhuǎn)移至5 mL的EP管中，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。所得粗蛋白經(jīng)透析去鹽，再經(jīng)50℃烘干至恒重，測(cè)定蛋白質(zhì)提取率。

1.3.2 堿提蛋白質(zhì)方法 方法同鹽提蛋白法處理，按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入5 mL的NaOH溶液，再將樣品放置在50℃水浴鍋中3 h。將堿溶解的樣品經(jīng)冷藏沉淀，用中性鹽鹽析提取蛋白，處理方法同上。

1.3.3 鹽提蛋白質(zhì)的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對(duì)鹽濃度、料液比（g/mL）、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)梯度，重復(fù)3次。鹽濃度設(shè)定為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)，料液比（g/mL）為1∶10 g/mL，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為4 h；料液比（g/mL）設(shè)定為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL時(shí)，鹽濃度為1.0%，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為4 h；提取溫度設(shè)定為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃時(shí)，鹽濃度為1.0%，料液比（g/mL）為1∶10 g/mL，提取時(shí)間為4 h；提取時(shí)間設(shè)定為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h，鹽濃度為1.0%，提取溫度為40 ℃，料液比（g/mL）為1∶10 g/mL。

1.3.4 堿提蛋白法的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對(duì)堿濃度、料液比（g/mL）、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)梯度，重復(fù)3次試驗(yàn)。堿濃度設(shè)定為0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)，料液比（g/mL）設(shè)定為1∶10，提取溫度為50℃，提取時(shí)間3 h；料液比（g/mL）設(shè)定為1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL時(shí)，堿濃度為2.0%，提取溫度為50℃，提取時(shí)間3 h；提取溫度分別設(shè)定為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃時(shí)，堿濃度為2.0%，料液比（g/mL）1∶10，提取時(shí)間3 h；提取時(shí)間設(shè)定為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時(shí)，堿濃度為2.0%，料液比（g/mL）1∶10 g/mL，提取溫度為50℃。

1.3.5 鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過之前鹽提蛋白法的單因素實(shí)驗(yàn)確定兩種方法的最佳試驗(yàn)參數(shù)范圍，再通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，選擇4個(gè)影響因素：鹽濃度、料液比（g/mL）、提取溫度、提取時(shí)間，選擇3個(gè)水平，確定為L(zhǎng)9（34）正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平情況如表1。

表1 鹽法提雄蠶蛾蛋白正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過之前堿法提蛋白質(zhì)的單因素實(shí)驗(yàn)確定該提取方法的最佳試驗(yàn)參數(shù)范圍，再通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，選擇4個(gè)影響因素：堿濃度、料液比（g/mL）、提取溫度、提取時(shí)間，選擇3個(gè)水平，確定為L(zhǎng)9（34）正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平情況如表2。

表2 堿法提雄蠶蛾蛋白正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 復(fù)合鹽法—堿法提取蛋白質(zhì)方法 取0.5 g樣品加入10 mL的EP管中，再加入預(yù)冷的4℃的0.1 mol/L Na3PO4溶液1 mL。加入一定濃度NaCl溶液，按照所得鹽法最優(yōu)反應(yīng)條件提取蛋白質(zhì)，再加入一定濃度NaOH溶液，按照堿法最優(yōu)反應(yīng)條件提取蛋白質(zhì)，期間時(shí)不時(shí)晃動(dòng)EP管。將所得蛋白質(zhì)溶解液經(jīng)冷藏沉淀，再用中性鹽析出，方法同鹽提蛋白法，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。所得粗蛋白經(jīng)透析去鹽，再經(jīng)50℃烘干至恒重，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率（每個(gè)樣品平行3次）。

1.4 蛋白質(zhì)純度與提取率的測(cè)定

蛋白質(zhì)提取率按照公式1計(jì)算。

蛋白質(zhì)純度測(cè)定：參照Bradford法試劑盒說明書，以牛血清蛋白（20 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)液，加入G-250染色液，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中比較可得。

[X=待測(cè)蛋白質(zhì)量/μ g；n=稀釋倍數(shù)；m=樣本質(zhì)量/g；V1=樣本液體總體積/mL；V2=檢測(cè)用樣品體積/mL]

待測(cè)樣品為提取的粗蛋白樣品取1 mL稀釋20倍，再取10μ L加入300μ L的染色液混勻。靜置10 min后上樣。

空白對(duì)照樣品為10μ L蛋白稀釋液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)上樣量如表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見圖1。

表3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

2 結(jié)果與分析

按照直接干燥法測(cè)定樣品的含水量在（3.860±0.205）%之間。

2.1 鹽法單因素試驗(yàn)結(jié)果

以提取率為標(biāo)準(zhǔn)，得到鹽濃度、料液比（g/mL）、提取時(shí)間、提取溫度與提取率的關(guān)系如圖2、3、4、5所示。由圖2可得，蛋白質(zhì)提取率隨著鹽濃度增加而先上升后降低，在鹽濃度達(dá)到2%時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值41.97%。主要因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在稀鹽溶液中發(fā)生鹽溶現(xiàn)象，中性鹽離子被吸附在蛋白質(zhì)表面，帶電層使得蛋白質(zhì)分子間分離，另一方面鹽離子使蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合更緊密。但當(dāng)鹽離子的濃度達(dá)到一定量時(shí)，大量的自由水結(jié)合鹽離子變成了結(jié)合水，使得蛋白質(zhì)表面的疏水基被暴露出來，疏水作用使蛋白質(zhì)聚集沉淀，因此蛋白質(zhì)提取率降低[12]。而雄蠶蛾蛋白質(zhì)中的清蛋白和球蛋白能溶于水、稀酸液、稀堿液，用一定濃度的（NH4）2SO4在等電點(diǎn)可析出。由此選擇鹽濃度1.5%、2.0%、2.5%為鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖3可得，蛋白質(zhì)提取率隨著料液比（g/mL）稀釋而先上升后降低，在料液比（g/mL）達(dá)到1∶10時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值43.1%。主要因?yàn)榱弦罕龋╣/mL）太低，溶液太濃，蛋白質(zhì)不能得到充分溶解；但料液比（g/mL）大于一定范圍時(shí)，水溶性蛋白的損失增加，并且生產(chǎn)成本提高[12]。由此選擇料液比（g/mL）1∶5、1∶10、1∶15為鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖4可得，蛋白質(zhì)提取率隨著提取溫度的增加而先上升后下降，在提取溫度達(dá)到40℃時(shí)達(dá)到最大值47.33%。主要因?yàn)殡S著溫度升高，蛋白質(zhì)溶解速率加快；但當(dāng)溫度超過一定值時(shí)，會(huì)造成蛋白質(zhì)的變性，部分水解為氨基酸，部分不能溶解，從而使提取率降低。由此選擇提取溫度為30℃、40℃、50℃為鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖5可得，蛋白質(zhì)提取率隨著提取時(shí)間增加而先上升后下降，在提取時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)達(dá)到最大值38.33%。主要因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)能夠充分溶解在鹽溶液中；但水分也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)揮發(fā)[13]，當(dāng)提取時(shí)間高于一定范圍，固液比大于一定值，蛋白質(zhì)的溶解率降低，提取率減小。由此選擇提取時(shí)間為3.5 h、4.0 h、4.5 h為鹽法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

2.2 堿法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以提取率為標(biāo)準(zhǔn)，得到堿濃度、料液比（g/mL）、提取時(shí)間、提取溫度與提取率的關(guān)系如圖6、7、8、9所示。由圖6可得，蛋白質(zhì)提取率隨著堿濃度的增加而一直上升，當(dāng)堿濃度達(dá)到2.0%時(shí)，提取率達(dá)到最大值55.13%。主要因?yàn)樾Q蛾蛋白質(zhì)中堿性蛋白較多，隨著堿濃度增加溶解率增加；但當(dāng)堿濃度超過一定值蛋白質(zhì)發(fā)生“胱賴反應(yīng)”，部分蛋白質(zhì)變性，還會(huì)產(chǎn)生有毒有色物質(zhì)，也不適宜食用[14]。而堿濃度過高時(shí)調(diào)節(jié)等電點(diǎn)需要大量HCl溶液中和，從而使得提取液中鹽濃度過高，蛋白質(zhì)溶解率降低，則蛋白質(zhì)提取率降低。由此選擇堿濃度為1.5%、2.0%、2.5%為堿濃法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖7可得，蛋白質(zhì)提取率隨著料液比（g/mL）的減小而先上升后下降，當(dāng)料液比（g/mL）達(dá)到1∶8時(shí)，提取率達(dá)到最大值54.2%。原因與鹽法提取蛋白質(zhì)的料液比（g/mL）影響相同，由此選擇料液比（g/mL）為1∶5、1∶8、1∶10為堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖8可得，蛋白質(zhì)提取率隨著溫度的升高而先上升后下降，當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值54%。原因與鹽法提取蛋白質(zhì)的溫度影響相同，由此選擇提取溫度為60℃、70℃、80℃為堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

由圖9可得，蛋白質(zhì)提取率隨著提取時(shí)間的增加而先上升后下降，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值52.13%。蠶蛾蛋白質(zhì)中的谷蛋白不溶于水、中性鹽，但溶于稀酸液、稀堿液。在溶解初期，蛋白質(zhì)表面的酪蛋白最先溶解，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)內(nèi)層也逐漸溶解，但水分也會(huì)揮發(fā)，因此過長(zhǎng)時(shí)間提取率下降。由此選擇提取時(shí)間為3.5 h、4.0 h、4.5 h為堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)的因素。

2.3 鹽法正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果

將設(shè)置的水平與因素帶入運(yùn)算，鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4直觀可得，當(dāng)提取率為最大值43.65%時(shí)，最佳因素組合為A1B2C2D2，由R值判斷，影響因素的主次為B＞D＞C＞A。進(jìn)一步以各因素的K1、K2、K3計(jì)算得到其偏差平均值，繪制效應(yīng)曲線如圖10所示，按照趨勢(shì)，最大的組合即為最佳因素組合應(yīng)為A1B2C2D3，從各因素的斜率來看，降幅最大的為最主要影響因素，可得影響因素的主次為B＞D＞C＞A。重復(fù)3次試驗(yàn)，組合為A1B2C2D3的蛋白質(zhì)提取率均值為44.36%，提取蛋白質(zhì)含量均值為34.5%。綜合可得，當(dāng)鹽法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)在鹽濃度1.5%，料液比（g/mL）為1∶10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為4.5 h時(shí)可獲得最大提取率，為最優(yōu)鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法，提取因素的主次排列依次為料液比（g/mL）＞提取時(shí)間＞提取溫度＞鹽濃度。

表4 鹽法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果

將設(shè)置的水平與因素帶入運(yùn)算，堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。由表5直觀可得，當(dāng)提取率為最大值57.81%時(shí)，最佳因素組合為A3B1C3D2，由R值判斷，影響因素的主次為D＞C＞A＞B。進(jìn)一步以各因素的K1、K2、K3計(jì)算得到其偏差平均值，繪制效應(yīng)曲線如圖11所示，按照趨勢(shì)，最大的組合即為最佳因素組合應(yīng)為A2B2C3D3，從各因素的斜率來看，降幅最大的為最主要影響因素，可得影響因素的主次為D＞C＞A＞B。重復(fù)3次試驗(yàn)，組合為A2B2C3D3的蛋白質(zhì)提取率均值為57.62%，蛋白質(zhì)含量均值為47.69%。綜合可得，當(dāng)堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)在堿濃度2%，料液比（g/mL）為1∶8，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為4.5 h時(shí)可獲得最大提取率，為最優(yōu)堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法，提取因素的主次排列依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞堿濃度＞料液比（g/mL）。

表5 堿法提雄蠶蛾蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 復(fù)合鹽法-堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)

通過以上實(shí)驗(yàn)所得鹽法和堿法的最優(yōu)提取條件，先用鹽法提取蛋白質(zhì)，即鹽濃度1.5%，料液比（g/mL）為1∶10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為4.5 h之后在所得液的基礎(chǔ)上用堿法再提取蛋白質(zhì)，即堿濃度2%，料液比（g/mL）為1∶8，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為4.5 h。之后經(jīng)過離心分離除雜、沉淀析出目標(biāo)蛋白、透析、烘干，經(jīng)三次試驗(yàn)取均值，得到的提取率為54.68%，低于堿法又高于鹽法；蛋白質(zhì)含量49.12%，高于堿法和鹽法。主要原因是在鹽溶液的基礎(chǔ)上加堿再中和，使得溶液中鹽濃度的濃度增加，造成部分蛋白質(zhì)析出而損失。但由于堿法要求的提取溫度較高，容易發(fā)生“胱賴反應(yīng)”，蛋白質(zhì)會(huì)脫氨基、脫羧、肽鍵斷裂，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，只能得到羥基氨基酸、消旋化的氨基酸，含硫氨基酸少。而鹽法相對(duì)保護(hù)蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)可食用價(jià)值更高[15]。復(fù)合法在鹽法基礎(chǔ)上進(jìn)行堿法，比較單純堿法，堿濃度較低，固液比較稀，對(duì)蛋白質(zhì)損害少，而且能夠溶解谷蛋白，得到的蛋白質(zhì)種類更全。

3 結(jié)果與討論

本文致力得到可食用的高純度雄蠶蛾粗蛋白，通過兩種不同方法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，比較不同提取方法蛋白質(zhì)提取率的差異，再用正交試驗(yàn)進(jìn)一步選出最優(yōu)提取條件，獲得最佳復(fù)合鹽法—堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)的工藝。

由上述試驗(yàn)可得，鹽法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)，最優(yōu)提取條件為鹽濃度1.5%，料液比（g/mL）為1∶10，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為4.5 h，提取率為44.36%，蛋白質(zhì)含量為34.5%，提取因素的影響主次排列依次為料液比（g/mL）＞提取時(shí)間＞提取溫度＞鹽濃度；堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)，最優(yōu)提取條件為堿濃度2%，料液比（g/mL）為1∶8，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為4.5 h，提取率為57.62%，蛋白質(zhì)含量為47.69%，提取因素的影響主次排列依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞堿濃度＞料液比（g/mL），復(fù)合鹽法—堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)，提取率為54.68%，蛋白質(zhì)含量49.12%。綜上所述，鹽法、堿法、復(fù)合鹽法—堿法提取雄蠶蛾蛋白的提取率高低依次為堿法＞復(fù)合鹽法—堿法＞鹽法，蛋白質(zhì)含量高低依次為復(fù)合鹽法—堿法＞堿法＞鹽法。堿法提取雄蠶蛾蛋白質(zhì)的提取率雖然高，但由于長(zhǎng)時(shí)間高溫的堿液浸泡，提取蛋白色澤較黃，有不良風(fēng)味，而復(fù)合法提取的蛋白質(zhì)色澤較白，味道較小，更能保持蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)，適合食品加工應(yīng)用。

相比孫雁等[16]用堿法提取繅絲蠶蛹蛋白，其提取率高達(dá)78.69%，可能原因一是樣品為繅絲后的脫脂蠶蛹，二是蛋白質(zhì)測(cè)定方法為凱氏定氮法，三是提取工藝不同。而張健等[17]用堿法提取柞蠶蛹蛋白質(zhì)，用改良的Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度提取率達(dá)到52.73%；王林美等[18]用微量凱氏定氮法測(cè)定鮮雄蠶蛾蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量在14.65%；杜立群等[19]用生理鹽水提取柞蠶蛹蛋白質(zhì)，凱氏定氮法測(cè)定，粗蛋白得率為38.98%，可見不同樣品前處理方法、不同蛋白質(zhì)提取方法、不同蛋白質(zhì)測(cè)定方法得到的蛋白質(zhì)提取率不同。又由于蠶蛾蛋白質(zhì)中的醇溶蛋白只溶于60%～95%的醇溶液、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑中，則本研究的提取方法可能損失這部分蛋白。造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差的影響因素還可能和樣品的破碎程度、中性鹽沉淀的條件、油脂殘留量、多糖量等有關(guān)。此外，本研究缺少雄蠶蛾烘干條件的選擇、等電點(diǎn)的選擇等預(yù)試驗(yàn)，在今后進(jìn)一步優(yōu)化工藝上有待突破。

昆蟲蛋白質(zhì)測(cè)定方法主要有凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)法、雙縮脲法、BCA法等，其中凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量比較高，容易受非蛋白含氮物質(zhì)干擾[20]，而考馬斯亮藍(lán)法中染料不與小分子量氨基酸結(jié)合，受去污劑、泡沫影響，干擾實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，BCA法受多糖、尿素、β-巰基乙醇等因素影響[21]，試驗(yàn)結(jié)果皆有誤差。因此接下來可拓展本提取方法對(duì)不同蛋白質(zhì)測(cè)定方法的適用性研究。