黑龍江水系6個地理群體銀鯽染色體倍性和肌肉營養(yǎng)分析

韓 英，李洪卿，薛淑群，呂曉楠，馬 凱

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，北京 100176）

鯽（Carassius auratus）屬于鯉科（Cyprinidae）、鯽屬（Carassius），為亞歐大陸常見淡水魚類，具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美等特點。鯽養(yǎng)殖成本低、效益好，是我國重要淡水養(yǎng)殖魚類，但與其他鯉科養(yǎng)殖魚類相比生長速度較慢，培育生長速度快且肉質(zhì)好的品種為目前主要育種目標。銀鯽（Carassius auratus gibelio）為鯽的亞種，廣泛分布于黑龍江水系和新疆額爾齊斯河，黑龍江水系所產(chǎn)鯽亦均為銀鯽。與鯽相比，銀鯽具有背高、個體大、生長速度快等特點，且銀鯽肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，深受消費者喜愛，養(yǎng)殖前景廣闊[1]。

黑龍江水系復雜，流域?qū)拸V，銀鯽資源豐富。由于地理環(huán)境和水文環(huán)境差異，銀鯽在黑龍江水系形成較多地理群體。這些地理群體在生物學性狀上無顯著差別，但在染色體倍性上有二倍體和三倍體之分，三倍體銀鯽行雌核發(fā)育，生長速度更快。不同地理群體肉質(zhì)風味不同，其中方正銀鯽、紅肚鯽、亮珠河鯽和鏡泊湖鯽等，為具有優(yōu)良性狀的名優(yōu)地理群體。方正銀鯽原產(chǎn)于黑龍江省方正縣雙鳳水庫，較鯽生長速度快20%以上，具有背厚、出肉率高、耐寒冷、抗病力強、個體大、經(jīng)濟價值高等特點，也是我國魚類育種和養(yǎng)殖開發(fā)重要對象，異育銀鯽即以方正銀鯽為母本，經(jīng)興國紅鯉異精刺激雌核發(fā)育而成。紅肚鯽產(chǎn)自烏蘇里江一級支流撓力河，鱗片呈金黃色，腹部橘黃，出水后腹部逐漸變紅，肉質(zhì)鮮美，體色靚麗，具有較高育種價值[2]。亮珠河鯽產(chǎn)自松花江二級支流亮珠河，具有頭小、個體大、生長快等特點，已在局部地區(qū)開展養(yǎng)殖，并獲得良好養(yǎng)殖收益。鏡泊湖鯽產(chǎn)自松花江水系鏡泊湖，具有頭小、背厚、個體大等特點，在唐朝曾為貢品，為黑龍江稀有名優(yōu)銀鯽[3]。

目前，黑龍江水系銀鯽研究主要集中于方正銀鯽，包括其生長性狀、肌肉營養(yǎng)成分、染色體倍性等[4-6]。目前尚未系統(tǒng)研究和開發(fā)利用黑龍江銀鯽更多地理群體，其肉質(zhì)、生長速度和個體尺寸方面表現(xiàn)良好，為重要育種材料和養(yǎng)殖對象。本研究以黑龍江水系紅肚鯽、撓力河鯽、寶清鯽、方正鯽、亮珠河鯽和鏡泊湖鯽共6個地理群體銀鯽為研究對象，采用流式細胞術(shù)檢測其染色體倍性，采用生化分析方法測定分析和評價其肌肉營養(yǎng)，以期為名優(yōu)地理群體開發(fā)和養(yǎng)殖新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗動物及樣品制備

所有銀鯽采集于2017年9～11月，6個地理群體共108尾。其中紅肚鯽（HD）16尾采自烏蘇里江一級支流撓力河中游，體重為（173.27±32.16）g；撓力河鯽（NL）16尾采自撓力河上游，體重為（218.60±29.16）g；寶清鯽（BQ）19尾采自撓力河水系寶清縣黑泡水庫，體重為（140.78±38.39）g；方正銀鯽（FZ）16尾采自方正縣方正銀鯽原良種場，體重為（175.25±46.75）g；亮珠河鯽（LZ）20尾采自松花江二級支流亮珠河，體重為（312.52±100.14）g；鏡泊湖鯽（JP）21尾采自牡丹江水系鏡泊湖，體重為（405.87±180.15）g。實驗用魚在東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院養(yǎng)魚室暫養(yǎng)，并作倍性檢測。

30 mg·L-1丁香酚（購自上海銘睿生物科技有限公司）溶液將試驗魚麻醉后處死，每個地理群體隨機選擇5尾魚，取相同重量側(cè)線以上背部去皮無骨肌肉，剪碎、均勻混合作為一個樣本。每個地理群體制備3個樣本，每個樣本平均分成2份，一份用于肌肉營養(yǎng)成分檢測，一份用于氨基酸含量測定，-20℃保存待測。

1.2 染色體倍性檢測

參考Kendall等[7]方法，采用流式細胞術(shù)檢測染色體倍性。標準樣品為雞血，每個地理群體取3尾魚，用30 mg·L-1丁香酚溶液將試驗魚麻醉后取血液加入至生理鹽水（1∶3）中混勻，后緩慢滴加于6 mL人體淋巴細胞分離液液面上，于20℃、2 500 r·min-1離心20 min。棄上清，加6 mL生理鹽水，20 ℃、600 r·min-1離心20 min，重復3次，最后用1 mL生理鹽水重懸。取單細胞懸液100 μL，加入6 mL預冷卡諾固定液（甲醇∶無水乙醇=3∶1），混勻后于4℃冰箱固定2 h。固定后在4℃、800 r·min-1離心5 min，棄上清，加入6 mL生理鹽水，混合均勻后，4℃、600 r·min-1離心3 min，棄上清重復3次。加生理鹽水至1 mL，在4℃、避光條件下PI染色30 min。過400目篩，使用流式細胞儀檢測。

流式細胞儀為美國BD公司FZCSARIA型，人體淋巴細胞分離液、PI染色劑購自廣州博越生物科技有限公司。

1.3 肌肉營養(yǎng)成分測定

1.3.1 水分、粗灰分、粗脂肪測定

按照GB/T5009-2016中直接干燥法、高溫灰化法和索氏提取法測定水分、粗灰分和粗脂肪，每個檢測3個重復。

1.3.2 粗蛋白測定

參照GB/T5009.5-2016中凱氏定氮法，根據(jù)儀器實際要求測定粗蛋白。首先對鹽酸標準溶液標定，計算標準溶液濃度為c?？瞻诇y定，所用鹽酸標準溶液體積記為V0。取0.2 g干燥樣品（記為W）于消化管，加入硫酸銅0.2 g、硫酸鈉3 g、濃硫酸10 mL，混合均勻后于消煮爐上300℃加熱至無泡沫，升溫至410℃后加熱至溶液澄清。冷卻至室溫后，加雙蒸水至100 mL，樣品分解液體積記為V。取10 mL消解液加入2%硼酸溶液20 mL、混合指示劑2滴，蒸餾（體積記為V'）。使用已標定鹽酸標準溶液滴定，滴定終點為灰紅色，記樣品標定所用體積為V1。

粗蛋白含量計算公式如下:

式中，系數(shù)6.25為氮-蛋白質(zhì)換算系數(shù)，0.0140為每mL鹽酸標準溶液相當于氮g數(shù)。粗蛋白測定作3個重復。

1.4 氨基酸含量檢測方法

參照GB/T5009.124-2016，根據(jù)試驗儀器要求，對混合均勻的肌肉樣品脫脂處理（索氏提取法），粉碎過80目篩，準確稱取100 mg樣品移入15 mL水解管，加8 mL 1∶1 HCl，充氮氣封口，于110℃烘箱內(nèi)水解24 h。冷卻后搖勻過濾（0.45 μm過濾器），超純水定容至50 mL，取1 mL樣品液于5 mL離心管，真空凍干機凍干。凍干后加1 mL 0.02 mol·L-1HCl震蕩搖勻，吸上清0.8 mL過0.45 μm過濾器后上機檢測。氨基酸含量檢測作3個重復。

氨基酸自動檢測儀為日本HITACHI廠L-8800型，檢測時進樣量為0.8 mL，分離柱柱溫為57℃，反應溫度為135℃，分離緩沖液流速為0.40 mL·min-1，茚三酮反應液流速為0.35 mL·min-1，波長為440 nm。

1.5 肌肉營養(yǎng)品質(zhì)評定方法

魚肉營養(yǎng)品質(zhì)評價根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織（WHO）1973年建議的氨基酸評分模式（AAS）[8]和全雞蛋蛋白質(zhì)氨基酸模式（CS），分別計算6個地理群體銀鯽肌肉氨基酸AAS值、CS值、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）。計算F值，F(xiàn)值為支鏈氨基酸和芳香族氨基酸比值。公式如下:

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016軟件統(tǒng)計和計算試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 21.0軟件作單因素方差分析和多重比較，具有方差齊性的變量采用LSD法，不具有方差齊性的變量采用Tamhane's T2法。數(shù)據(jù)表示方法為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體倍性

染色體倍性檢測結(jié)果見圖1。以雞為標準二倍體，標品雞血紅細胞DNA含量為50×1 000，6個地理群體銀鯽紅細胞DNA含量均為75×1 000，由此確定6個地理群體銀鯽均為三倍體。

2.2 肌肉營養(yǎng)成分

6個地理群體銀鯽肌肉營養(yǎng)成分見表1，結(jié)果顯示其營養(yǎng)成分含量不同。水分平均含量為79.53%，各群體間差異不顯著。粗灰分平均含量為2.61%，最高為BQ，依次為FZ、NL、LZ、HD，JP為最低，除LZ與HD外，各群體間差異顯著（P＜0.05）。粗脂肪平均含量為1.41%，最高為FZ，依次為JP、NL、BQ、HD，最低為LZ，其中FZ和JP顯著高于其他地理群體，JP與NL顯著高于HD和LZ。粗蛋白平均含量為17.12%，最高為JP，依次為FZ、NL、LZ、HD，BQ為最低，其中JP和FZ顯著高于其他地理群體，NL顯著高于HD和BQ。

2.3 氨基酸組成及含量

氨基酸測定結(jié)果如表2所示。

表1 6個地理群體銀鯽肌肉營養(yǎng)成分（%，濕重）Table 1 Nutritional component contents in fresh muscle of six populations C.auratus gibelio（%，wet weight）

表2 6個地理群體銀鯽氨基酸組成及含量（%，濕重）Table 2 Content and proportion of amino acid in fresh muscle of six populations C.auratus gibelio（%，wet weight）

6個地理群體銀鯽肌肉中共檢測出17種常見氨基酸（樣品經(jīng)過酸處理，導致色氨酸被破壞而無法檢出），其中包括人體中必需氨基酸7種（Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys），半必需氨基酸 2種（His、Arg），非必需氨基酸 8種（Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、Pro）。

6個地理群體銀鯽氨基酸總量（TAA）為14.66±0.70%，最高為FZ，依次為BQ、JP、LZ、HD，NL為最低，其中FZ顯著高于其他地理群體，BQ顯著高于除FZ外其他4個地理群體，JP、LZ和HD顯著高于NL。BQ群體中含量最高的3種氨基酸依次為谷氨酸（1.72±0.05%）、甘氨酸（1.71±0.03%）和亮氨酸（1.60±0.01%），其他5個群體中含量最高的3種氨基酸依次為甘氨酸（1.82±0.14%）、谷氨酸（1.66±0.08%）和亮氨酸（1.48±0.07%）。6個地理群體氨基酸含量最低均為胱氨酸（0.036±0.00%）、組氨酸（0.313±0.02%）和脯氨酸（0.452±0.06%）。

6個地理群體銀鯽必需氨基酸總量（EAA）為5.68±0.28%，F(xiàn)Z為最高，依次為BQ、JP、HD、LZ，NL為最低，其中FZ和BQ顯著高于其他群體，JP與HD顯著高于NL。6個群體含量最高的必需氨基酸均為亮氨酸，含量為1.48±0.08%；最低均為蛋氨酸，含量為0.31±0.02%。必需氨基酸與總氨基酸比值（WEAA/WTAA）平均為38.73%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值（WEAA/WNEAA）平均為72.24%。F值為2.16～2.40。

6個地理群體銀鯽檢測到4種鮮味氨基酸，總量為6.24±0.33%，以FZ最高，依次為BQ、LZ、JP、HD，NL為最低，其中FZ顯著高于其他群體，BQ顯著高于HD和NL。FZ天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量顯著高于其他群體（P＜0.05），而NL中谷氨酸和丙氨酸含量顯著低于其他群體（P＜0.05）。6個群體銀鯽肌肉中鮮味氨基酸含量最高均為甘氨酸，含量最低均為天冬氨酸。

2.4 肌肉必需氨基酸組成評價

計算每個地理群體銀鯽肌肉中各必需氨基酸AAS、CS值，見表3。結(jié)果可見，BQ中AAS和CS最高為亮氨酸，其他5個群體最高為蘇氨酸。以AAS值和CS值為評價指標，6個地理群體銀鯽第一限制氨基酸皆為蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸皆為纈氨酸。除第一、第二限制氨基酸，其他必需氨基酸AAS分值均接近或大于1，CS分值均接近或大于0.7。NL與JP群體EAAI大于65，其余4個群體均大于70。

表3 6個地理群體銀鯽肌肉中必需氨基酸組成評價Table 3 Evaluation on the composition of essential amino acid in six populations C.auratus gibelio

3 討論

3.1 6個銀鯽地理群體染色體倍性

研究指出，黑龍江水系中鯽具有天然二倍體和天然三倍體之分，而不同倍性鯽的地理分布具有一定區(qū)域性，黑龍江省東部、鏡泊湖等區(qū)域主要為三倍體種群分布區(qū)，松花江、牡丹江下游區(qū)域則為二、三倍體種群混棲分布區(qū)。河流型水域多為二、三倍體種群混棲區(qū)而湖泊、水庫類型則多為三倍體種群分布區(qū)[9]。本研究中HD、NL、BQ群體位于黑龍江省東部烏蘇里江水系，F(xiàn)Z、LZ、JP群體位于牡丹江水系。結(jié)果顯示這6個地理群體銀鯽均為三倍體，與上述研究結(jié)果相符。三倍體銀鯽行雌核發(fā)育，可快速建立純系，加快品種、種群等選育系形成，提高選種效率，將優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳[10]。因此，6個地理群體具有較高養(yǎng)殖和育種價值。

3.2 6個銀鯽地理群體的營養(yǎng)價值

在肌肉營養(yǎng)成分中，粗蛋白和粗脂肪含量為營養(yǎng)價值評價重要指標。由表1可知，6個地理群體銀鯽肌肉中粗蛋白平均含量為17.12%，高于鱖[11]、草魚[11]、鳙[12]，低于虹鱒[13]、花鰻鱺[14]。粗脂肪平均含量為1.41%，高于鱖[11]、草魚[11]、鳙[12]，低于虹鱒[13]、鯉[15]。不同食性魚類粗蛋白含量不同，一般肉食性魚類相對含量較高，如鱖。而銀鯽為雜食性魚類，其粗蛋白水平卻高于鱖，說明這6個地理群體銀鯽粗蛋白含量極為豐富。不同生活習性和飼養(yǎng)方式對于肌肉脂肪含量有顯著影響[16]。本研究中銀鯽粗脂肪含量屬于較低水平，是理想保健食品。6個地理群體銀鯽水分平均含量為79.53%，粗灰分平均含量為2.61%，與彭澤鯽[17]、松浦鯽[18]等研究結(jié)果相似。6個地理群體相比較，JP粗蛋白含量最高，粗脂肪含量位居第二，營養(yǎng)價值最高。

從食品營養(yǎng)學角度看，食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值在很大程度上取決于其必需氨基酸含量及比例。由表2可知，6個地理群體銀鯽EAA含量平均為5.68±0.28%，高于草魚[11]、鳙[12]，低于虹鱒[13]、異育銀鯽[19]，屬于較高水平。FAO/WHO理想蛋白質(zhì)模式認為，質(zhì)量優(yōu)良的蛋白質(zhì)其氨基酸組成WEAA/WTAA在40%左右，WEAA/WNEAA在60%以上[20]。本研究中6個地理群體銀鯽WEAA/WTAA均接近40%，WEAA/WNEAA均大于70%，說明這6個地理群體銀鯽是符合人體需求的優(yōu)秀蛋白質(zhì)來源。綜合EAA含量和WEAA/WTAA、WEAA/WNEAA比值來看，未開發(fā)群體中BQ和JP氨基酸營養(yǎng)價值更高。

通過必需氨基酸組成評價可知，蛋氨酸+胱氨酸和纈氨酸分別為第一、第二限制氨基酸，因此，人工飼養(yǎng)或食品加工時應注意添加這兩種必需氨基酸，進一步提高其魚肉品質(zhì)。AAS、CS和EAAI指標反映這6個地理群體銀鯽必需氨基酸含量豐富，且組成相對均衡，具有較高營養(yǎng)價值。

3.3 6個銀鯽地理群體氨基酸組成

由表2可見，6個地理群體銀鯽蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，含量較高，其TAA含量為14.66±0.70%，高于歐洲鰻鱺[14]、俄羅斯鱘[21]，接近鱖[11]，低于虹鱒[13]。HD、NL、FZ、LZ和JP 5個地理群體中甘氨酸含量最高，其次為谷氨酸；BQ群體谷氨酸含量最高，其次為甘氨酸。甘氨酸為中樞神經(jīng)中必需氨基酸，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)對大腦神經(jīng)活動有刺激和抑制作用，并可刺激胰高血糖素分泌。谷氨酸在生命體蛋白質(zhì)代謝過程中起重要作用，影響大腦發(fā)育，也是腦中各種生物化學反應和多種生理活動所需關(guān)鍵氨基酸[22]。因此，經(jīng)常食用銀鯽利于血糖調(diào)節(jié)，同時對大腦發(fā)育有一定積極作用。亮氨酸為8種人體必需氨基酸之一，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝、修復肌肉、降低脂肪合成并促進脂肪分解，為本研究中含量最高必需氨基酸，高于FAO/WHO標準蛋白模式，接近或高于雞蛋蛋白模式。因此，銀鯽作為食物有益機體健康，是理想保健食品。賴氨酸為8種人體必需氨基酸之一，對人體生長發(fā)育、機體免疫力和抗病毒有積極作用，也是一般谷類和人乳蛋白質(zhì)第一限制氨基酸[23]，本研究中6個地理群體銀鯽肌肉中賴氨酸含量較高，均高于FAO/WHO標準蛋白模式。因此，銀鯽作為食品可補充其他食材的賴氨酸不足，對人體具有特殊營養(yǎng)價值和保健作用。

魚肉鮮美程度主要取決于肌肉中鮮味氨基酸組成及含量。6個地理群體銀鯽肌肉中共檢測出4種鮮味氨基酸，總量高于草魚[11]和鳙[12]。甘氨酸為呈甘味特征氨基酸，為動物營養(yǎng)最重要且最簡單的非必需氨基酸，對改善動物和人體健康有利。谷氨酸為呈鮮味特征氨基酸，作為氮代謝基本氨基酸之一，對動物大腦發(fā)育有重要意義。本研究中，甘氨酸和谷氨酸為17種氨基酸中含量最高的兩種氨基酸，說明6個地理群體銀鯽肉味鮮美。

綜上所述，從肌肉營養(yǎng)成分看，黑龍江水系銀鯽6個地理群體均具有高蛋白、低脂肪的特點。氨基酸組成相對均衡，氨基酸總量、必需氨基酸總量及鮮味氨基酸含量高，是營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)魚類，也是理想的保健食品。其中，已開發(fā)的方正銀鯽肉質(zhì)良好，氨基酸營養(yǎng)最佳；未開發(fā)地理群體中鏡泊湖鯽綜合表現(xiàn)最佳，具有較高的開發(fā)利用價值。