高效液相色譜法同時測定黑蒜中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量

盧連登，周 御，黃振榮，劉春鳳，鄭飛云，鈕成拓，王金晶，馬玉金，李 崎，王 棟*

(1.江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.青海恩露生物科技有限公司，青海 海東 810700)

黑蒜又名黑大蒜，是用新鮮生蒜，帶皮放在高溫高濕環(huán)境自然培養(yǎng)一段時間制成的產(chǎn)品，由于培養(yǎng)后蒜瓣呈黑色，因此稱為黑蒜。黑蒜去除大蒜異味，帶有甜味、口感好，無需再處理即可直接食用，與白大蒜相比，營養(yǎng)更加豐富、生物活性增強(qiáng)、應(yīng)用前景廣闊[1]。黑蒜具有消除疲勞、增強(qiáng)抗氧化性、保肝護(hù)肝、促進(jìn)睡眠、降血壓血脂、降膽固醇、抗糖尿病、抗腫瘤等功能[2]。黑蒜在去除大蒜刺激性氣味同時，適當(dāng)保留具有生物活性含硫化合物[3]，多酚樣物質(zhì)含量增加，抗氧化能力顯著增強(qiáng)，營養(yǎng)價值更高[2,4]。

在黑蒜多種含硫有機(jī)化合物中，蒜氨酸及其主要相關(guān)硫化物被視為黑蒜主要功效成分，主要包括脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蒜中蒜氨酸（Alliin）具有多種藥理活性，如抑菌作用、抗腫瘤作用、促進(jìn)肝臟代謝、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心肌損傷、降血糖血脂、抗氧化作用，還有助于口腔健康[6]。脫氧蒜氨酸是蒜中重要含硫化合物，與蒜抗氧化、抗癌和有益神經(jīng)活性功能有關(guān)[7]，脫氧蒜氨酸形成與蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸有關(guān)[8]。γ-谷氨酰半胱氨酸，是蒜氨酸重要前體物質(zhì)，具有抗氧化作用[9]。脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸與黑蒜中蒜氨酸轉(zhuǎn)化聯(lián)系密切，選用蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸作為黑蒜中指標(biāo)成分評價和控制大蒜質(zhì)量更為合理。

目前，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量測定方法多為定硫法[10]、薄層色譜掃描法[11]、HPLC 法[12]或HPLC-MS/MS法[5]，但定硫法準(zhǔn)確度較低，薄層色譜掃描法是半定量方法，在特定條件下使用，HPLC-MS/MS法設(shè)備昂貴，成本較高，至今未有關(guān)于這3種成分同時檢測報道。本文采用HPLC法同時檢測黑蒜中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸，此方法操作簡便，分析迅速，回收率高，準(zhǔn)確靈敏，線性范圍廣。研究旨在為后續(xù)深入研究黑蒜生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考，為黑蒜質(zhì)量評價提供有效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、脫氧蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、γ-谷氨酰半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純）購自麥克林公司；磷酸（分析純）購自購自國藥化學(xué)試劑有限公司；超純水；市售黑蒜。

1.2 儀器與設(shè)備

日立CM5110高效液相色譜儀（日本日立公司）；PL-2000電子天平（METTLER TOLEDO公司）；JYL-C022E型料理機(jī)（九陽股份有限公司）；5804R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超聲提取器；GZX-9746MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；SHZ-B型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取黑蒜樣品10.0000 g，準(zhǔn)確加入100 mL 10%甲醇，榨汁機(jī)粉碎至樣品呈稀糊狀，室溫下超聲（強(qiáng)度70%）15 min后，雙層濾紙過濾，取澄清濾液于離心管內(nèi)，8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min，上清液定容至250 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，過0.22 μm濾膜后備用。

1.3.2 對照品溶液制備

分別精密稱取蒜氨酸34.0 mg，脫氧蒜氨酸70.0 mg，γ-氨酰半胱氨酸46.0 mg，超純水分別溶解并定容于50 mL容量瓶中，搖勻制得蒜氨酸母液，脫氧蒜氨酸母液和γ-谷氨酰半胱氨酸母液；分別精密吸取 680.00 μg·mL-1蒜氨酸溶液 2 mL、1 400 μg·mL-1脫氧蒜氨酸溶液1 mL和920 μg·mL-1γ-谷氨酰半胱氨酸溶液2 mL于5 mL離心管中，混勻，即得混合對照品母液，此時蒜氨酸濃度為272 μg·mL-1，脫氧蒜氨酸濃度為280 μg·mL-1，γ-谷氨酰半胱氨酸濃度為368 μg·mL-1。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HPLC色譜條件

色譜柱:ZORBAX-Eclipse XDB-C18Analytical柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速:0.8 mL·min-1；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:20 μL；以V（甲醇）∶V（0.1%磷酸水溶液）=10∶90為流動相；檢測波長:220 nm。

1.3.4 蒜氨酸、脫氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量計算

將制備混合對照品母液配制成不同濃度梯度混合對照品溶液并進(jìn)樣，以蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸對照品不同濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)線性回歸方程。將處理后樣品溶液作HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL，測出對應(yīng)峰面積Asample，將峰面積代入線性回歸方程，得到對應(yīng)物質(zhì)濃度Csample，依據(jù)黑蒜水分含量ω（%），計算黑蒜中蒜氨酸及其硫化物絕干物質(zhì)含量（mg·g-1）。以蒜氨酸為例，計算過程如式（1）所示。

式中，N—蒜氨酸絕干物質(zhì)含量（mg·g-1）；M—黑蒜樣品中蒜氨酸濕重（μg·g-1）；W—黑蒜含水量（g·100 g-1）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品預(yù)處理方法

提取溶劑:選擇料液比1∶10，提取方式為超聲，提取時間20 min，提取溫度30℃，研究不同溶劑對提取液中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量影響。3種提取溶劑為:超純水、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液。

料液比:選擇提取溶劑為10%甲醇，超聲提取時間20 min，提取溫度30℃，利用HPLC方法測定料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時，提取液中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量。

提取方式:選擇提取溶劑為10%甲醇，料液比1∶10，提取時間20 min，提取溫度30℃，分別研究超聲、振蕩和靜置3種提取方式。設(shè)定超聲波功率為300 W；水浴振蕩器振蕩頻率為120 r·min-1。利用HPLC方法測定不同提取方式下液中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量情況。

提取時間:選擇提取溶劑為10%甲醇，料液比為1∶10，提取方式為超聲，提取溫度30℃，研究提取時間10、15、20、25、30 min時，提取液中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量。

1.4.2 流動相及洗脫方式選擇

1.4.2.1 流動相選擇

比較超純水、10%甲醇+0.1%磷酸、0.1%磷酸、10%甲醇和20%甲醇分別作為流動相，等梯度洗脫，對黑蒜中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量分析結(jié)果影響。流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長220 nm。

1.4.2.2 洗脫方式選擇

以流動相A（甲醇）和流動相B（0.1%磷酸）為流動相，比較梯度洗脫和等度洗脫兩種方法對黑蒜中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量分析結(jié)果影響，洗脫條件分別設(shè)置如下:

洗 脫 條 件 1:0～15 min， 0～15 min10%A+90%B；

洗脫條件2:0～3 min，5%A+95%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，15%A+85%B；

洗脫條件 3:0～3 min，10%A+90%B；3～5 min，15%A+85%B，5～15 min，20%A+80%B；

洗 脫 條 件 4:0～3 min， 100%B； 3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，20%A+80%B。

1.4.3 檢測波長確定

取1.3.2中制備混合對照品溶液，按照1.3.3中色譜條件進(jìn)樣，分別考查220、250、280、300 nm不同波長下蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量分析結(jié)果差異，確定最佳檢測波長。

1.4.4 方法有效性測定

精密吸取1.3.2項下制備對照品儲備液適量，配制蒜氨酸質(zhì)量濃度分別為272.00、217.60、163.20、108.80、54.40、27.20 μg·mL-1，脫氧蒜氨酸質(zhì)量濃度分別為280.00、224.00、134.40、89.60 、44.80、22.40 μg·mL-1，γ-谷氨酰半胱氨酸質(zhì)量濃度分別為368.00、294.40、220.80、147.20、73.60、36.80 μg·mL-1。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL作色譜分析，記錄峰面積，分別以不同化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)作線性回歸分析，計算得回歸方程。

檢出限:在高效液相色譜儀上采集一段基線，選取一段穩(wěn)定波動，計算最高點和最低點之間高度，作為儀器噪音，分析待測樣品進(jìn)樣，當(dāng)信噪比S/N=3時，此時濃度即為檢出限。

精密度和回收率:平行制備5份黑蒜樣品溶液，按1.3.3中色譜條件進(jìn)樣測定含量，重復(fù)測定5次，研究方法精密度；另3份各添加500、1 000、1 500 μg·g-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，研究不同添加量下物質(zhì)加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理和檢測條件選擇

2.1.1 樣品預(yù)處理條件確定

2.1.1.1 提取溶劑

不同提取溶劑對黑蒜中蒜氨酸及硫化物提取后檢測結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，不同提取溶劑對蒜氨酸和脫氧蒜氨酸提取無明顯影響，蒜氨酸和脫氧蒜氨酸在不同提取液中含量分別穩(wěn)定在3.3和8.7 mg·g-1；相比之下，10%甲醇提取液對γ-谷氨酰半胱氨酸提取效果較好，此提取液中γ-谷氨酰半胱氨酸含量達(dá)到28.23 mg·g-1，分別較超純水和20%甲醇體系中含量提高5.4%和13.3%；因此后續(xù)選擇10%甲醇作為蒜氨酸及其硫化物提取溶劑。

2.1.1.2 料液比

選擇10%甲醇作為提取溶劑，不同料液比條件下對黑蒜中蒜氨酸及硫化物提取檢測結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨料液比增大，蒜氨酸和脫氧蒜氨酸含量無明顯差異，蒜氨酸和脫氧蒜氨酸在不同料液比下分別穩(wěn)定在3.1和8.3 mg·g-1；γ-谷氨酰半胱氨酸含量呈先增后降趨勢，因為隨料液比增大，滲透體系濃度差增大，滲透速度加快，即黑蒜中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物溶出速度加快，而料液比過大，溶液濃度減小，影響提取溶劑對物料吸收，從而使蒜氨酸及其硫化物溶出減少。當(dāng)料液比為1∶10時，γ-谷氨酰半胱氨酸含量最高，達(dá)28.23 mg·g-1。因此后續(xù)研究選取料液比為1∶10作黑蒜中蒜氨酸及其硫化物提取操作。

2.1.1.3 提取方式

不同提取方式下黑蒜樣品中蒜氨酸及硫化物提取結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，不同種提取方式對蒜氨酸提取效率有顯著影響，靜置提取時由于蒜氨酸等硫化物溶出不充分，提取率較低，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分別為1.95、7.96、22.65 mg·g-1；振蕩提取與靜置提取相比，較靜置條件下有所提高，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分別為2.54、8.08、26.34 mg·g-1，較靜置條件分別提高30.3%、1.5%、16.3%；超聲方式提取蒜氨酸及其硫化物效率相對較高，在超聲條件下，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量分別為3.6、8.9、28.2 mg·g-1，較靜置條件分別提高86.1%、12.7%、24.6%，因此后續(xù)選擇超聲作為蒜氨酸及其硫化物提取方式。

2.1.1.4 提取時間

不同提取方式下黑蒜樣品中蒜氨酸及硫化物提取結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在試驗范圍內(nèi)，黑蒜中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨提取時間變化趨勢均為先增后降，20 min時達(dá)到峰值，分別為3.63、8.97、28.23 mg·g-1。在小于或大于20 min時，蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量降低，小于20 min時，由于提取時間較短，蒜氨酸及其相關(guān)硫化物溶解不充分，當(dāng)時間大于20 min時，溶解蒜氨酸及其相關(guān)硫化物有部分損失，所以確定提取時間為20 min。

綜上所述，黑蒜蒜氨酸及其硫化物較理想提取條件確定為:提取溶劑10%甲醇，料液比1:10，提取溫度30℃，超聲提取20 min。

2.1.2 流動相及洗脫方式選擇

2.1.2.1 流動相選擇

比較超純水、10%甲醇+0.1%磷酸、0.1%磷酸、10%甲醇和20%甲醇分別作為流動相，作等度洗脫，最終確定10%甲醇+0.1%磷酸為流動相。

在等度洗脫條件下，流動相為10%甲醇+0.1%磷酸時，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸目標(biāo)峰分離度最好，分別為1.612、2.500、4.602，均大于1.5，3種組分分離情況良好，出峰時間適宜，峰形好；流動相為超純水時，3個目標(biāo)峰分離度均小于1.5，分離情況較差，峰形較寬；流動相為0.1%磷酸時，蒜氨酸和脫氧蒜氨酸分離情況較好，分離度分別為1.667、2.444，均大于1.5，γ-谷氨酰半胱氨酸分離情況較差，分離度為1.143，小于1.5；流動相為10%甲醇時，脫氧蒜氨酸分離情況較好，分離度為3.167，大于1.5，蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸分離情況較差，分離度分別為0.978、0.857，均小于1.0；流動相為20%甲醇時，脫氧蒜氨酸和蒜氨酸分離情況較好，分離度分別為1.792、1.556，大于1.5，γ-谷氨酰半胱氨酸分離情況較差，分離度為1.412，小于1.5。因此，選擇10%甲醇+0.1%磷酸作為流動相，進(jìn)一步比較在該流動相條件下，梯度洗脫和等度洗脫對檢測效果影響。

2.1.2.2 洗脫方式選擇

以10%甲醇+0.1%磷酸為流動相，比較梯度洗脫和等度洗脫兩種方法影響，洗脫條件1:0～15 min，0～15 min10%A+90%B；洗脫條件 2:0～3 min，5%A+95%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，15%A+85%B；洗脫條件3:0～3 min，10%A+90%B；3～5 min，15%A+85%B，5～15 min，20%A+80%B；洗脫條件 4:0～3 min，100%B；3～5 min，10%A+90%B；5～15 min，20%A+80%B；其中，A為甲醇，B為0.1%磷酸水溶液。

選用10%甲醇+0.1%磷酸等度洗脫，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸保留時間分別為3.447，5.647和2.733 min，通過比較發(fā)現(xiàn)此方法出峰時間適宜、峰形好，測定3個成分峰之間分離情況最好。

2.1.3 檢測波長

制備混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，3種待測成分分離度均＞1.5，但3種成分最大吸收波長相差較大，蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸最大吸收波長分別為220、250和300 nm，為兼顧3個化合物檢測靈敏度及甲醇末端吸收，選擇檢測波長為220 nm。

2.2 方法有效性

線性關(guān)系和檢出限測定結(jié)果見表1。由表1可知，蒜氨酸在27.20～275.00 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系；脫氧蒜氨酸在22.40～280.00 μg·mL-1線性關(guān)系良好；γ-谷氨酰半胱氨酸在36.80～368.00 μg·mL-1線性關(guān)系良好。R2分別為0.9992，0.9991和0.9988；當(dāng)信噪比S∶N=3時，蒜氨酸，脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸最低檢出限分別為0.17、0.12 和0.31 μg·mL-1。精密度均≤2.87%，表明精密度良好。方法回收率結(jié)果見表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性參數(shù)Table 1 Lnear parameters of standard curves

表2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery

本方法蒜氨酸回收率均≥92.80%，脫氧蒜氨酸回收率均≥95.47%，γ-谷氨酰半胱氨酸回收率均≥92.00%，3種成分RSD均≤2.35%，表明回收率較高，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 黑蒜樣品測定

依照2.1.1較優(yōu)提取條件對市售黑蒜共7個樣品及原料蒜1個樣品作提取，在上述色譜條件下測定樣品中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量，標(biāo)準(zhǔn)樣品和典型黑蒜樣品中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸測定高效液相色譜圖分別如圖5所示。每個樣品平行測定3次，計算平均值，結(jié)果見表3，樣品編號1～7為市售黑蒜，編號8為原料蒜?？芍?谷氨酰半胱氨酸、蒜氨酸、脫氧蒜氨酸3種成分出峰時間分別為:2.733、3.447、5.647 min。各物質(zhì)在10 min內(nèi)均可達(dá)到完全分離，各成分分離度高，峰型好。表明該方法適合同時檢測分析黑蒜中γ-谷氨酰半胱氨酸、蒜氨酸、脫氧蒜氨酸含量。

表3 樣品含量測定結(jié)果Table 3 Results of determination of the sample content(n=3)(mg·g-1)

由表3可知，在市售黑蒜樣品中均檢測出蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸，其中5號市售黑蒜產(chǎn)品蒜氨酸含量最高，7號市售黑蒜產(chǎn)品蒜氨酸含量最低；1號市售黑蒜產(chǎn)品脫氧蒜氨酸含量最高，6號市售黑蒜產(chǎn)品脫氧蒜氨酸含量最低；7號市售黑蒜產(chǎn)品γ-谷氨酰半胱氨酸含量最高，3號市售黑蒜產(chǎn)品γ-谷氨酰半胱氨酸含量最低。在1號、2號、3號、4號和7號市售黑蒜中，蒜氨酸含量均低于其他兩種硫化物；在5號和6號市售黑蒜中，脫氧蒜氨酸含量均低于其他兩種硫化物；在7種市售黑蒜中，γ-谷氨酰半胱氨酸含量均高于其他兩種硫化物；8號原料蒜中，蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量接近，脫氧蒜氨酸含量最少，且相比于7種市售黑蒜，原料蒜中蒜氨酸含量均高于市售黑蒜，脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸含量均低于市售黑蒜。以上黑蒜中3種硫化物組分差異為生產(chǎn)工藝或原料不同所致，因原料蒜與黑蒜中3種硫化物組分較大差異，后續(xù)將進(jìn)一步探究黑蒜生產(chǎn)過程中蒜氨酸及其硫化物變化。

3 討論與結(jié)論

本研究建立同時檢測黑蒜中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量變化高效液相色譜方法。蒜氨酸、脫氧蒜氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸濃度分別在27.20～275.00、22.40～280.00、36.80～368.00 μg·mL-1下線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.9988～0.9992，檢出限分別為0.17、0.12和0.31 μg·mL-1。本方法蒜氨酸回收率均≥92.80%，脫氧蒜氨酸回收率均≥95.47%，γ-谷氨酰半胱氨酸回收率均≥92.00%，回收率較高。本方法簡便快速、分離效果好、靈敏度高、針對性強(qiáng)，可滿足黑蒜中蒜氨酸及其含硫化合物定性、定量檢測需求。

利用本研究建立黑蒜中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物含量測定方法，可檢測和分析黑蒜生產(chǎn)過程中蒜氨酸及其相關(guān)硫化物，為后續(xù)深入研究黑蒜生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供相應(yīng)理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考，并為黑蒜相關(guān)食品、藥品和保健品行業(yè)篩選優(yōu)質(zhì)黑蒜提供可行評價方法，對延長黑蒜產(chǎn)業(yè)鏈、推動黑蒜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。