γ-谷氨酰轉肽酶基因工程菌的研究進展

胡永彬，徐禮生，孫 玥，于巧玲

(1.新宇藥業(yè)股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltrainspeptidase,EC2.3.2.2)是一種參與谷氨酰循環(huán)的特異性酶。不同生物中的存在位置不同，并且具有一定的特異性。在細菌中γ-谷氨酰轉肽酶存在于周質空間或是分泌到胞外環(huán)境中[2]；哺乳動物細胞內(nèi)，γ-谷氨酰轉肽酶附著在血漿膜的外表面[3]；在植物細胞中，γ-谷氨酰轉肽酶是異源二聚體酶位于非原質體[4-5]。γ-谷氨酰轉肽酶是蛋白前體自主催化分裂成的一個大亞基(～40KDa)和一個小亞基(～20KDa)組成[6]，同時大小亞基相結合的轉肽活力大大高于各自的轉肽活力[7]。γ-谷氨酰轉肽酶可催化谷胱甘肽，使其的γ-谷氨酰基斷裂，轉移至相應的受體分子上[8]，該催化反應有著特異性位點強、不消耗能量等優(yōu)點，因此在催化合成中有著普遍的應用。目前，利用γ-谷氨酰轉肽酶催化已經(jīng)成功生產(chǎn)了γ-谷氨酰-L-多巴[9]、谷胱甘肽[10]、茶氨酸[11]、γ-谷氨酰-L-?；撬醄12]、γ-谷氨酰-D-色氨酸[13-14]、γ-谷氨酰-半胱氨酸[15]等。γ-谷氨酰轉肽酶固定化不僅提高了pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，也提高了對產(chǎn)物親和力[16-19]。同時，γ-谷氨酰轉肽酶在臨床疾病診斷、食品工業(yè)、催化合成藥物或藥物前體、改變一些物質的溶解度和穩(wěn)定性等方面也都起到了重要的作用。

1 γ-谷氨酰轉肽酶的性質

γ-谷氨酰轉肽酶是單獨的大亞基(～40KDa)和小亞基(～20KDa)組成的異源二聚體[20-22]。盡管γ-谷氨酰轉肽酶的產(chǎn)生部位不同，但其反應原理和特異性催化是類似的。經(jīng)過相關酶學知識的探究中，Alton Meiste[23]和相關研究人員表明γ-谷氨酰轉肽酶對γ-谷氨?；衔镉写呋饔?。當γ-谷氨酰轉肽酶催化合成γ-谷氨?；衔飼r，轉肽反應較化學法來說，有顯著的優(yōu)勢，對谷氨酸無需基采用基團的保護與脫保護；催化反應時不會產(chǎn)生消旋體；不需要ATP提供能量；在胞外反應，過程不受細胞質的影響。盡管γ-谷氨酰轉肽酶在反應過程中受pH影響較大，如pH值6～8時一般為水解反應，轉肽反應在發(fā)生在pH值8～9。但是在微生物酶催化合成γ-谷氨?；衔锶杂衅鋬?yōu)勢，該酶在pH大于9.0時依然存在活性，同時還能成功阻止水解反應。來自不同生物體的γ-谷氨酰轉肽酶對溫度的耐熱程度也不相同。于原核生物體內(nèi)，當過高的溫度時γ-谷氨酰轉肽酶沒有活性，如B.subtilis NX-2的γ-谷氨酰轉肽酶，在溫度為60℃的情況下，酶快要完全失去活性。于真核生物內(nèi)，家蠶γ-谷氨酰轉肽酶依次保存在50℃水浴中，經(jīng)過2小時酶活力依然達到正常的91%[24]。

2 γ-谷氨酰轉肽酶的作用機理

γ-谷氨酰轉肽酶是是生物體內(nèi)關鍵酶[25]。γ-谷氨酰轉肽酶利用不同的氨基酸(或肽類)提供γ-谷氨酰基的受體[26]。γ-谷氨酰轉肽酶的底物結構決定了其催化活性，含有γ-谷氨?；Y構的底物先與γ-谷氨酰轉肽酶蘇氨酸(第391位)位點的羥基進行轉酯化作用，生成中間產(chǎn)物谷氨?；?谷氨酰轉肽酶，使底物暴露其氨基[27]。γ-谷氨酰轉肽酶基因是多個啟動子和多個RNA轉錄子序列，其產(chǎn)物蛋白相同，這可能與組織特異性和該酶的進化有關[28]。大腸桿菌k-12菌株γ-谷氨酰轉肽酶由SUZUKIH等人發(fā)現(xiàn)，其成熟過程發(fā)生于周質空間[29-32]。

3 γ-谷氨酰轉肽酶固定化

固定化酶是指在特定載體或區(qū)域上進行固定酶[33]。酶的固定化是在蛋白質固定化的前提下發(fā)展而來的?？赏ㄟ^吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價連接物等方法進行酶固定化。酶經(jīng)過固定化，不僅可以保持酶的活力避免游離酶的存在的不足，從而使酶分子的結構更加穩(wěn)定；還將其與反應物分離，使得生產(chǎn)過程得到控制；同時，經(jīng)過固定化后的酶既有較高的產(chǎn)率、又能夠被多次使用。在現(xiàn)代生物技術和與之相關的工業(yè)化環(huán)節(jié)中，酶的固定化是一項重要的核心技術。20世紀50年代酶固定化技術開始得到研究，到20世紀60年代后期該項技術急速發(fā)展。1970年，我國固定化酶的相關研究也相繼展開，首當其沖的是微生物所和上海生化所。緊接著，各個研究單位也都開始著手于固定化酶和固定化細胞的應用研究[34]。近年來，γ-谷氨酰轉肽酶的固定化也有了很多的研究成果。重組枯草芽孢桿菌中，γ-谷氨酰轉肽酶采用硅烷化改性介孔氧化鈦晶須、介孔氧化鈦晶須等進行固定，提高了固定化酶耐受性[35-38]。

4 γ-谷氨酰轉肽酶的應用

γ-谷氨酰轉肽酶在微生物、植物及動物體內(nèi)普遍存在。來自不同生物體的γ-谷氨酰轉肽酶，催化特性卻是相似的。γ-谷氨酰轉肽酶只特異性催化含γ-谷氨酰的化合物，對生物體內(nèi)氨基酸的轉運有著關鍵的作用。γ-谷氨酰轉肽酶在臨床醫(yī)學診斷上有重要作用，γ-谷氨酰轉肽酶是谷胱甘肽代謝過程的關鍵酶，可特異性催化γ-谷氨?；霓D移反應，在臨床上被用來標志肝膽疾病，在肝病和某些臟器疾病的診斷及預后檢測中起到顯著的作用。如血清γ-谷氨酰轉肽酶的含量可以分析肝臟炎癥的程度，γ-谷氨酰轉肽酶與HbsAg定量檢測，以評估兩者比值來診斷慢性乙型肝炎病人的肝纖維化程度[39]；監(jiān)測心血管疾病和心臟病等病癥的發(fā)生[40-42]；血清γ-谷氨酰轉肽酶水平與反應胰島素抵抗的指標HOMA-C呈正相關，因此γ-谷氨酰轉肽酶經(jīng)過氧化應激機制在糖尿病的發(fā)病機制以及臨床進展中也意義重大[43]。

γ-谷氨酰轉肽酶在催化產(chǎn)生氨基酸衍生物時有關鍵的作用，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和基因工程菌中含有γ-谷氨酰轉肽酶，利用微生物發(fā)酵法獲得該酶，方法簡單、產(chǎn)量較高，通過"γ-谷氨?；?反應合成了谷胱甘肽、茶氨酸、谷氨酰甲胺等，是γ-谷氨酰轉肽酶在生物催化工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良體現(xiàn)。γ-谷氨酰轉肽酶在催化合成藥物或藥物前體有著重要的作用：利用γ-谷氨酰轉肽酶高產(chǎn)菌Bacillus subtilis NX-2發(fā)酵產(chǎn)酶得到的γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，是一種新型的廣譜免疫調(diào)節(jié)類化合物，可以有效地治療在肺結核?。贿\用γ-谷氨酰轉肽酶的水解活性，催化合成的7-氨基頭孢烷酸是生產(chǎn)頭孢菌素的重要原料。此外，γ-谷氨酰轉肽酶在改善某些氨基酸的苦味也有著重要的作用，利用-谷氨酰轉肽酶合成的苯丙氨酸形成的γ-谷氨酰-苯丙氨酸產(chǎn)生了與檸檬相似的鮮爽酸味，改善了氨基酸的苦味。隨著研究的不斷深入，利用γ-谷氨酰轉肽酶基因工程菌，控制單因素發(fā)酵來優(yōu)化其培養(yǎng)基成分、反應的最適溫度、最適pH、金屬離子的促進作用，以增加大腸桿菌谷氨酰轉肽酶基因工程菌的產(chǎn)量，使得γ-谷氨酰轉肽酶的產(chǎn)量擴大，廣泛應用到臨床診斷、食品工業(yè)、催化合成藥物或藥物前體等方面[44]。

5 展望

γ-谷氨酰轉肽酶不僅是生物體內(nèi)一種重要的關鍵酶，同時γ-谷氨酰轉肽酶作為基因工程菌能高效的催化生成谷胱甘肽、茶氨酸等氨基酸，使其在臨床診斷、食品工業(yè)、催化合成藥物或藥物前體等方面起到重要作用，并且通過吸附、離子交換、交聯(lián)、包埋、共價連接物等方法去實現(xiàn)固定化，提高了酶分子結構的穩(wěn)定性和氨基酸的產(chǎn)量。隨著對γ-谷氨酰胺轉肽酶的研究不斷深入，γ-谷氨酰轉肽酶在工業(yè)應用中具有一定價值。