濃厚味γ-谷氨酰肽研究進展、機遇與挑戰(zhàn)

付 余，張宇昊

（西南大學食品科學學院 川渝共建特色食品重慶市重點實驗室 重慶 400715）

流行病學研究表明，長期高鈉鹽飲食不僅會引發(fā)心血管疾病，還會引發(fā)腎結(jié)石、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病等疾病[1]。目前，全球人均食鹽攝入量遠高于世界衛(wèi)生組織（WHO）的人均推薦量（5 g/d），如美國人均每日食鹽攝入量超過10 g，歐洲國家人均每日食鹽攝入量為8～13 g[2]，而我國人均每日食鹽攝入量約為12 g，超出推薦量近1 倍。由此可見，減少膳食中鈉鹽的攝入，有助于降低全民潛在健康風險。食品工業(yè)上目前使用氯化鉀、氯化鈣等非鈉鹽部分替代氯化鈉，易導(dǎo)致食品感官品質(zhì)降低，而“減鹽不減味”是減少膳食鈉鹽攝入的關(guān)鍵。一些食源性肽具有咸味增強作用，其本身沒有咸味，當其與氯化鈉共同攝入時能夠增強味蕾對咸味的感知。有學者對一些咸味增強物質(zhì)進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽是其中關(guān)鍵組分之一。γ-谷氨酰肽是含有γ-谷氨酰殘基的一類小分子肽[3]，可用于增強食物的濃厚味（Kokumi）和持續(xù)性[4]，并與食鹽協(xié)同起到增咸、提鮮的效果[5]，有望為食品工業(yè)減鹽的實施提供全新的思路與策略。

雖然γ-谷氨酰肽因突出的呈味效果逐漸受到關(guān)注，但是在研究與應(yīng)用過程中仍存在許多問題與挑戰(zhàn)。在產(chǎn)物制備方面，γ-谷氨酰肽在自然界中分布廣泛，在動物、植物、微生物中均有檢出，然而，其含量或產(chǎn)率較低，且分布差異較大，如何經(jīng)濟、有效地富集或制備γ-谷氨酰肽，尚缺乏成熟方案。目前常采用一些蛋白酶，如γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷氨酰胺酶等催化制備γ-谷氨酰肽[6]，然而，此方法受限于缺乏高特異性和高活性的食品級蛋白酶，生產(chǎn)效率較低，難以真正用于規(guī)?；氖称饭I(yè)生產(chǎn)中。在呈味構(gòu)效方面，γ-谷氨酰肽的濃度、閾值、C 端氨基酸殘基與濃厚味的強、弱及呈味特性密切相關(guān)，而濃厚味與γ-谷氨酰肽的構(gòu)效關(guān)系尚不明確[7]，造成環(huán)境因素對γ-谷氨酰肽呈味的影響規(guī)律研究難以深入。在呈味機制方面，目前已證實γ-谷氨酰肽是鈣敏感受體（CaSR）的變構(gòu)激動劑，而γ-谷氨酰肽激活CaSR 過程中是否與咸味、鮮味受體之間存在一定的聯(lián)系，且誘發(fā)濃厚味特性與細胞內(nèi)外鈣離子濃度的關(guān)系也尚不明確。在評價方法方面，當前濃厚味的評價方法主要包括感官評價法和CaSR 活性檢測法等[8]，仍缺少較為系統(tǒng)、客觀的評價方法。例如，感官評價法主觀性較強，單獨使用難以實現(xiàn)濃厚味和增味效果的準確評估；CaSR 法主要利用γ-谷氨酰肽激活CaSR，而一些細胞表達CaSR 受體的能力有限，限制了該法的應(yīng)用。

基于此，本文針對γ-谷氨酰肽的制備方法、呈味特性與鈣敏感受體的結(jié)合機制、γ-谷氨酰肽的呈味影響因素以及濃厚味評價方法等方面進行綜述，分析當前的機遇和挑戰(zhàn)，并對未來的研究方向進行展望，旨在為食品工業(yè)中應(yīng)用γ-谷氨酰肽進行減鹽、增味提供理論參考。

1 γ-谷氨酰肽的制備

天然的γ-谷氨酰肽廣泛存在于細菌、動植物及發(fā)酵食品中，而天然食物中的γ-谷氨酰肽含量較低，且分布差異較大。據(jù)報道，意大利魚醬中γ-谷氨酰肽（γ-Glu-Val-Gly）的含量范圍為0.4～12.6 mg/L，醬油中γ-谷氨酰肽的含量范圍為1.5～6.1 mg/L，藍紋奶酪中所有γ-谷氨酰肽的總量僅為3.59 mmol/kg[4]。由此可見，天然γ-谷氨酰肽因含量或產(chǎn)率低，無法滿足工業(yè)化的需要，故定向合成方法成為制備濃厚味γ-谷氨酰肽的主要發(fā)展方向。目前，γ-谷氨酰肽的合成方法主要有生物合成法（如酶法、微生物發(fā)酵法等）和化學合成法。

1.1 酶法

酶法合成是利用酶的催化作用合成γ-谷氨酰肽。目前文獻報道的具有合成γ-谷氨酰肽能力的蛋白酶主要包括谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT，EC 2.3.2.2）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）和谷氨酰半胱氨酸合成酶（E.C.6.3.2.2）。

1.1.1 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyl transpeptidase，GGT）廣泛存在于生物體內(nèi)，是谷胱甘肽（GSH）代謝的關(guān)鍵酶之一，可催化3 種類型的反應(yīng)：水解反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽反應(yīng)和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)（圖1）。具體機制為：1）當親核試劑為水分子時會發(fā)生水解反應(yīng)，同時釋放出游離的谷氨酸；2）如果受體為氨基酸或肽分子時，將發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，生成γ-谷氨酰肽；3）當受體分子同時作為反應(yīng)中的供體和受體時，將會發(fā)生自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。其中，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)都被證明可在體外高濃度的供體（游離谷氨酰胺）基質(zhì)中發(fā)生，生成γ-谷氨酰肽[9]。

圖1 GGT 催化反應(yīng)機制Fig.1 The catalytic reaction mechanism of GGT

目前研究證實，GGT 可用于催化生成多種γ-谷氨酰肽[10]。楊娟[11]研究表明，GGT 的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)最優(yōu)條件為37 ℃、pH 10.0、反應(yīng)時間3 h，最高產(chǎn)率88%。Lin 等[12]對GGT 的固定化進行研究，通過將地衣芽孢桿菌GGT 固定在石墨烯氧化物納米片上合成γ-Glu-Phe 和γ-Glu-Leu，與未固定的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶相比，固定化酶表現(xiàn)出明顯更高的活性，并且產(chǎn)物的產(chǎn)率高于31%。由于谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶屬于轉(zhuǎn)移酶而不是合成酶，不消耗ATP 等能量化合物，具有較高的酶活性，因此該方法在食品工業(yè)中具有大規(guī)模生產(chǎn)γ-谷氨酰肽的應(yīng)用前景。然而，目前食品工業(yè)仍缺乏食品級的高特異性、高活性的γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶，利用合成生物學手段高效表達安全的GGT，是食品級γ-谷氨酰肽制備的發(fā)展方向之一。

1.1.2 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺酶（Glutaminase）是一種能夠合成γ-谷氨酰肽的重要酶制劑。與谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶不同的是谷氨酰胺酶是一種水解酶，它廣泛分布于細菌、酵母菌和真菌等微生物中。除水解作用外，谷氨酰胺酶也具有一定的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶活性[13]。早在20世紀70年代，銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）[14]和大腸桿菌屬（Escherichia coli）[15]來源的谷氨酰胺酶便被報道可催化γ-谷氨酰基供體與其它小分子物質(zhì)結(jié)合生成γ-谷氨酰物質(zhì)；硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）來源的谷氨酰胺酶也具有γ-谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)活性，在谷氨酰胺和羥胺的反應(yīng)體系中，它能夠催化形成γ-谷氨?；惲u肟酸[16]。Tomita 等[17]研究表明米曲霉源谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，并證實谷氨酰胺酶可以催化合成多種γ-谷氨酰肽，例如：γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Val、γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Gly。近年來，也有不少學者通過研究更多微生物源谷氨酰胺酶合成多種γ-谷氨酰肽[18]。Yang等[19-20]利用從淀粉芽孢桿菌和米曲霉獲得的谷氨酰胺酶合成了γ-[Glu]（1≤n≤5）-Phe，并指出其最佳反應(yīng)溫度37 ℃，最佳pH 值為10，以及最佳反應(yīng)時間3 h；研究還發(fā)現(xiàn)，從解淀粉芽孢桿菌中提取的一種谷氨酰胺酶也能催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，它具有合成γ-[Glu]（n=2，3，4）-Val 或γ-[Glu]（n=2，3，4）-Met 的轉(zhuǎn)肽酶活性。本研究團隊利用谷氨酰胺酶分別催化秀珍菇蛋白肽和雞骨蛋白肽合成γ-谷氨酰肽，研究發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化反應(yīng)條件來提升產(chǎn)率空間仍非常有限，最終產(chǎn)率仍較低（最高僅為39.38%），說明谷氨酰胺酶雖可用于生成γ-谷氨酰肽，但其底物特異性差且γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性有限，很難真正用于規(guī)?；a(chǎn)食品級γ-谷氨酰肽。

1.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamyl cysteine synthetase）可催化合成一些γ-谷氨酰肽。Nakayama 等[21]報道從奇異變形桿菌中純化的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在30 ℃時可以合成含半胱氨酸的γ-谷氨酰肽，其中包括γ-Glu-Cys、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ser 和γ-Glu-Hse。然而，此合成酶在催化反應(yīng)過程中需要消耗ATP，且產(chǎn)量受到ADP 和終產(chǎn)物的反饋抑制的影響[11]，因此在γ-谷氨酰肽的制備中使用率不高。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是在特定環(huán)境下，利用某些微生物代謝途徑產(chǎn)生的蛋白酶來催化合成γ-谷氨酰肽的一種方法。Hasegawa 等[22]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸的過程中，在γ-谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶的催化作用下可以合成多種γ-谷氨酰肽。Sofyanovich 等[23]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母除了可以產(chǎn)生GSH 外，還可以催化生成γ-Glu-Val 和γ-Glu-Val-Gly，其中γ-Glu-Val-Gly 是酵母多個重要生理代謝途徑的共有產(chǎn)物，因此它能天然存在于酵母細胞中。Yan 等[24]探究了γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）在羅伊氏乳桿菌LTH5448 合成γ-谷氨酰二肽中的作用，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌中存在3個編碼GCL 的基因，其中羅伊氏乳桿菌中的2 個基因能介導(dǎo)合成γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Cys，并利用其合成具有濃厚味γ-谷氨酰肽的發(fā)酵劑培養(yǎng)物，從而改善發(fā)酵食品的風味。Yang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在一些發(fā)酵食品中也存在羅伊氏乳桿菌中的GCL，可以催化合成具有獨特濃厚味的γ-谷氨酰二肽（γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Cys）。對于發(fā)酵類調(diào)味品，可以通過引入特定微生物菌種參與發(fā)酵，靶向提升產(chǎn)品中γ-谷氨酰肽含量，進而有助于開發(fā)富含γ-谷氨酰肽的低鹽增味調(diào)味品。然而，從γ-谷氨酰肽制備的角度，尚缺乏以γ-谷氨酰肽制備為目的的發(fā)酵菌種及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究。目前主要使用誘變育種和基因工程手段提高GSH 的產(chǎn)率，雖然發(fā)酵效率有所提高，但是其產(chǎn)率最高也不超過20%。通過菌種改造獲得γ-谷氨酰肽高產(chǎn)菌株，可能成為未來研究需要攻克的難題。

1.3 化學合成法

化學合成法是以氨基酸為原料，通過對活性基團進行保護或者屏蔽來實現(xiàn)目標產(chǎn)物的γ-谷氨酰基化，常用于合成高純度的γ-谷氨酰肽。Amino 等[26]通過γ-谷氨酰基的N-α-苯氧羰基保護，以Glu、Val 和Gly 殘基為主鏈依次縮合制備γ-Glu-Val-Gly，然而，該方法存在操作復(fù)雜，產(chǎn)物易產(chǎn)生消旋體，分離難度大，產(chǎn)率低，成本高等缺點，而且在制備過程中需要使用過量的偶聯(lián)劑和?；噭菀讓?dǎo)致環(huán)境污染。這種方法不適用于食品級γ-谷氨酰肽工業(yè)化水平的大規(guī)模生產(chǎn)，然而，其可用于γ-谷氨酰肽的構(gòu)效研究，為進一步闡明γ-谷氨酰肽呈味機理提供支撐。

2 γ-谷氨酰肽的呈味分子機制

γ-谷氨酰肽可以提高基本呈味物質(zhì)的呈味強度，在食物中加入此類肽會增加食物的鮮咸味及濃厚味[27]，然而，當γ-谷氨酰肽的添加量過高時又會引起濃厚味強度的減退[5]。隨著對γ-谷氨酰肽呈味特性研究的深入，現(xiàn)已證實γ-谷氨酰肽的濃厚味受體為鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR），且濃厚味的味覺強度與其激活CaSR的能力呈正相關(guān)[28]，因此從γ-谷氨酰肽與CaSR結(jié)合的角度，深入挖掘濃厚味的呈味機理，可為γ-谷氨酰肽的呈味分子機制研究提供理論參考。

2.1 γ-谷氨酰肽與CaSR 的結(jié)合機制

CaSR 是C 家族G 蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptor，GPCR）的一種，屬于細胞外氨基酸傳感器家族。類似于其它C 類G 蛋白偶聯(lián)受體，CaSR 識別配體的關(guān)鍵位點存在于一個大的N末端Venus Flytrap 結(jié)構(gòu)域（VFT），此結(jié)構(gòu)域由2個區(qū)域（LB1 和LB2）組成。此外，CaSR 還包含一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（Cysteine-rich，CR），它將VFT 模塊連接到跨膜區(qū)域，是受體激活所必需的途徑[29]。L 型氨基酸以及γ-谷氨酰肽也都是通過與VFT 結(jié)合區(qū)域結(jié)合激活CaSR，并通過T145A/S170T 雙突變體的共同機制發(fā)揮作用，可能占據(jù)受體VFT 結(jié)構(gòu)域的重疊結(jié)合位點[30]。

2.2 信號傳導(dǎo)機制

味覺受體細胞（Taste receptor cell，TRC）是味蕾的組成成分，主要分為4 種類型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型（Ⅳ型細胞數(shù)量不足2%）。其中，Ⅱ型細胞中含有G 蛋白偶聯(lián)受體T1Rs 和T2Rs，甜味、苦味和鮮味是由GPCRs 介導(dǎo)的，異二聚體受體T1Rs負責鮮味（T1R1/T1R3）和甜味（T1R2/T1R3），而T2Rs 是苦味味覺受體；CaSR 在Ⅱ、Ⅲ型2 種細胞中都有表達，且主要在Ⅲ型細胞中表達[31]。如圖2所示，CaSR 主要在II 型細胞中與腔膜上的T2Rs共同表達，并對苦味（例如Ca2+或苯甲地那銨）和濃厚味（L-氨基酸或γ-谷氨酰胺）的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用。具體而言，激活CaSR 同源二聚體或CaSR/T2R 異源二聚體，會促使通過磷脂酶（PLC）依賴性途徑增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，最終促進細胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)ATP 至細胞外[28]，而CaSR 激動劑可直接激活表達在味覺受體細胞表面的CaSR，進而通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）反饋到大腦[27]。

鮮味物質(zhì)谷氨酸鈉和濃厚味物質(zhì)GSH 可分別與II 型細胞膜上的T1Rs 和CaSR 結(jié)合，通過相似途徑增強Ca2+的釋放，提高細胞動作電位并促進ATP 的釋放，以實現(xiàn)增強鮮味的效果。在III 型細胞中（圖2），γ-谷氨酰肽激活頂端的CaSR 后，通過PLC 依賴的信號通路誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，同時III 型細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加與5-羥色胺（5-HT）的釋放有關(guān)，而5-HT 會抑制II 型細胞中ATP 的釋放，它們所產(chǎn)生的味覺信號互有影響。表達CaSR 的味覺受體細胞可以作為濃厚味的評價模型，在鮮味物質(zhì)存在的情況下，γ-谷氨酰肽的鮮味增強作用是否依賴于CaSR 的激活而發(fā)生，目前尚不清楚，有待進一步研究[32]。

圖2 CaSR 在味覺細胞中的作用途徑[28]Fig.2 The role of CaSR in taste cells[28]

3 濃厚味γ-谷氨酰肽的呈味影響因素

γ-谷氨酰肽的濃厚味特性其實在很大程度上受不同因素的影響，如N 端氨基酸殘基的差異會使γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)出不同的濃厚味特性，濃度和pH 值等環(huán)境因素也會影響呈味效果。因此，原料來源、應(yīng)用的食品體系以及γ-谷氨酰肽濃度閾值不同，均會造成濃厚味產(chǎn)生較大差異。本節(jié)針對影響γ-谷氨酰肽濃厚味的因素進行綜述，為γ-谷氨酰肽在不同食品體系中的科學應(yīng)用提供理論參考。

3.1 呈味構(gòu)效

γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)與其對CaSR 的激活能力密切相關(guān)，而γ-谷氨酰肽激活CaSR 的能力與濃厚味強度呈正相關(guān)[33]。明確γ-谷氨酰肽的呈味構(gòu)效關(guān)系有助于厘清不同γ-谷氨酰肽的濃厚味呈味特點，進而篩選適合在不同食品體系中應(yīng)用γ-谷氨酰肽。Amino 等[34]報道，具有以下結(jié)構(gòu)特點的γ-谷氨酰肽能夠有效激活CaSR：1）在N 末端存在1 個γ-L-谷氨酰殘基；2）當?shù)? 個殘基為中等分子量，含有1～3 個C 或者含有2 個C 和1 個O 或S 原子的脂肪族中性取代基（如Val、Leu 等），并且為L 構(gòu)型；3）第3 個殘基的存在，特別是存在C末端的羧酸且沒有側(cè)鏈的殘基（如Gly），將會呈現(xiàn)出較強CaSR 的激活能力，許多研究結(jié)果也證明了以上構(gòu)效規(guī)律。Ohsu 等[27]研究表明，γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Cys 和GSH（γ-Glu-Cys-Gly）均具有激活CaSR 的能力。此外，Amino 等[34]研究發(fā)現(xiàn)多種含硫氨基酸的γ-谷氨酰肽也具有激活CaSR 的能力，且具有較強的濃厚味。如表1所示，γ-L-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酰甘氨酸的CaSR 激活能力，而該結(jié)構(gòu)也滿足上述對于表現(xiàn)強效的CaSR 激活能力的結(jié)構(gòu)要求。相反，γ-L-谷氨酰-L-蛋氨酸、γ-L-谷氨酰-S-（正丙基）-L-半胱氨酸、γ-L-谷氨酰-S-（2-丙烯基）-L-半胱氨酸和γ-L-谷氨酰-S-（2-丙烯基）-L-半胱氨酸亞砜擁有分子量更大的側(cè)鏈基團，然而，在CaSR 活性評價中未展現(xiàn)其活性。由此可以推測γ-谷氨酰肽和CaSR 相互結(jié)合以表達活性時，對于γ-谷氨酰肽的空間結(jié)構(gòu)要求十分嚴格。Amino 等[35]還發(fā)現(xiàn)若將硫化物轉(zhuǎn)化為極性官能團，如亞砜基團，會阻礙γ-谷氨酰肽和CaSR 的相互作用，并且發(fā)現(xiàn)α-L-谷氨酰肽不能激活CaSR 受體，進一步佐證了γ-L-谷氨酰殘基對于呈現(xiàn)強效CaSR 激活能力的結(jié)構(gòu)依賴性。

表1 含硫氨基酸的γ-谷氨酰肽的CaSR 激活能力[35]Table 1 CaSR activity of sulfur amino acid-containing γ-glutamyl peptides[35]

3.2 其它因素

γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)決定其濃厚味的效果，不同食品體系下呈味物質(zhì)組成、pH 值等因素會影響γ-谷氨酰肽對CaSR 的激活效果等，造成γ-谷氨酰肽在實際食品應(yīng)用中呈現(xiàn)出的濃厚味不同。對于濃厚味γ-谷氨酰肽的產(chǎn)生，一些呈味物質(zhì)具有協(xié)同作用，將γ-谷氨酰肽添加到如氯化鈉、谷氨酸鈉或雞湯等風味基質(zhì)中，γ-谷氨酰肽的濃厚味檢測閾值顯著降低，并且顯著增強了風味基質(zhì)的復(fù)雜口感、滿口感和持續(xù)口感。Dunkel 等[36]通過感官評價法發(fā)現(xiàn)在雞湯溶液中，γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys-β-Ala、γ-Glu-Cys-Gly 的濃厚味（復(fù)雜口感、滿口感、延綿感）閾值分別為0.8，0.4，0.2，0.2 mmol/L，并發(fā)現(xiàn)γ-Glu-Cys-β-Ala 加入谷氨酸和氯化鈉的混合溶液后，閾值下降約32倍，在加入低脂花生醬、低脂奶油凍中也會產(chǎn)生類似的效果[37]。此外，γ-谷氨酰肽加入基質(zhì)的pH 值也會影響濃厚味的強度。Simone 等[38]利用感官評價法鑒定γ-谷氨酰肽在pH 值分別為4.7，5.7，6.7，7.7 時的濃厚味強度；當pH 值為6.7 時，γ-谷氨酰肽的濃厚味強度最強，當pH 值為5.7 時強度次之，然而，在較低pH 值（4.7）和較高的pH 值（7.7）下均未觀察到明顯的濃厚味，這表明γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)的濃厚味強度強烈依賴于pH 值。由于γ-谷氨酰肽本身不具有基本味，只有在含有呈味物質(zhì)的體系中才能體現(xiàn)出呈味效果，因此γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)濃厚味的能力不僅受自身結(jié)構(gòu)和濃度的影響，還與其應(yīng)用的食品體系環(huán)境有關(guān)，環(huán)境因素對γ-谷氨酰肽呈味特性的影響規(guī)律有待進一步研究。

4 γ-谷氨酰肽濃厚味的評價方法

由于γ-谷氨酰肽不僅賦予食物醇厚、持續(xù)的味覺感受特性，還增強基本呈味物質(zhì)的呈味強度，因此判斷和評價濃厚味強度是研究γ-谷氨酰肽的必要前提。目前，評價γ-谷氨酰肽及其增味效果的方法主要有感官評價法、CaSR 法和電子舌法，如表2所示。加強對γ-谷氨酰肽的濃厚味的評價研究并制定科學有效的評價方法，對于γ-谷氨酰肽的高效制備及食品工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

表2 濃厚味γ-谷氨酰肽及其增味效果的評價方法Table 2 Methods for assessing kokumi γ-glutamyl peptides and their taste-enhancing effects

4.1 感官評價法

感官評價是通過視覺、嗅覺、觸覺、味覺和聽覺感知來測定和分析待測樣品的分析方法[39]，是一種常見的評定γ-谷氨酰肽賦予食物濃厚味的方法。早在1997年，Ueda 等[40]首次提出γ-谷氨酰肽——GSH 的感官評價方法，他們測定了水和鮮味溶液中GSH 的閾值及其對基本味覺（酸、甜、苦、咸、鮮）的調(diào)節(jié)能力。隨后，該法又經(jīng)研究學者的補充和完善，被廣泛應(yīng)用于濃厚味物質(zhì)的評價中。

評價過程如下[41]：1）感官鑒評訓(xùn)練，通過讓感官鑒評人員品嘗一系列代表酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味的基礎(chǔ)溶液，使他們對這些味覺具有準確的認識，并用描述性語言進行表達。2）鑒評試驗，將不同濃度的待測物質(zhì)溶解于含有2 種以上的呈味物質(zhì)體系中（可采用空白雞湯或肉湯），讓鑒評人員品嘗并通過評分法（0～10 分依次表示味覺強度從無到非常強烈），從酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味等方面對待測樣品進行打分。3）匯總品嘗相同溶液鑒評人員的結(jié)果并采用統(tǒng)計學方法進行分析，給出描述性感官評價結(jié)果。

探究γ-谷氨酰肽的閾值濃度也可采用感官評價法。味覺閾值濃度主要通過味覺濃度或稀釋分析的三角形試驗來確定[10]。感官評鑒小組需在其它2 個空白樣品之外正確識別出待測樣品，并以評鑒人員能夠區(qū)分該差異的最小濃度作為待測物質(zhì)的味覺閾值。例如，Liu 等[42]利用該法測定γ-Glu-Val-Gly 的味覺識別閾值濃度為1.55 μmol/L。此外，一些研究學者也通過感官評價法來評價γ-谷氨酰肽基礎(chǔ)味的調(diào)節(jié)能力，即在基礎(chǔ)味溶液中考察額外添加的濃厚味肽改變基礎(chǔ)味的強度（例如氯化鈉溶液中的咸味）[43]。

4.2 CaSR 法

目前，常用卵母細胞或人胚腎細胞HEK-293作為CaSR 受體細胞模型來評估γ-谷氨酰肽的受體激活情況。Amino 等[34]采用卵母細胞進行評價的方法如下：從非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵巢中制備卵母細胞，然后將人源CaSR 的互補RNA（cRNA）轉(zhuǎn)導(dǎo)至卵母細胞中。當卵母細胞中表達的CaSR 被激活時，會導(dǎo)致細胞間Ca2+增加，激活內(nèi)源性鈣離子依賴性Na+通道并產(chǎn)生電流。在含有CaSR 激活劑的緩沖液中培養(yǎng)卵母細胞時，可通過細胞兩極的電流來表征激活劑的激活效果，記錄的電流峰值與CaSR 被激活的強度相關(guān)[34]。HEK-293 細胞法則將人源CaSR 的cDNA 構(gòu)建于表達載體pcDNA3.1 上，并迅速轉(zhuǎn)染到HEK-293 細胞中，在含有待測物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用鈣離子指示劑或鈣離子染料染色。當HEK-293 細胞中表達的CaSR 被激活后，細胞間Ca2+濃度會增加，此時，鈣離子染料會與游離的Ca2+結(jié)合，從而導(dǎo)致染料熒光強度增加，因此可通過檢測熒光強度評估各種待測樣品的CaSR 激活能力及其濃度依賴性[27]。Broadhead 等[30]在表達CaSR 的HEK-293 細胞中評價了γ-谷氨酰肽對鈣離子依賴的細胞內(nèi)的鈣調(diào)動的影響，研究發(fā)現(xiàn)S-甲基谷胱甘肽、谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly）、γ-L-谷?；?L-丙氨酸（γ-Glu-Ala）和γ-L-谷?；?L-半胱氨酸（γ-Glu-Cys）都是非常有效的CaSR 正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，可以顯著促進鈣離子依賴的鈣調(diào)動，它們的EC50值分別為1.7，3.9，4.7，4.8 μmol/L，且促進鈣激活的能力排序為S-甲基谷胱甘肽＞γ-Glu-Cys-Gly＞γ-Glu-Ala＞γ-Glu-Cys。該結(jié)果再次表明γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)、肽序列及肽鏈長度對CaSR 的激活能力以及濃厚味強度都有影響，然而，其確切的構(gòu)效關(guān)系有待進一步闡明。

與感官評定法相比，CaSR 法的時間和人力消耗少，由于CaSR 法基于細胞實驗，此方法不需要對檢測樣本設(shè)定嚴格的食品級原料要求，因此比較適用于大規(guī)模檢測。然而，CaSR 法的結(jié)果需進一步通過感官評定法驗證。由于許多CaSR 激活劑并不是濃厚味物質(zhì)[32]，并且細胞有限的表達能力和復(fù)雜的細胞培養(yǎng)環(huán)境都對CaSR 法的大規(guī)模應(yīng)用形成限制[7]，因此，目前CaSR 法一般用于對待測物質(zhì)的初步篩選[41]。

4.3 電子舌

電子舌（Electronic tongue）是通過模仿人體味覺機理制成的新型分析儀器，目前被廣泛應(yīng)用于食品、調(diào)味品、中藥及中成藥等領(lǐng)域。與人工的感官評價相比，電子舌更客觀、靈敏、不易疲勞，可同時用于多種樣本的測定。然而，對于濃厚味這種特征性味道，其復(fù)雜的呈味特性超出了電子舌檢測的能力。目前，主要使用電子舌結(jié)合人工感官方法評價厚味肽對于基礎(chǔ)溶液的增咸、增鮮效果。Yan等[44]對具有濃厚味的豌豆蛋白肽進行電子舌及感官分析，發(fā)現(xiàn)在0.5%NaCl 溶液中加入肽產(chǎn)物后，咸度及鮮味響應(yīng)值均顯著增加，說明這些小肽不僅具有濃厚感特征的醇厚、圓潤的感覺，還可能對咸味和鮮味起到增強作用。Zhang 等[45]也利用電子舌、人工感官等方法對河豚中的關(guān)鍵味覺活性成分通過味覺重構(gòu)、遺漏和添加試驗確定其中的關(guān)鍵物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)兩種味覺活性肽Pro-Val-Ala-Arg-Met-CysArg（PR-7）和Tyr-Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val（YV-8） 是引起典型濃厚味的關(guān)鍵化合物，并在接近中性pH（6.5～8.0）時，具有顯著鮮味增強作用[46]。除此之外，有學者通過感官分析和電子舌技術(shù)驗證了典型的濃厚味γ-谷氨酰肽的鮮味增強作用[47-48]。綜上所述，感官評價法、CaSR 法和電子舌可為濃厚味的特征和定量測定提供一定評價依據(jù)，然而，每種方法單獨用于濃厚味評價都不足以獲得有說服力的結(jié)論，尚需采用幾種方法聯(lián)合評價，方能得到相對客觀的結(jié)果。

5 挑戰(zhàn)與展望

目前，高鈉鹽攝入是我國居民膳食方面潛在風險之一。γ-谷氨酰肽不僅能夠增強食品的呈味強度，具有潛在的生理調(diào)節(jié)功能，而且在工業(yè)化食品減鹽領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前γ-谷氨酰肽的研究還存在如下挑戰(zhàn)：

1）目前酶法制備γ-谷氨酰肽的生物酶制劑主要有谷氨酰胺酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，然而，由于谷氨酰胺酶受體的轉(zhuǎn)移活性較低，難以用于γ-谷氨酰肽的工業(yè)化生產(chǎn)；谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成γ-谷氨酰肽還處于實驗室水平，具有高產(chǎn)量的優(yōu)良菌株還有待開發(fā)?？梢越Y(jié)合酶工程修飾與改造技術(shù)建立高效表達的酶制劑，并結(jié)合固定化酶技術(shù)，增強其特有的催化作用及回收率，篩選出高活性的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，為實現(xiàn)食品領(lǐng)域中γ-谷氨酰肽低成本、高產(chǎn)量的工業(yè)化生產(chǎn)提供前期基礎(chǔ)。

2）除γ-谷氨酰肽外，CaSR 還有其它已知的激動劑，例如：乳酸鈣、魚精蛋白、聚賴氨酸和L-組氨酸，也可賦予食品濃厚味。然而，目前幾乎未見γ-谷氨酰肽與其它CaSR 激動劑之間協(xié)同作用的研究。未來研究可以探究不同CaSR 激動劑結(jié)合所產(chǎn)生的協(xié)同作用，為濃厚味食品更高效、高質(zhì)的生產(chǎn)提供新思路。

3）γ-谷氨酰肽不僅賦予食物濃厚味，還增強基本呈味物質(zhì)的鮮、咸味強度。γ-谷氨酰肽與鈣敏感受體相互作用產(chǎn)生濃厚味的同時，與II、III 型TRC 產(chǎn)生的味覺信號互有影響，這些細胞間的信號交流是否影響鮮味與咸味，目前尚不清楚。通過γ-谷氨酰肽的計算機模擬分析，根據(jù)同源性建模、分子動力學等策略，可從分子層面闡明呈味機制及其與呈味物質(zhì)的相互作用。

4）γ-谷氨酰肽的濃厚味強度隨肽鏈長度的增加而降低，濃厚味γ-谷氨酰肽大多是由2～5 個氨基酸組成的小肽，而C 端氨基酸殘基不同的γ-谷氨酰肽，其呈味特性和濃厚味味覺閾值也存在差異。目前γ-谷氨酰肽的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，進一步加強γ-谷氨酰肽構(gòu)效方面的研究，可為新型γ-谷氨酰肽的設(shè)計、制備提供思路。

5）目前檢測濃厚感的方法復(fù)雜繁瑣，且客觀性和準確性不足，很難做到對濃厚感強度的精準定量評價。利用感官評價法、分子對接技術(shù)及CaSR 活性檢測法3 種方法聯(lián)合評價γ-谷氨酰肽與CaSR 受體的相互作用，有望實現(xiàn)γ-谷氨酰肽的準確評價和篩選。

6 結(jié)論

作為一種新型的呈味肽，γ-谷氨酰肽逐漸受到關(guān)注。γ-谷氨酰肽賦予食物濃厚味并增強基本呈味物質(zhì)的呈味強度，尤其是在減少食鹽用量的情況下起到增咸、提鮮的效果，有望作為食品工業(yè)減鹽的全新原料。目前人工制備γ-谷氨酰肽主要通過谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和谷氨酰胺酶進行酶法催化合成。檢測γ-谷氨酰肽的濃厚味主要使用感官評價法和CaSR 活性檢測法，其呈味能力與其呈味閾值、樣品中的濃度和γ-谷氨酰肽的空間結(jié)構(gòu)有較大關(guān)系。至今，我國對γ-谷氨酰肽的研究開發(fā)仍處于初步階段，還需加強對γ-谷氨酰肽的制備方法、呈味機制、構(gòu)效關(guān)系及呈味評價等方面的研究。

致謝：

感謝安琪酵母股份有限公司劉政芳對本文的幫助和建議。