牦牛和犏牛MEISETZ基因克隆及生物信息學(xué)分析

向 婭，柴志欣，武志娟，王吉坤，鐘金城

（1.青藏高原生態(tài)畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

牦牛（Bos grunniens）是分布于青藏高原高寒草地的主要畜種資源，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民提供賴(lài)以生存的生產(chǎn)生活資料，為重要經(jīng)濟(jì)畜種[1]。牦牛生產(chǎn)性能低于其他牛種。近年來(lái)，為提高牦牛生產(chǎn)性能，利用牦牛與普通牛種間雜交改良，以提高雜種F1代犏牛產(chǎn)肉和產(chǎn)奶量，犏牛對(duì)海拔3 000 m以上高寒草地氣候環(huán)境有良好適應(yīng)性，表現(xiàn)雜交優(yōu)勢(shì)[2-3]。因種間遺傳隔離的影響，母犏牛生殖能力正常，公犏牛因生精機(jī)能紊亂而不育，限制犏牛雜種優(yōu)勢(shì)和牦牛遺傳資源利用。研究顯示，犏牛雄性不育主要特征為精子發(fā)生受阻，即雄性犏牛性腺發(fā)育不良或減數(shù)分裂及精子發(fā)生存在障礙[4]，而減數(shù)分裂中多樣性異常主要由兩牛種遺傳基礎(chǔ)或遺傳結(jié)構(gòu)差異造成。

PRDM9是已鑒定的有助于分離兩個(gè)脊椎動(dòng)物物種繁殖障礙的基因[5]，該基因編碼的蛋白質(zhì)是具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的鋅指蛋白，可在減數(shù)分裂前期催化組蛋白-H3-賴(lài)氨酸4-三甲基轉(zhuǎn)移酶（H3K4me3）。該蛋白質(zhì)包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如SET（PR/SET）域的子類(lèi)、一個(gè)串聯(lián)C2H2鋅指等。鋅指（Zinc finger,ZF）基因家族編碼具有鋅指模序的轉(zhuǎn)錄因子，可有效調(diào)控與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)。研究表明，MEISETZ（Meiosis-induced factor containing a PR/SET domain and zinc-finger motif）為調(diào)控早期減數(shù)分裂基因表達(dá)候選基因，可編碼減數(shù)分裂特有H3K4me3，為小鼠同源染色體之間減數(shù)分裂重組所必需，在小鼠生殖細(xì)胞譜系減數(shù)分裂前期正常進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，具有突變型MEISETZ基因的雄性小鼠睪丸較小，睪丸中無(wú)圓形精子、細(xì)長(zhǎng)精子或精子[7]。MEISETZ編碼的氨基酸序列，在N端部分具有PR結(jié)構(gòu)域，C端部分具有C2H2型鋅指基序[7]，其氨基酸序列與人類(lèi)PRDM9有較高同源性（72%），尤其是在PR結(jié)構(gòu)域（93%）。組蛋白調(diào)控基因表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)后天修飾說(shuō)明MEISETZ是一種減數(shù)分裂誘導(dǎo)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，在減數(shù)分裂早期特異性表達(dá)，且僅在精子細(xì)胞進(jìn)入雌性胚胎生殖腺的減數(shù)分裂早期和新生兒睪丸組織中檢測(cè)到MEISETZ基因轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)物[6]。對(duì)大鼠MEISETZ減數(shù)分裂細(xì)胞分析顯示，因嚴(yán)重?fù)p害斷裂DNA雙鏈修復(fù)途徑、同源染色體配對(duì)及性小體形成，阻礙減數(shù)分裂進(jìn)程，導(dǎo)致兩性不育[6]。

犏牛作為牦牛和普通牛雜交后代，其雄性不育原因可能與MEISETZ基因序列差異具有一定相關(guān)性，目前尚未見(jiàn)牦牛、犏牛MEISETZ基因相關(guān)報(bào)道。因此選取MEISETZ作為目的基因，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)牦牛、犏牛MEISETZ編碼區(qū)克隆，預(yù)測(cè)分析核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)，旨在從分子水平探索MEISETZ基因相關(guān)特性，為開(kāi)展犏牛雄性不育相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

樣品采集于青海省大通種牛場(chǎng)，選取雄性犏牛（1歲1頭，2歲3頭，3歲2頭）共6頭，在四川省九龍縣選取成年公牦牛3頭（7歲），去勢(shì)手術(shù)后迅速采集睪丸組織，DEPC水沖洗后，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)試劑

GoldViewTM核酸染料；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time））、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自AxyGENE公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker 2000購(gòu)自Tiangen公司。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

TRIzol法提取牦牛、犏牛睪丸組織總RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及OD260nm/OD280nm值，A260/A280在1.8～2.0時(shí)方可采用；配制1.5%瓊脂糖凝膠，加入適量GoldViewTM核酸染料，120 V，15 min后，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量。以提取總RNA樣品為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表MEISETZ基因（Gen-Bank accession NO.:XM_589388）核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物:5'AACCGCTCAGCCCTCACTCT 3'（正向），5'TCCTTGACCTCACGACCCTC 3'（反向）。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 MEISETZ基因克隆測(cè)序

PCR反應(yīng)體系（25 μL）:上下游引物各1 μL，cDNA 模板 1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸35 s，33個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min；4℃保存。凝膠電泳檢測(cè)并純化回收PCR產(chǎn)物，4℃存放。

按照pGEM-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后，均勻涂布在含Amp+LB固體培養(yǎng)基表面，37℃倒置培養(yǎng)10～12 h；挑取白色單克隆菌落，篩選陽(yáng)性菌液，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 提取質(zhì)粒與酶切鑒定

根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒加入配制的PCR反應(yīng)液中，作PCR鑒定，反應(yīng)體系和程序分別與RT-PCR中反應(yīng)體系、程序相同。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將已提取的質(zhì)粒DNA用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切體系為:去離子水7 μL，質(zhì)粒DNA 5 μL，HindⅢ 1 μL，EcoRⅠ1 μL，1×M Buffer 4 μL，37℃水浴1 h。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 生物信息學(xué)分析

分析牦牛、犏牛MEISETZ基因CDS區(qū)序列，預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)及功能（見(jiàn)表1）。

表1 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具Table 1 Protein sequence data analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用分光光度法測(cè)定本試驗(yàn)中獲得的RNA樣品，OD260/OD280≈2.0；經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，存在5 S、18 S和28 S條帶且條帶清晰（見(jiàn)圖1A），說(shuō)明RNA質(zhì)量較高，滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。

為得到MEISETZ基因CDS區(qū)，以牦牛、犏牛睪丸組織cDNA為模板PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致單一清晰條帶，長(zhǎng)度均為688 bp（見(jiàn)圖1B）。參照DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收PCR產(chǎn)物，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.2 重組子鑒定

挑取白色單一菌落，置于含Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)4～6 h，提取質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，所提取質(zhì)粒成功擴(kuò)增目的條帶（見(jiàn)圖2A）。初步證明目的基因片段已重組到pGEM-T載體上。

將提取的重組質(zhì)粒pGEM-T Vector-MEISETZ用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ酶切消化，消化產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2B所示，得到2 692 bp載體序列和目的片段，說(shuō)明目的片段正向插入pGEM-T載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.3 序列比對(duì)

經(jīng)克隆測(cè)序獲得牦牛（GenBank accession No.:EF432551）、犏牛（GenBank accession NO.:EF432552）MEISETZ基因CDS區(qū)序列長(zhǎng)度均為668 bp，編碼222個(gè)氨基酸殘基。將牦牛、犏牛與GenBank中人（GenBank accession No.:DQ388610）、小鼠 （Gen-Bank accession No.:BC023014）相應(yīng)基因核苷酸序列比對(duì)（見(jiàn)圖3），結(jié)果表明，牦牛與犏牛序列相比，共有4處發(fā)生堿基變異，分別位于第270、431、611、648位點(diǎn)，一致性為99.4%；牦牛與人序列相比，共有121處發(fā)生堿基變異，一致性為81.9%；牦牛與小鼠序列相比，共有161處發(fā)生堿基變異，一致性為74.8%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Mega 7.0軟件分析牦牛、犏牛、水牛、人類(lèi)、小鼠MEISETZ基因氨基酸序列（見(jiàn)圖4）。結(jié)果表明，犏牛與牦牛聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最近，其次是人類(lèi)和小鼠，與水牛親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

2.5.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

使用軟件ExPASy-ProtParam預(yù)測(cè)牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性質(zhì)。牦牛和犏牛MEISETZ基因分子質(zhì)量分別為25.081和25.098 ku；蛋白等電點(diǎn)均為5.66，為偏酸性蛋白；帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）均為30個(gè)，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）均為24個(gè)，其中絲氨酸（Ser）數(shù)量最多，均為23個(gè)，占比10.4%，甲硫氨酸（Met）含量最少，均為1個(gè)，且除丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）含量有差別外，其余氨基酸含量均相同；不穩(wěn)定指數(shù)分別為48.21、47.68，高于閾值40，表明牦牛和犏牛MEISETZ蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)分別為65.9、65.45，說(shuō)明牦牛、犏牛該蛋白流動(dòng)性好；總平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.829、-0.848，結(jié)合ExPASy-ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白中大多數(shù)氨基酸為親水性，屬于親水性蛋白。

2.5.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線(xiàn)軟件ExPASy-SOPMA預(yù)測(cè)牦牛、犏牛MEISETZ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。

牦牛、犏牛該蛋白均含有α-螺旋（Hh）、無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）、β-轉(zhuǎn)角（Tt）和延伸鏈（Ee），其中牦牛、犏牛無(wú)規(guī)則卷曲含量均最高，共135、124處，分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的60.81%、55.86%，β-轉(zhuǎn)角含量均最低，僅4.5%。

采用ExPASy-SWISSMODEL在線(xiàn)軟件，選取與氨基酸序列相似性最高序列，基于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（見(jiàn)圖6）。

結(jié)果顯示，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均與4c1q.1模型相似性高達(dá)84.96%，三級(jí)結(jié)構(gòu)均以無(wú)規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.5.3 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用NCBI-CD Search預(yù)測(cè)牦牛、犏牛MEISETZ蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖7）。結(jié)果顯示，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均含有SET超家族結(jié)構(gòu)域，Trithorax（SET）結(jié)構(gòu)域超家族對(duì)應(yīng)于含有SET結(jié)構(gòu)域的賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)真核生物中基因激活和沉默的表觀遺傳調(diào)控至關(guān)重要。已證明SET域介導(dǎo)與雙特異性磷酸酶（dsPTPases）相似的蛋白質(zhì)家族相互作用。該蛋白與PR域鋅指蛋白7（PRDM7）和9（PRDM9）發(fā)現(xiàn)的PR-SET域高度重合。

2.5.4 跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

ExPASy-TMHMM預(yù)測(cè)表明牦牛、犏牛該蛋白氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy-TMPred在線(xiàn)軟件分析發(fā)現(xiàn)，牦牛和犏牛MEISETZ蛋白包含2個(gè)較高可能的跨膜螺旋，無(wú)跨膜蛋白。牦牛、犏牛MEISETZ蛋白信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MEISETZ蛋白無(wú)信號(hào)肽，均為非分泌型蛋白。

2.5.5 磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在線(xiàn)軟件NetPhos預(yù)測(cè)顯示，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均包含31個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中Ser磷酸化位點(diǎn)均為20個(gè)，4個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)（第6、46、61、180位），7個(gè)Tyr磷酸化位（第56、67、69、83、126、189、206位）。

分別利用在線(xiàn)軟件ExPASy中NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)O、N糖基化位點(diǎn)。分析結(jié)果表明，牦牛MEISETZ蛋白含有14個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，犏牛MEISETZ蛋白存在12個(gè)O-糖基化位點(diǎn)；牦牛、犏牛均在第1位檢測(cè)到1個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，由于無(wú)信號(hào)肽的蛋白質(zhì)不可能暴露于N-糖基化機(jī)制，即使該蛋白包含潛在的糖基化位點(diǎn)，也不可能在體內(nèi)被糖基化。

2.5.6 亞細(xì)胞定位

利用PSORTⅡPrediction在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)牦牛、犏牛MEISETZ蛋白功能，結(jié)果顯示，MEISETZ蛋白主要定位于細(xì)胞核（73.9%）中，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外（包括細(xì)胞壁）中均占8.7%，4.3%分布于線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶。

2.5.7 蛋白互作分析

STRING分析發(fā)現(xiàn)，PRDM9與SPO11蛋白相關(guān)性高達(dá)0.976，與組蛋白家族中核小體組蛋白H2A、H2B相關(guān)性均高于0.9（見(jiàn)圖8）。SPO11是減數(shù)分裂重組所需的拓?fù)洚悩?gòu)酶6復(fù)合物成分，與TOP6BL共同介導(dǎo)DNA裂解，形成雙鏈斷裂（DSB），啟動(dòng)減數(shù)分裂重組；該復(fù)合物通過(guò)切割和連接循環(huán)促進(jìn)負(fù)、正超螺旋DNA松弛以及DNA脫級(jí)。

3 討論

犏牛雄性不育主要是由精子發(fā)生過(guò)程中減數(shù)分裂缺陷導(dǎo)致，導(dǎo)致減數(shù)分裂缺陷的機(jī)制仍未知。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MEISETZ可調(diào)控生殖細(xì)胞特異性基因表達(dá)，影響細(xì)胞減數(shù)分裂[8-9]。犏牛由牦牛與黃牛雜交而來(lái)，公牛表現(xiàn)為不育，F(xiàn)1代犏牛在屠宰率、胴體體重、肉、乳生產(chǎn)能力等方面均優(yōu)于牦牛[10]，但犏牛不育問(wèn)題迄今尚未解決。本研究對(duì)牦牛、犏牛MEISETZ基因開(kāi)展克隆和生物信息學(xué)分析，初步探索MEISETZ與犏牛減數(shù)分裂阻滯引起的無(wú)精癥之間的可能聯(lián)系。

3.1 MEISETZ基因核苷酸、氨基酸序列分析

本研究使用DNAMAN軟件比對(duì)牦牛、犏牛MEISETZ基因核苷酸序列，結(jié)果表明，牦牛與犏牛相比，第270（C-T）和648（T-C）位點(diǎn)發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換，431（C-G）和611（C-A）位點(diǎn)處發(fā)生堿基顛換，同源性為99.4%。Miyamoto等研究發(fā)現(xiàn)，因減數(shù)分裂阻滯而導(dǎo)致無(wú)精子癥的日本男性患者精子發(fā)生受阻可能與外顯子6的614位核苷酸的等位基因C和外顯子9的1086位核苷酸的等位基因T有關(guān)[11]。因此，犏牛雄性不育可能與611、648位點(diǎn)突變有關(guān)，但其具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。牦牛MEISETZ蛋白222個(gè)氨基酸序列與犏牛相比，僅2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，144位（A-G）由丙氨酸變?yōu)楦拾彼帷?04位（P-Q）由脯氨酸變?yōu)楣劝滨０?，氨基酸序列同源性?9.1%。王薇薇研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加甘氨酸（Gly）提高新生和斷奶仔豬生長(zhǎng)性能[12]；谷氨酰胺（Gln）具有增加力量、提高耐力作用。犏牛體型增大、役力更強(qiáng)、產(chǎn)奶、產(chǎn)肉性能的提高可能與第144、204位氨基酸突變存在關(guān)聯(lián)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，犏牛先與牦牛聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最密切，表明牦牛與犏牛序列高度保守。牦牛與普通牛分屬于不同牛種，在基因DNA序列保持不變基礎(chǔ)上，基因功能在遺傳信息從DNA傳遞給RNA和蛋白質(zhì)的過(guò)程中可能發(fā)生變化，導(dǎo)致犏牛雄性不育。

3.2 MEISETZ蛋白的性質(zhì)和功能分析

本研究通過(guò)牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，絲氨酸（10.4%）、脯氨酸（8.1%、7.7%）、谷氨酸（7.7%）、亮氨酸（9.0%）含量較高。絲氨酸在脂肪和脂肪酸新陳代謝及肌肉生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[13]，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠陰莖海綿體[14]、食管下括約肌[15]均發(fā)現(xiàn)D-Ser發(fā)揮重要功能。亮氨酸可作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、調(diào)味增香劑，谷氨酸增強(qiáng)食品風(fēng)味，且對(duì)動(dòng)物性食品有保鮮作用，故而牦牛、犏牛肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美。精氨酸（6.8%）具有促進(jìn)精子生成和提高精子活力功能[16]，且在一定程度上改善家畜胴體組成及肉質(zhì)性狀指標(biāo)。本研究顯示，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性質(zhì)相似，推測(cè)犏牛雄性不育可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。

亞細(xì)胞定位表明牦牛、犏牛該蛋白主要定位于細(xì)胞核中，該蛋白對(duì)于核定位至關(guān)重要。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均含有SET超家族結(jié)構(gòu)域，Trithorax（SET）結(jié)構(gòu)域超家族對(duì)應(yīng)于含有SET結(jié)構(gòu)域的賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)于真核生物中基因激活和沉默的表觀遺傳調(diào)控至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，MEISETZ具有催化三甲基活性，但對(duì)組蛋白-H3-賴(lài)氨酸4的單甲基和雙甲基無(wú)催化作用，且轉(zhuǎn)錄活性依賴(lài)其甲基化活性[6]；在缺乏MEISETZ基因睪丸中，組蛋白-H3-賴(lài)氨酸4的三甲基減少，減數(shù)分裂基因轉(zhuǎn)錄被改變[7]。利用GAL4系統(tǒng)作反式激活分析表明，MEISETZ也可依賴(lài)其HMTase活性方式激活轉(zhuǎn)錄[6]；MEISETZ可與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)蛋白質(zhì)（與RNAPolII相關(guān)的SET1）形成復(fù)合物[17-18]。該蛋白與PR域鋅指蛋白9（PRDM9）發(fā)現(xiàn)的PR-SET域高度重合。通過(guò)蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，PRDM9蛋白與 HIST1H2BA、HIST2H2BE、HIST2H2AC等核小體組蛋白相關(guān)性均較高。HIST1H2BA（0.924）是一種H2B類(lèi)型的變異組蛋白，此蛋白在雄性生殖細(xì)胞中直接指導(dǎo)解離核小體轉(zhuǎn)化為魚(yú)精蛋白，完全取代經(jīng)典組蛋白H2B之前的核小體向魚(yú)精蛋白過(guò)渡，且可能充當(dāng)核小體解離因子，促進(jìn)組蛋白大規(guī)模交換。HIST2H2BE、HIST2H2AC、HIST1H2BN、HIST1H2BB和H2BFS均是核小體核心成分，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體穩(wěn)定中發(fā)揮主要作用。

3.3 犏牛雄性不育機(jī)理

睪丸、腦RNA結(jié)合蛋白（Testis brain RNA-binding protein,TB-RBP）在睪丸和腦組織中可與靶基因mRNA特異性結(jié)合，主要參與減數(shù)分裂后部分靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，調(diào)控精子變態(tài)成形相關(guān)基因，是精子發(fā)生過(guò)程轉(zhuǎn)錄因子之一。柴志欣等通過(guò)牦牛、犏牛TB-RBP基因克隆及組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TB-RBP蛋白屬于Translin結(jié)合蛋白家族，對(duì)精子發(fā)生等生物過(guò)程具有重要調(diào)控作用；TBRBP基因在牦牛中表達(dá)水平顯著高于犏牛（0.01＜P＜0.05）[19]，TB-RBP基因是精子正常發(fā)育的關(guān)鍵基因，在犏牛睪丸組織中表達(dá)量較低，表明犏牛雄性不育與精子發(fā)生異常有關(guān)。

多項(xiàng)研究表明哺乳動(dòng)物Y染色體部分快速退化可能是缺乏基因間重組，雄性基因變異和積累增加，使X染色體或常染色體與Y染色體形成遺傳互作[20-22]。TSPY相關(guān)序列和其他Y染色體高度重復(fù)序列、快速協(xié)同進(jìn)化和減數(shù)分裂期的基因重排的缺乏證實(shí)MSY進(jìn)化（易位，擴(kuò)增，刪除和基因轉(zhuǎn)變）具有水平效應(yīng)。

TSPY抗原決定簇主要定位于精原細(xì)胞亞型的細(xì)胞質(zhì)和成人睪丸曲細(xì)精管基膜[23]，且TSPY的精原細(xì)胞與鄰近低表達(dá)細(xì)胞成對(duì)存在。因精子發(fā)生受雄激素影響[24-25]，若TSPY在介導(dǎo)精原干細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期時(shí)具有重要作用，則其表達(dá)很可能受雄激素和雄激素受體調(diào)控；且由于一個(gè)或幾個(gè)其轉(zhuǎn)錄單元調(diào)控元件突變，或睪丸中激素環(huán)境變化產(chǎn)生機(jī)體中不適應(yīng)信號(hào)，使TSPY不表達(dá)。張利亞等推測(cè)牦牛和犏牛TSPY蛋白參與雄性減數(shù)分裂過(guò)程中精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞調(diào)控[26]。官久強(qiáng)等通過(guò)黃牛、犏牛和牦牛睪丸組織TSPY基因熒光定量分析表明，TSPY基因拷貝數(shù)與犏牛雄性不育可能存在一定聯(lián)系[27]。

推測(cè)雄性犏牛不育可能與以下兩方面遺傳機(jī)制有關(guān):大多數(shù)雄性犏牛減數(shù)分裂過(guò)程處于異常狀態(tài)，為兩個(gè)牛種染色體基因性質(zhì)或位置差異所致[4]。但兩個(gè)親本牛種的染色體自發(fā)畸變頻率較高，如果具有不同遺傳背景的染色體畸變攜帶者雜交，產(chǎn)生的雜種個(gè)體在減數(shù)分裂時(shí)可能造成染色體無(wú)法配對(duì)聯(lián)會(huì)，染色體之間發(fā)生同源片段或異源片段聯(lián)會(huì)等復(fù)雜情況，使減數(shù)分裂過(guò)程錯(cuò)亂。

核質(zhì)互作關(guān)系也是導(dǎo)致雄性不育的可能因素。犏牛體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為母源，細(xì)胞核中一套染色體源于母體，另一套染色體源于父體。對(duì)于雄性犏牛，來(lái)自父本的Y染色體和一套常染色體，由于物種差異與母本的X染色體和另一套常染色體之間不協(xié)調(diào)，且與來(lái)自母體的細(xì)胞質(zhì)不親和，影響雄性生殖功能有關(guān)基因表達(dá)，出現(xiàn)生殖障礙問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究克隆牦牛、犏牛MEISETZ基因CDS區(qū)序列，比對(duì)其核苷酸、氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)氨基酸突變，推測(cè)其可能與犏牛雄性不育有關(guān)，可為牦牛、犏牛MEISETZ基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究犏牛雄性不育提供理論依據(jù)。