大蒜提取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠的保護作用研究

胡力夫，蘇沛文，馮 微，孟凡欣

（吉林大學 珠海學院藥學與食品科學學院，廣東 珠海 519000）

大蒜（Allium sativumL.）為多年生百合科蔥屬植物蒜的地下鱗莖，起源于中亞和地中海地區(qū)，漢朝時期被引種到中國，9世紀傳入日本和南亞地區(qū)，16世紀前葉在非洲和南美洲出現(xiàn)栽培，18世紀傳入北美洲。大蒜早在《本草綱目》中就有記載：大蒜“通五臟，達諸竅，去寒濕，辟邪惡，消癰腫?！盵1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，大蒜主要有抵抗癌癥、消除腫瘤[2]、抗氧化、清除自由基、降低血糖、預防血栓[3]、保護肝臟及調(diào)節(jié)免疫力和提高身體免疫功能[4]的作用，此外還有減肥、美容、戒煙等功效[5]。大蒜提取物主要成分有蒜氨酸和環(huán)蒜氨酸、大蒜揮發(fā)油、蒜素、有機鍺、微量元素硒和維生素[6]。柴惠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物對心血管疾病具有抑制作用；方歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物可以增強小鼠的免疫能力。

肝臟是人體最大的腺體，其主要功能包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝以及膽汁的分泌[9]。許多化學藥品、藥物、異種生物、感染和酒精中毒等會誘發(fā)肝功能障礙。肝功能不全會導致肝硬化、肝炎、肝肥大、癌癥和肝衰竭[10]，嚴重的可能危害人類健康，因此化學物質(zhì)引起的肝損傷應引起廣大人民的重視。

國內(nèi)外研究肝損傷的動物實驗模型主要有化學性肝損傷模型、免疫性肝損傷模型、藥物性肝損傷模型、酒精性肝損傷模型和缺血再灌注肝損傷模型[11]。各種肝損傷模型使用的致病物質(zhì)也不相同，化學性肝損傷常使用四氯化碳（CCl4）[12]、D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）[13]等，免疫性肝損傷常使用刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）[14]、卡介苗（bacille calmette-guerin，BCG）聯(lián)合細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[15]和D-GalN聯(lián)合LPS[16]等，藥物性肝損傷常用乙酰氨基酚（acetaminophen，AP）和異煙肼（isonicotinyl hydrazide，INH）聯(lián)合利福平（rifampicin，RIF）[17]等建立模型。

國內(nèi)已有報道，大蒜多糖和蒜氨酸都對四氯化碳誘導的肝損傷小鼠有保護作用[18-19]，但關(guān)于大蒜提取物保肝作用的研究鮮見報道。通常制備大蒜提取物時需要經(jīng)過醇沉處理，雖然可以將淀粉和蛋白質(zhì)除掉，但也將大蒜多糖這一有效成分一同去除，使大蒜提取物的保肝效果減弱，故本研究制備大蒜提取物時不經(jīng)過醇沉操作，最大程度保留大蒜保肝有效成分，以提高大蒜提取物的保肝效果。本研究以大蒜提取物為研究對象，使用四氯化碳飼喂小鼠建立化學性肝損傷模型，研究大蒜提取物對四氯化碳誘導的肝損傷小鼠的保護作用，為后續(xù)對大蒜提取物保肝作用的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雌雄美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（無特定病原（specificpathogen free，SPF）級，體質(zhì)量18～22 g）：北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；四氯化碳（分析純）：廣州化學試劑廠；水飛薊賓膠囊：天津天士力制藥股份有限公司；10%多聚甲醛溶液（paraformaldehyde，PFA）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脫氫酶（lacticdehydrogenase，LDH）、還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）、白蛋白（albumin，ALB）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；總蛋白（total protein，TP）測定試劑盒：睿信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；1580R高速離心機：中國香港基因有限公司；F6配4GZL手持式均質(zhì)乳化機：金華市華?？平虄x器廠；SHB-111A循環(huán)水式真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申順生物科技有限公司；M1-211A型微波爐：美的集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大蒜提取物的制備

精確稱量30 g去皮的大蒜瓣，使用微波爐進行微波滅酶，微波功率400 W，微波時間3 min。加入4倍體積的蒸餾水勻漿3 min，攪拌提取10 min，3 500 r/min離心15 min，上層清液使用四層紗布和布氏漏斗真空抽濾后，收集真空抽濾瓶中的濾液。大蒜提取物中蒜氨酸含量為3%，總糖含量為38%。

1.3.2 化學性肝損傷模型的建立

ICR小鼠共76只，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為6組，即空白對照組、模型組、大蒜提取物低、中、高劑量組、陽性對照組，每組12只動物，灌胃體積0.1 mL/10 g體質(zhì)量，空白組與模型組均灌胃純水，低、中、高劑量組灌胃大蒜提取物的劑量分別為120 mg/（kg·d）、440 mg/（kg·d）、1 520 mg/（kg·d），陽性對照組灌胃水飛薊賓，劑量為70 mg/（kg·d）。連續(xù)給藥14 d，期間各組小鼠自由飲水進食，每周稱量一次體質(zhì)量，并調(diào)整灌胃劑量，第14天建立四氯化碳肝損傷模型。以0.1 mL/10 g體質(zhì)量的灌胃劑量給予模型組、大蒜提取物低、中、高劑量組、陽性對照組0.1%四氯化碳食用油溶液，空白組灌胃等劑量食用油。造模后禁食不禁水16 h，用眼球取血的方式收集小鼠血液，3 000 r/min離心10 min兩次，分離血清。取肝臟相同部分，加入9倍體積生理鹽水，冰水浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液待測。

1.3.3 小鼠血清及肝臟生化指標測定

采用試劑盒測定小鼠血清及肝臟中總蛋白、白蛋白、谷胱甘肽的含量和小鼠血清及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肝臟中膽堿酯酶的活力。

1.3.4 統(tǒng)計學分析方法

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標準差”表示，采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗進行組間差異的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清和肝臟中AST、ALT和LDH活力測定結(jié)果

2.1.1 小鼠血清中AST、ALT和LDH活力測定結(jié)果

AST、ALT和LDH的活力可反映肝臟受損情況，這3種酶的活力越高表明肝臟損傷程度越高[20]。小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的測定結(jié)果見表1。

表1 大蒜提取物對肝損傷小鼠血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶活性的影響Table 1 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in serum of mice with liver injury

由表1可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT和LDH活力極顯著升高（P＜0.01），說明四氯化碳對小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中AST、ALT和LDH活力均降低，說明大蒜提取物3個劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，對于小鼠血清中AST活力，高劑量組作用極顯著（P＜0.01）；對于小鼠血清中ALT活力，低劑量組作用顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）。

2.1.2 小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力測定結(jié)果

小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力的測定結(jié)果見表2。

表2 大蒜提取物對肝損傷小鼠肝臟中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶活性的影響Table 2 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in liver of mice with liver injury

由表2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力極顯著升高（P＜0.01），說明四氯化碳對小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力均降低，說明大蒜提取物3個劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，對于小鼠肝臟中AST活力，中劑量組和高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對于小鼠肝臟中ALT活力，低劑量組的作用顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）；對于小鼠肝臟中LDH活力，3個劑量組的作用都極顯著（P＜0.01）。陽性對照組也有極顯著作用（P＜0.01）。KODAI S等[21]研究表明，蒜氨酸可以抑制四氯化碳所致的小鼠ALT和LDH活力的不正常升高，其結(jié)果與本研究一致，說明大蒜提取物對肝細胞的損傷確有保護作用。

2.2 小鼠血清和肝臟中ALB、TP和GSH含量測定結(jié)果

2.2.1 小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的測定結(jié)果

肝的儲備功能可以由血清白蛋白的含量來反映，血清白蛋白的含量能表示肝臟的病變程度[22]，蛋白含量的水平能反映肝臟的合成能力，GSH的含量可以衡量機體抵抗氧化的能力[23]。小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的測定結(jié)果見表3。

表3 大蒜提取物對肝損傷小鼠血清中白蛋白、總蛋白、谷胱甘肽含量的影響Table 3 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in serum of mice with liver injury

由表3可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中ALB、TP和GSH含量極顯著降低（P＜0.01），說明四氯化碳對小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALB、TP和GSH含量均升高，說明大蒜提取物3個劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，對于小鼠血清中ALB含量，3個劑量組的作用都極顯著（P＜0.01）；對于小鼠血清中TP含量，高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對于小鼠血清中GSH的含量，高劑量組的作用顯著（P＜0.05）。

2.2.2 小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的測定結(jié)果

小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的測定結(jié)果見表4。

表4 大蒜提取物對肝損傷小鼠肝臟中白蛋白、總蛋白、谷胱甘肽含量的影響Table 4 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in liver of mice with liver injury

由表4可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量均極顯著降低（P＜0.01），說明四氯化碳對小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟ALB、TP和GSH含量均升高，說明大蒜提取物3個劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，對于小鼠肝臟中ALB含量，高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）；對于小鼠肝臟中TP含量，中劑量組和高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對于小鼠肝臟中GSH含量，中劑量組和高劑量組的作用均極顯著（P＜0.01）。

劉靜[24]研究表明，連翹可以抑制四氯化碳所致的小鼠TP、ALB和GSH含量的不正常降低，從而達到保護肝臟的作用，其結(jié)果與本研究一致。說明大蒜提取物不僅在一定程度上可以修復損傷引起的肝臟合成能力下降[25]，還可以增加小鼠肝細胞抵抗氧化的能力，其機制可能是大蒜提取物誘導GSH的含量上升，為谷胱甘肽過氧化酶提供還原劑，使肝細胞膜對氧自由基的耐受性增加，從而保護肝細胞膜，使肝細胞膜穩(wěn)定性增加、肝酶活降低，從而達到保護肝臟的作用[26]。

2.3 小鼠肝臟中CHE活性測定結(jié)果

CHE又稱假膽堿酯酶或非特異性膽堿酯酶，和白蛋白相比，膽堿酯酶半衰期短，且合成后立即釋放入血，其活性降低程度與肝細胞受損程度相一致，肝病越嚴重，膽堿酯酶下降的幅度越大，甚至膽堿酯酶比白蛋白在反映肝臟合成功能方面還要靈敏[27]。小鼠肝臟中CHE活性測定結(jié)果見表5。

表5 大蒜提取物對肝損傷小鼠肝臟中膽堿酯酶活性的影響Table 5 Effect of garlic extract on choline esterase activity in liver of mice with liver injury

由表5可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟CHE活力極顯著降低（P＜0.01），說明四氯化碳對小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟CHE活力均升高，說明大蒜提取物3個劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中CHE活力的不正常降低。其中，高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）。

從小鼠肝臟CHE測定結(jié)果可知，大蒜提取物能顯著抑制四氯化碳所致的小鼠CHE活力的不正常降低，說明大蒜提取物能夠使受損肝臟的合成能力獲得改善，其機制可能是大蒜提取物可以增加細胞抵抗氧化的能力，以緩解肝臟受到自由基的損傷，從而達到抑制四氯化碳損傷肝臟的作用[28]。

3 結(jié)論

大蒜提取物可以抑制四氯化碳誘導肝損傷小鼠血液及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）活力不正常升高，并抑制總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷胱甘肽（GSH）含量及膽堿酯酶（CHE）活力不正常降低，說明大蒜提取物可以通過提高肝細胞抗氧化能力，改善肝臟合成能力達到對四氯化碳誘導的肝損傷具有保護作用。