栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖毒理安全性評價(jià)

戴德慧，胡偉蓮

（浙江科技學(xué)院 生化學(xué)院，浙江 杭州 310012）

粘多糖是一類分子結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸和氨基己糖結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖，是多糖家族中最重要的成員之一[1-3]。粘多糖有著重要的生物學(xué)活性，能調(diào)節(jié)體內(nèi)的陰離子濃度、機(jī)體免疫功能、機(jī)體脂類代謝；激活脂蛋白脂酶；防御細(xì)菌或病毒的感染；具有抗凝血、抗血栓活性、抗癌等多種生理功能[4-9]。此外，粘多糖在調(diào)節(jié)骨膠原纖維的生成及增加血管壁彈性等方面也均有重要作用[10-13]。隨著粘多糖特殊的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，粘多糖也被普遍認(rèn)為是一類最具發(fā)展前景的生物活性物質(zhì)之一。

目前，粘多糖產(chǎn)品的開發(fā)制備主要采用動物組織提取法，但這種生產(chǎn)方法原料來源局限性大、產(chǎn)品提取率極低、工藝程序復(fù)雜、生產(chǎn)成本居高不下，造成商品價(jià)格昂貴，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而采用微生物發(fā)酵法，具有原料不受限制，產(chǎn)品容易純化，成本低，且無動物來源致病病毒來源的污染的危險(xiǎn)，易于形成規(guī)?；a(chǎn)[14-15]。利用獸疫鏈球菌（Streptoccus zooepidemicus）發(fā)酵生產(chǎn)的透明質(zhì)酸是微生物粘多糖中最重要的代表，已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)療等領(lǐng)域[16-17]。

在騰格里沙漠的南緣地區(qū)篩選得到一株栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae）S3，其能在營養(yǎng)貧瘠的無氮蔗糖培養(yǎng)基中較好的生長，自生固氮并產(chǎn)大量的胞外粘多糖。該粘多糖具有較好的保溫、防粘連及絮凝作用，在食品、醫(yī)藥、化妝品及環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，但其是否存在安全隱患尚不清楚。因此，本研究通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞染色體畸變、精子畸形及30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)分別考察栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖的急性毒性、致突變、遺傳及亞急性毒性等進(jìn)行初步的安全性評價(jià)，為其今后的開發(fā)利用提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）清潔級小鼠：浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2014-0001號。所有小鼠均喂養(yǎng)于屏障環(huán)境（空氣潔凈度萬級，換氣次數(shù)10～20次/h，溫度20～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%），小鼠飼喂60Co滅菌的營養(yǎng)配合飼料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.2 試劑

蔗糖、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)磷酰胺（分析純）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；秋水仙素、氯代十六烷基吡啶（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g，硝酸鈉1g，磷酸氫二鉀1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S、BSA2202S電子天平：上海賽多利斯貿(mào)易有限公司；日立7100型全自動生化分析儀：日本日立公司；X-30R離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；CX33生物顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GI54DWS高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；ZWYR-2112B型恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；ADVIA 2120I全自動血液分析儀：德國西門子公司；Alphaclean1300垂直流潔凈工作臺：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胞外粘多糖的制備[18]

按3%（V/V）的接種量將栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae）S3菌懸液（106CFU/mL）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/300 mL，于28 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，除去菌體，加入終濃度為0.1 mol/L的NaCl，再加入1%氯代十六烷基吡啶（cetylpyridinechloride，CPC）處理，使其形成絡(luò)合沉淀后，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，以0.6 mol/L NaCl溶液充分溶解沉淀，然后加3倍體積的無水乙醇，4 000 r/min離心20 min，收集白色絮狀產(chǎn)品，冷凍干燥，得到粘多糖樣品。

1.3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)[19-20]

選用ICR清潔級小鼠，體質(zhì)量為18～24 g，雌雄各10只，灌胃前16 h禁食，稱質(zhì)量后，24 h內(nèi)分3次灌胃給予質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的受試物，灌胃容量為40 mL/kg體質(zhì)量，累計(jì)受試物總劑量為12 g/kg體質(zhì)量。灌胃4 h后給食，給藥后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。給藥14 d后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，進(jìn)行心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胃、腸等重要臟器病理檢查。另選用相同數(shù)量的小鼠，在同樣的處理方式下，以蒸餾水取代受試物作為對照組。

1.3.3 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)[21]

選用體質(zhì)量為25～30 g的健康ICR清潔級小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。制備的粘多糖樣品分為低（1.0 g/kg體質(zhì)量）、中（2.0 g/kg體質(zhì)量）、高（4.0 g/kg體質(zhì)量）三個(gè)劑量試驗(yàn)組，采用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）（40 mg/kg）為陽性對照組，蒸餾水為陰性對照組，給予受試物3次，每次間隔24 h，在末次給受試物24 h后取材，處死動物前2 h按4 mg/kg體質(zhì)量腹腔注入秋水仙素。小鼠頸椎脫臼處死取股骨，將骨髓洗入10 mL離心管中，反復(fù)沖洗數(shù)次后，混勻，制成1.0 mL細(xì)胞懸液，采用Giemsa染色儲備液染色，用油鏡對細(xì)胞中期的染色體進(jìn)行分析觀察，每只動物分析100個(gè)中期相細(xì)胞，計(jì)算染色體異常率，即染色體異常數(shù)與總分析數(shù)的比值。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)[22]

選用體質(zhì)量為28～35 g的雄性ICR清潔級小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。設(shè)置試驗(yàn)組（劑量分別為低（1.0 g/kg體質(zhì)量）、中（2.0 g/kg體質(zhì)量）、高（4.0 g/kg體質(zhì)量）、陰性對照組（蒸餾水）和陽性對照組（50 mg/kg體質(zhì)量CP），連續(xù)灌胃給予受試物5 d，至首次給受試物后的第35天，用頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)副睪，放入盛有2 mL生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副睪縱向剪1～2刀，靜置3～5 min，輕輕搖動。用合成纖維血網(wǎng)袋過濾，吸濾液涂片?？諝飧稍锖?，用甲醇固定5 min以上干燥，用1.5%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥。每組記數(shù)5只動物，每只動物計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算精子畸形率（以百分率計(jì)）。

1.3.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)[23]

選用體質(zhì)量為18～24 g的ICR清潔級小鼠80只，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。設(shè)置試驗(yàn)組（劑量分別為低（1.0 g/kg體質(zhì)量）、中（2.0 g/kg體質(zhì)量）、高（4.0 g/kg體質(zhì)量）、對照組（蒸餾水）。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般狀態(tài)、體征、攝食量、飲水及糞便狀況。每7 d測一次體質(zhì)量，按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量，連續(xù)觀察30 d。給藥期滿30 d，禁食禁水12 h后，摘眼球取血，檢查血液常規(guī)指標(biāo)及血液生化指標(biāo)。取血后立即剖取動物肝、腎、脾、胃、睪丸或卵巢等臟器稱質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算器官質(zhì)量系數(shù)，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)體質(zhì)量增長情況見表1。

由表1可知，給予受試物的樣品組雄雌小鼠體質(zhì)量增長與對照組無明顯差異（P＞0.05），給藥14 d后小鼠外觀毛色光亮，無興奮、不安、竄動、跳躍、豎毛、流淚、流涎、凸眼、扭體反應(yīng)現(xiàn)象；給藥后攝食、取水、大小便等均無明顯異常；觀察期間無動物死亡；給藥14 d 后小鼠的心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胃、腸等重要臟器均未見出血、充血、水腫、滲出、潰瘍、穿孔等明顯的病理變化，胸腔、腹腔、心包膜無積液。結(jié)果表明，對于粘多糖，雌雄兩性小鼠經(jīng)口最大耐受度均＞12 g/kg。根據(jù)急性毒性分級，粘多糖樣品屬無毒級[24-25]。

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，試驗(yàn)組小鼠的染色體異常率（4.20%、4.20%、4.00%）與陰性對照組（4.70%）無明顯差異（P＞0.05），與陽性對照組（45.3%）差異極顯著（P＜0.01），且試驗(yàn)組結(jié)果顯示染色體異常率無劑量反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，該粘多糖樣品劑量為0～4.0 g/kg時(shí)無致小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變的作用。

表2 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of chromosome aberration tests in mice bone marrow cells

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，試驗(yàn)組小鼠精子的畸形率（2.14%、2.04%、2.06%）與陰性對照組（2.56%）比較，無顯著差異（P＞0.05），與陽性對照組（7.68%）比較，差異極顯著（P＜0.01），且試驗(yàn)組結(jié)果顯示染色體畸變率無劑量反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，該粘多糖樣品劑量為0～4.0 g/kg時(shí)對小鼠精子無畸變作用。

表3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of sperm abnormality tests in mice

2.4 30 d飼喂試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 一般毒性反應(yīng)

高、中、低三個(gè)劑量給藥組及對照組小鼠在30 d試驗(yàn)期內(nèi)均活動正常，行為活潑，毛色光澤，進(jìn)食飲水正常，大、小便無異常改變，無一死亡。

2.4.2 體質(zhì)量測定結(jié)果

表4 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中小鼠體質(zhì)量測定結(jié)果Table 4 Determination results of mice body weight in 30 d feeding tests

由表4可知，高、中、低三個(gè)劑量給藥組體質(zhì)量增長正常，試驗(yàn)組與對照組相比較，差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 小鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果

由表5可知，給藥30 d后，3個(gè)劑量試驗(yàn)組的肝臟、脾臟、腎臟、睪丸及卵巢臟器系數(shù)與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中小鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果Table 5 Determination results of mice organ coefficient in 30 d feeding tests

2.4.4 血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果

由表6可知，各劑量組小鼠白細(xì)胞數(shù)量（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞數(shù)量（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）濃度、紅細(xì)胞壓積（hematokrit，HCT）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血小板容積（mean platelet volume，MPV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）含量、嗜中性白細(xì)胞（neutrophil，NE）百分比、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LY）百分比、嗜酸性粒細(xì)胞（eosnophils，EOS）百分比、單核細(xì)胞（monocyte，MONO）百分比、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil，BAS）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）濃度、紅細(xì)胞分布寬度（red blood cell distribution width，RDW）、血小板（platelet，PLT）數(shù)量均與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中小鼠血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果Table 6 Determination results of mice blood routine indexes in 30 d feeding tests

2.4.5 血生化指標(biāo)測定結(jié)果

表7 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中小鼠血生化指標(biāo)測定結(jié)果Table 7 Determination results of mice blood biochemistry indexes in 30 d feeding tests

續(xù)表

由表7可知，各劑量組小鼠的甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、葡萄糖（glucose，GLU）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）血生化指標(biāo)與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4.6 30 d喂養(yǎng)小鼠的病理組織學(xué)檢查

全面細(xì)致觀察發(fā)現(xiàn)，各小鼠的心、肝、腎、脾、胃、睪丸及卵巢等器官的大小、形態(tài)、色澤、質(zhì)感等均未見異常。各主要臟器無明顯變性、壞死，光澤正常。

3 結(jié)論

通過小鼠急性毒性試驗(yàn)，確定栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖樣品對雌雄性小鼠的急性毒性最大耐受度均＞12 g/kg，屬無毒物。通過小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變及精子畸形試驗(yàn)，確定栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖樣品低（1.0 g/kg）、中（2.0 g/kg）、高劑量（4.0 g/kg）對小鼠的染色體及精子無畸變作用。通過小鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)表明，試驗(yàn)期內(nèi)各組小鼠生長發(fā)育良好，體質(zhì)量增加、臟器系數(shù)、血常規(guī)及血生化各項(xiàng)指標(biāo)與對照組均無顯著差異（P＞0.05））；病理組織學(xué)檢查均未見病理改變。