脊髓損傷增強α-腎上腺素受體的股動脈表達和反應性變化

秦礎強 朱 翔 曾展鵬 趙洪普 呂玉明 曾 敬

1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣州 番禹 511400

自主反射障礙(AD)是一種危險的臨床現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為無法控制的高血壓和其他危及生命的后果，如癲癇、肺水腫、急性腎損傷、心肌梗死和顱內(nèi)出血[1]。臨床上，AD定義為收縮壓比基線升高至少20%，心率變化，并與其他器官功能不全癥狀或體征相關[2]。在脊髓高強度損傷的急性期，患者通常發(fā)生神經(jīng)源性休克，需要肌力支持。從脊髓損傷后的幾周到6個月，48%～98%的高截癱或四肢癱瘓患者出現(xiàn)自主反射障礙[3]。AD發(fā)展過程中心血管反應異常的病理生理機制尚不完全清楚[4]。有一種觀點認為，脊髓損傷程度高的受試者失去了脊髓上抑制控制血管舒縮通路下降，導致中樞和外周自主神經(jīng)回路的神經(jīng)可塑性改變[5]。因此，在病變較低水平的刺激可產(chǎn)生無法控制的交感神經(jīng)流出，引起嚴重的血管收縮反應和血壓顯著升高。先前的研究已經(jīng)證明了大規(guī)模的降低交感神經(jīng)活性與極低的血管阻力在急性神經(jīng)源性休克階段,但最終發(fā)展成高反應性α-腎上腺素刺激與SCI后急性期病人或動物[6]。然而，α-腎上腺素受體的調(diào)節(jié)和響應性周圍動脈水平以下的脊髓損傷階段的自主反射性異常以前還沒有被描述過。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取體重在200～250 g的SD大鼠為研究對象。本研究共使用48只大鼠(n=24)，隨機分為對照組和脊髓損傷組(n=24)，實驗過程中大鼠無死亡。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的建立 將體重在200～250 g的SD大鼠麻醉，吸入異氟醚(2%～3%體積/體積氧氣)，俯臥位。在下胸椎上做了一個切口，采用高速鉆孔機進行T10全椎板切除術(shù)。通過夾緊T8～T12的棘突穩(wěn)定脊柱，使用力校準的重量下降裝置誘導脊髓挫傷。脊髓損傷是通過將一根10 g重的桿子從50 mm處扔到暴露在外的脊髓上造成的。然后縫合切口，讓大鼠從麻醉中恢復。無死亡，沒有出現(xiàn)完全下肢癱瘓的大鼠。所有程序均經(jīng)機構(gòu)動物護理和使用委員會批準，并通過美國國家衛(wèi)生研究院出版的《實驗室動物護理和使用指南》予以確認。

1.2.2血流動力學測量 將一根24 G的導管插入頸動脈測量血壓，并連接一個血壓傳感器記錄動脈血壓。在頸靜脈注射苯腎上腺素(10 g/kg)，以誘導全身α刺激并增加血壓。股動脈內(nèi)的血流通過超聲血流系統(tǒng)在POD 1、7和14處測定。記錄至少1.5min的血流軌跡，并使用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)分析平均血流。大鼠全麻時用異氟醚(氧氣中為1.5% v/v)測量所有血流動力學參數(shù)，每次分析后移除所有血流動力學測量儀器。

1.2.3血管反應性測量 分離股動脈環(huán)(3 mm長)，用鋼絲輕輕摩擦內(nèi)膜，取出內(nèi)皮細胞。血管環(huán)被安裝在含有25 ml克雷布斯溶液的器官腔內(nèi)。艙室保持在37 ℃，持續(xù)充氣94% O2/6% CO2。用等軸力-位移傳感器記錄等軸力的變化。每個環(huán)被逐漸拉伸到1.5 g，平衡45 min后，加入KCl (40 mM)和濃度增加的苯腎上腺素(PE, 10-9至10-5M)使環(huán)收縮。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡分析 將采集的股動脈粉碎并在溶解緩沖液中均勻化。在聚丙烯酰胺凝膠(9%～12%)中加入等量的總蛋白(50～100 g)?？贵w使用兔多克隆抗α-腎上腺素受體(AB3462，1∶400)。用增強化學發(fā)光法觀察譜帶。

1.2.5組織學測定 動脈組織浸泡在10%甲醛溶液中24 h。石蠟包埋組織切片，蘇木精、伊紅染色(H&E)。將新鮮冷凍的動脈置入最佳切割溫度(OCT)下，進行免疫組化染色。將切片組織與兔多克隆抗α-腎上腺素能受體抗體(1∶200；abcam)孵育，用親和素-生物素法觀察α-腎上腺素能受體的表達。

2 結(jié) 果

2.1血流動力學檢測 股動脈血流量在POD 1幾乎檢測不到，在POD 7和14逐漸增加，結(jié)果如圖1所示。然而，在脊髓損傷后14 d，股動脈血流量仍然顯著降低(P<0.05)。

圖1 基線(A)和POD 1-14 (B-D)測量的股動脈代表性原始血流示蹤圖

2.2血管反應性測量 通過添加KCl(40 mM)和苯腎上腺素(PE,10-9-10-5M)來測試股動脈環(huán)的等長收縮反應。脊髓損傷大鼠股動脈KCl去極化誘導的次優(yōu)收縮略有增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著苯腎上腺素的累積增加，脊髓損傷大鼠股動脈的收縮力以濃度依賴的方式增加(P<0.05)。在脊髓損傷大鼠中，苯腎上腺素誘導的離體股動脈最大收縮增強(P<0.05)。(表1、表2)

表1 離體股動脈對KCl (40mM)和苯腎上腺素的收縮反應

隨著苯腎上腺素的累積增加，脊髓損傷大鼠股動脈的收縮力以濃度依賴的方式顯著增加(P<0.05)，結(jié)果如表2所示，苯腎上腺素刺激后收縮曲線也左移結(jié)果如表3所示。此外，在脊髓損傷大鼠中，苯腎上腺素誘導的離體股動脈最大收縮顯著增強(空白組2.1±0.5，脊髓損傷組3.0±0.6，P<0.05)。

表2 濃度依賴收縮曲線(絕對張力)

表3 苯腎上腺素引起的收縮到最大張力的百分比

為了模擬體內(nèi)α-腎上腺素的刺激作用，我們通過靜脈注射苯腎上腺素(10 g/kg)，測量全身血壓。與對照組相比，脊髓損傷大鼠的基線平均動脈血壓降低，對照組和脊髓損傷(SCI)大鼠輸注α-腎上腺素能激動劑苯腎上腺素后，靜息時平均動脈壓(基線水平)降低，全身血壓顯著升高。結(jié)果如表4所示。靜息時平均動脈壓，對照組與脊髓損傷組平均血壓分別為(90.32±10.32)mmHg、(60.45±8.43)mmHg兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。輸注α-腎上腺素能激動劑苯腎上腺素后，對照組與脊髓損傷組平均血壓分別為(120.45±10.34)mmHg，(140.24±12.34)mmHg，兩組間存在顯著性差異(P<0.05)，且輸注α-腎上腺素能激動劑苯腎上腺素后與靜息時平均血壓相比，均顯著增加(P<0.05)。

表4 大鼠靜脈注射苯腎上腺素(10 μg/kg)后全身血壓的測定結(jié)果

與對照組相比，在這些大鼠中，苯腎上腺素能更顯著地誘導血壓升高，結(jié)果如表5所示。對照組血壓平均值在(59.54±3.54)mmHg，脊髓損傷組血壓平均值在(93.45±8.43)mmHg，兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。

表5 靜脈輸注苯腎上腺素后脊髓損傷大鼠的血壓測定結(jié)果

2.3Western blot 測定結(jié)果 在股動脈中定量表達α-腎上腺素能受體，進一步表征脊髓挫傷后血管運動的變化。通過western blot實驗對α-腎上腺素能受體蛋白表達量進行測定，與對照組相比，脊髓損傷大鼠α-腎上腺素能受體蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05)，結(jié)果如圖2。通過Image軟件對各組蛋白條帶的灰度值進行計算，結(jié)果如表6所示，由結(jié)果可以看出，對照組與脊髓損傷組灰度值分別為1.11±0.23，2.51±0.67，兩組間存在顯著性差異(P<0.05)，由此進一步說明脊髓損傷后，大鼠α-腎上腺素能受體蛋白顯著增加。

表6 α-腎上腺素受體蛋白表達的Western blot分析灰度值測定結(jié)果

圖2 股動脈組織勻漿中α-腎上腺素受體蛋白表達的Western blot分析。

2.4組織學分析 組織學測定結(jié)果表明，股動脈內(nèi)側(cè)層α-腎上腺素能受體表達增強，脊髓損傷大鼠股動脈HE染色顯示相似的形態(tài)。

3 討 論

脊髓損傷是一種高致殘率的創(chuàng)傷性疾病。細胞凋亡和壞死性細胞凋亡是神經(jīng)細胞在其繼發(fā)性病理變化過程中丟失的主要原因[7]。自主反射障礙是高水平脊髓損傷患者常見的不良血流動力學反應。然而，這一現(xiàn)象背后的機制尚未被完全理解。結(jié)果表明，收縮反應對α-腎上腺素的刺激在分離股動脈(損傷水平以下的動脈)來自脊髓損傷大鼠。股動脈對α-腎上腺素能刺激的反應性增強與內(nèi)側(cè)層α-腎上腺素能受體表達增強有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后的第10天，股動脈的血流量幾乎檢測不到，與脊髓損傷急性期神經(jīng)源性休克的臨床表現(xiàn)相當。SCI誘導的神經(jīng)源性休克的病因是多因素的，包括周圍血管阻力的降低、血管電容的喪失和心臟起源事件[8]。脊髓損傷急性期出現(xiàn)低血管張力是由于中樞交感神經(jīng)張力下降(脊髓上控制中斷)和正常副交感神經(jīng)影響(完整的迷走神經(jīng)支配)導致自主神經(jīng)控制失衡所致[9]。有研究指出，損傷后1周股動脈血流量逐漸增加，最終恢復到POD14對照大鼠血流量的40%左右[10]。

本研究通過分離股動脈并分析其體外血管舒縮功能的結(jié)果表明，與對照組相比，脊髓損傷大鼠股動脈對KCl去極化和苯腎上腺素α腎上腺素刺激的收縮反應增強。KCl誘導收縮的變化略有增加，但無統(tǒng)計學差異。KCl激活電壓操作的Ca2+通道，增加血管平滑肌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度[11]。由于KCl介導的血管收縮與受體無關，大鼠受傷后2周時股動脈血管平滑肌細胞質(zhì)量可能沒有變化。然而，本研究中使用的KCl(40 mM)濃度是次最大值；在最大濃度的氯化鉀作用下，氯化鉀誘導收縮的差異會增大。苯腎上腺素是一種選擇性的α-腎上腺素受體激動劑，通過激活GqP蛋白偶聯(lián)的IP3轉(zhuǎn)導信號通路介導血管平滑肌收縮反應[12]。脊髓損傷大鼠股動脈等長張力曲線在苯腎上腺素累積添加后明顯增高。最大收縮力提高50%，濃度反應曲線也左移，提示脊髓損傷大鼠離體股動脈對α-腎上腺素刺激更敏感。為了模擬體內(nèi)α-腎上腺素的刺激，對麻醉大鼠靜脈輸注苯腎上腺素后的全身血壓進行了測量。在基線水平上，脊髓損傷大鼠的平均動脈血壓降低，這與低血管阻力和低血壓發(fā)作的臨床表現(xiàn)一致[13]。

突觸后α-腎上腺素能受體的超敏反應，通過測量大鼠結(jié)腸直腸擴張和輸注苯腎上腺素后的血壓反應，在T5脊髓橫斷模型中已進行過研究[14]。前人的研究結(jié)果表明，在實驗性脊髓損傷動物中，注射α-腎上腺素能激動劑可以顯著增加血壓[15]。最近，Rummery等人對T4 脊髓損傷的大鼠隱動脈對苯腎上腺素的等軸反應性進行分析[16]。第2周和第8周，大隱動脈的神經(jīng)誘發(fā)收縮增強。這兩項先前研究的結(jié)果支持我們的主要結(jié)果，即血管收縮對α-腎上腺素刺激的反應顯著增強，導管動脈低于SCI水平。除了血流動力學和血管舒縮功能分析外，我們的研究還提供了重要的分子證據(jù)，證明周圍動脈血管平滑肌中α1-腎上腺素受體在脊髓損傷水平以下上調(diào)。在多系統(tǒng)萎縮和脊髓橫斷患者中，血小板上α-腎上腺素受體數(shù)量增加，說明去神經(jīng)支配對去甲腎上腺素輸注超敏。中樞交感神經(jīng)失神經(jīng)支配下降患者α-腎上腺素能受體表達增加的確切機制尚不清楚，去甲腎上腺素低血漿水平可能是這種代償現(xiàn)象的潛在發(fā)病機制之一[17]。

此外，我們還研究了股動脈血管壁確定結(jié)構(gòu)脊髓損傷后外周動脈重構(gòu)過程。在光鏡檢查下，血管壁脊髓損傷大鼠的形態(tài)與對照組相似。先前的研究指出，癱瘓肢體的外周動脈在脊髓損傷后發(fā)生重構(gòu)，導致動脈壁向內(nèi)重構(gòu)[18]。然而，當與殘疾肢體的肌肉體積相關時，SCI患者的外周動脈直徑與健康個體的外周動脈直徑相似[19]。因此，我們的研究可能表明，由神經(jīng)軸向去神經(jīng)支配下降引起的外周動脈的異常血管反應性很可能是由血管壁的功能改變而不是形態(tài)重塑引起的。

綜上所述，腎上腺素受體在動脈平滑肌層的補償表達增多的脊柱損傷水平下的延伸抗原，增強了對α-腎上腺素激動劑的響應性，并增強了自主異常發(fā)育的潛力。