單一聚合度殼寡糖色譜分離技術(shù)的應(yīng)用

周衛(wèi)強(qiáng)，沈雪梅，彭超，陳博，盧宗梅，周勇，李義，4，趙黎明，佟毅，4

（1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209； 3.中糧生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010；4.玉米深加工國家工程研究中心，長春 130033）

殼寡糖是一種聚合度在2～20 之間的氨基寡糖產(chǎn)品，亦稱低聚殼聚糖，相對分子質(zhì)量不大于3 200 Da，具有良好的水溶性和生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和日化行業(yè)，而聚合度更高的殼聚糖常作為生物可降解性材料和生物相容性的醫(yī)學(xué)材料?，F(xiàn)有研究表明殼寡糖具有特殊的生物活性和多種生理調(diào)節(jié)功能，不同聚合度分布的殼寡糖混合物和單一聚合度的殼寡糖純品的生理調(diào)節(jié)功能差異較大［1-2］。市售殼寡糖產(chǎn)品主要為一定聚合度分布的混合物，不同聚合度的殼寡糖的相對分子質(zhì)量存在定量關(guān)系，寡糖分子每增加一個氨基葡萄糖基團(tuán)，相對分子質(zhì)量增加161 Da，每增加一個乙酰基，相對分子質(zhì)量增加42 Da，即聚合度或乙?；黾右鸬墓烟欠肿映叽绲淖兓浅Ｎ⑿。绱司?xì)的差異，對于常規(guī)膜分離領(lǐng)域的截留相對分子質(zhì)量范圍，尚難以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)高度相近的單一聚合度殼寡糖（殼二糖～殼八糖）的單組分膜分離以及單一聚合度純品的大規(guī)模生產(chǎn)［3-4］，因此高純度單一聚合度殼寡糖產(chǎn)品價格高昂，尚無法滿足研發(fā)需求。

液相色譜分離是一種高效的物理分離技術(shù)，色譜柱為固定相，基于不同的分離機(jī)理裝填不同的樹脂填料，利用不同組分在固定相和流動相中的分配系數(shù)或吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)分離。不同聚合度的殼寡糖除相對分子質(zhì)量之間的差異外，殼寡糖解離后所帶正電荷數(shù)不同，寡糖分子的極性也會發(fā)生相應(yīng)變化。目前，不同聚合度殼寡糖的分析色譜柱主要分為尺寸排阻色譜柱、離子交換色譜柱、親和色譜柱和親水作用色譜柱4 種類型。實(shí)驗(yàn)室水平的分析檢測是大規(guī)模色譜分離制備的基礎(chǔ)，色譜固定相填料是液相色譜技術(shù)的核心，分離能力的高低與填料結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)密切相關(guān)，不同分離模式的液相色譜技術(shù)其固定相填料的差異主要表現(xiàn)在化學(xué)鍵合相的區(qū) 別［5］。筆者在調(diào)研分析級色譜柱和小試層析柱填料分離效果的基礎(chǔ)上，介紹和討論了4 種類型色譜技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在的問題，最后，對分離性能更高的混合模式色譜及模擬移動床色譜的潛在應(yīng)用給予展望。

1 尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography），亦稱凝膠過濾色譜（Gel filtration chromatography，GFC），是利用色譜分子篩作用實(shí)現(xiàn)不同尺寸（空間）大小分子的有效篩分，不同尺寸的分子或者進(jìn)入凝膠顆粒孔隙，或者直接從固定相表面通過，因遷移能力的差異，分子較大的先通過凝膠床，分子較小的后通過凝膠床，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)有效分離。對于低聚寡糖的分析色譜柱，市售產(chǎn)品包括美國Phenomenex 公司的RSO 寡糖柱和Bio-Rad 公司的HPX-42A 糖分析柱，二者均由聚苯乙烯二乙烯苯樹脂填裝而成，化學(xué)修飾情況未知，分析檢測溫度高，流速低，一定程度上限制了該產(chǎn)品的工業(yè)應(yīng)用，而在堿性殼寡糖的分離領(lǐng)域尚無應(yīng)用案例。雖然尺寸排阻色譜是理論上分離不同聚合度寡糖的首選方式，但是經(jīng)筆者驗(yàn)證，兩種市售色譜柱的推薦方法依然無法實(shí)現(xiàn)單一聚合度殼寡糖的有效分離。

此外，實(shí)驗(yàn)室常用葡聚糖凝膠Sephadex 體積排阻介質(zhì)填料，適用于脫鹽、肽與其它小分子的分離，葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基以醚橋形式相互交聯(lián)而成，具有立體網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，大分子物質(zhì)無法深入交聯(lián)葡聚糖內(nèi)部孔道而率先被洗脫，原理如圖1 所示，但是Sephadex 產(chǎn)品的機(jī)械強(qiáng)度不足，抗壓性差，難以用于高柱壓的制備分離。季者等利用Sephadex G-15 葡聚糖凝膠填料，玻璃層析柱裝填高度為100 cm，內(nèi)徑為1.4 cm，流量為3.6 mL／h，純化水洗脫，從鹽酸酸解得到的殼寡糖混合物中純化得到殼五糖、殼六糖和殼七糖，最高收率達(dá)到58%［6］。高麗霞等采用聚丙烯酰胺Bio-Gel P6 和P6 Fine 填料，兩步法分離純化殼寡糖，0.1 mol／L 的NH4HCO3溶液作為洗脫液，洗脫流量為0.4 mL／min，收集得到的殼三糖～殼七糖的純度均在90%以上，且洗脫用的弱酸弱堿鹽可通過減壓旋蒸方法去除［7］。Heggset 等在3 根XK26 色譜柱中裝填Superdex 30 凝膠填料，柱高為180 cm，內(nèi)徑為2.6 cm，以0.15 mol／L 的乙酸銨為流動相，流量為0.8 mL／min，分離經(jīng)鏈霉素來源幾丁質(zhì)酶酶解后的雜聚殼聚糖樣品，隨著幾丁質(zhì)酶的濃度變化，可以實(shí)現(xiàn)聚合度10 以下的殼寡糖有效分離［8］。陳列歡等利用粒徑40～100 μm 的聚丙烯酰胺凝膠裝填 1.2 m 的制備柱，雙蒸水洗脫，提供了一種方法簡單、分離效果好、收率高、純度高的單一聚合度殼寡糖制備方法［9］。

圖1 葡聚糖凝膠過濾的分離原理示意圖

2 離子交換色譜

殼寡糖具有堿性帶正電荷屬性，而常見的殼寡糖產(chǎn)品多為殼寡糖鹽酸鹽，因此可以采用離子交換特性進(jìn)行分離。離子交換色譜（Ion exchange chromatography，IEC）是利用固定相上的帶電解離性交換基與溶質(zhì)分子中的帶電離子發(fā)生離子交換，達(dá)到離子交換平衡，引起溶質(zhì)不同組分在固定相與流動相的分配差異，隨著洗脫過程逐漸分離的技術(shù)。根據(jù)寡糖的結(jié)構(gòu)特性，聚合度越高的寡糖與樹脂交換結(jié)合位點(diǎn)越多，洗脫越難，理論保留時間越長。對于糖類分析的離子交換色譜柱，市售產(chǎn)品主要為美國戴安公司的CarboPac PA10 碳水化合物分析柱，用于食品、藥品和植物中的單糖和二糖的等度分離，裝填了涂敷乳膠薄膜的10 μm 直徑無孔珠樹脂。馬昊［10］和陳梅蘭［11］等根據(jù)同系物的校正保留時間或保留因子的對數(shù)與碳數(shù)的n值存在線性關(guān)系的原理，利用CarboPac PA10 低容量陰離子交換色譜柱，以積分脈沖安培檢測器連續(xù)檢測流出物信號變化，分析測定多種殼寡糖的含量，線性關(guān)系良好，但是殼寡糖洗脫規(guī)律與一般寡糖不一致，聚合度高的殼寡糖優(yōu)先被洗脫。

李克成等利用CM Sephadex C25 葡聚糖弱酸性陽離子交換樹脂，NaAc-HAc 溶液梯度洗脫，活性炭脫鹽后得到純度較高的聚合度DP 2～7 的殼寡}糖［12］。杜昱光等將殼寡糖溶液上樣于陽離子交換柱中，分別驗(yàn)證了3 種品牌的離子交換樹脂，用2～3 mol／L 的鹽酸梯度洗脫，流量為100～600 mL／h，不同梯度的餾分收集合并濃縮干燥后，得到不同純度的殼寡糖（DP 2～7）［1，13］。Wei 等將經(jīng)過酶解、超濾、納濾和醇沉處理得到的殼寡糖溶液，進(jìn)樣于裝有CM Sephadex C25 填料的45 cm 高的層析柱中，NaAc-HAc 溶液梯度洗脫，經(jīng)洗脫液集中濃縮，可以得到純度93%的殼六糖［14］。Dong 選用弱酸性陽離子交換柱，在親水／離交混合模式下，研究了流動相濃度變化對單一聚合度殼寡糖的分離效果，混合模式色譜明顯優(yōu)于單一模式的分離［15］。

3 親和色譜柱

親和色譜（Affinity chromatography，AC）是一種基于生物活性物質(zhì)與其他分子之間可逆的特異性相互作用的色譜分離技術(shù)。固定相表面鍵合有特異性識別能力的配體，配體基團(tuán)與活性蛋白可逆性吸附和解吸附，從而實(shí)現(xiàn)純化蛋白的目的。親和色譜的固定相材料多為有機(jī)聚合物材料，常見的鍵合配體有金屬螯合物配體、天然物配體和染料類配體。其中，固定化金屬離子親和色譜（IMAC）的應(yīng)用較為廣泛，具有親和選擇性高、生物兼容性好、可逆再生等優(yōu)勢，主要用于磷酸化肽富集和蛋白純化［16］，但在糖分離領(lǐng)域尚無相應(yīng)市售產(chǎn)品。

Frantz 等在瓊脂糖凝膠固定相表面鍵合亞氨基二乙酸（IDA），然后通過銅離子螯合反應(yīng)形成金屬螯合固定相，其對殼寡糖的靜態(tài)吸附容量可顯著增加，裝柱后，咪唑溶液梯度洗脫可分離得到純度較高的DP 2～4 殼寡糖［17］。IDA 的結(jié)構(gòu)式為-N(CH2COOH)2，氮原子和兩個氧原子與金屬離子螯合后，還剩余三個空軌道與蛋白質(zhì)結(jié)合，保證了親和色譜材料具有可強(qiáng)烈結(jié)合的配位點(diǎn)。

4 親水作用色譜

親水作用色譜(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)的概念由Alpert 教授于1990 年首次提出［18］，采用正相色譜的極性固定相和反相色譜的極性流動相，通過水和水溶性有機(jī)溶劑混合洗脫（有機(jī)溶劑含量大于60%，通常為乙腈，少量報道是丙酮或乙醇［19］），實(shí)現(xiàn)極性化合物的保留與分離。化合物的保留時間隨其極性的增強(qiáng)而越長，有效地解釋了正相色譜在極性化合物方面的應(yīng)用限制，特別是氨基酸、碳水化合物、極性藥物與多肽類物質(zhì)的分離［20］。關(guān)于親水作用色譜的分離機(jī)理尚無明確結(jié)論，Buszewski 認(rèn)為因?yàn)镠ILIC 的固定相和流動相都是極性的，當(dāng)流動相流經(jīng)固定相表面時，親水性的固定相表面會附著一層富水層，該富水層與流動相形成一個微尺度的液-液萃取系統(tǒng)，溶質(zhì)的保留時間長短是由其在該液-液萃取系統(tǒng)的分配變化決定的，原理如圖2［21］。

圖2 親水作用色譜的分離機(jī)理示意圖

對于殼寡糖產(chǎn)品的液相色譜檢測，常規(guī)使用的日本昭和公司Shodex Asallipka NH2P-50 4E 氨基柱、日本東曹公司TOSOH TSK-GEL Amide-80 色譜柱和國產(chǎn)的華譜公司Click-Mal 色譜柱均為親水作用色譜柱。筆者研究比較了3 種色譜柱對于殼寡糖的分離效果和參數(shù)差異，并分析各自的分離機(jī)理，相應(yīng)結(jié)果尚未發(fā)表。親水作用色譜柱以硅膠或聚乙烯醇微球?yàn)榛?，固定相表面鍵合不同基團(tuán)，流動相選用無明顯差異。樹脂固定相是色譜分離技術(shù)的核心，近年來，基于親水作用色譜原理的新型色譜樹脂層出不窮。

孫敬明以合成的苯硼酸化硅膠為基質(zhì)，并裝填于分析型色譜柱中，在親水作用色譜條件下對自制色譜柱進(jìn)行保留特性研究驗(yàn)證，并實(shí)現(xiàn)了在流動相分別為75% 乙腈、25% 水溶液-1.8% 三乙胺條件下，將聚合度從2～6 的殼寡糖混合標(biāo)準(zhǔn)品完全分離，且峰形良好［22］。在孫敬明工作基礎(chǔ)上，Zhai 又合成了3-氨基苯硼酸化的硅膠作為基質(zhì)，裝填分析柱后的殼寡糖保留效果甚至達(dá)到或優(yōu)于市售產(chǎn)品［23］。國產(chǎn)華譜公司Click-Mal 色譜柱是基于點(diǎn)擊化學(xué)（Click chemistry）原理合成的麥芽糖鍵合硅膠柱，該色譜柱用于各種類型 寡糖分離純化的HILIC 方法，酸性寡糖、中性寡糖和堿性寡糖都得到很好的分離和純化，在相對分子質(zhì)量較大的寡糖方面，同樣表現(xiàn)出很高的分 辨率［24-25］。

5 結(jié)論與展望

色譜分離技術(shù)是一種分離復(fù)雜混合物中各個組分的有效方法，基于糖分離的色譜分離方法需綜合考慮糖分子的極性、氫鍵作用力、分子尺寸等。綜上介紹的4 種寡糖色譜分離技術(shù)，其各自分離機(jī)理、固定相特點(diǎn)、分離效果和制備放大方面存在明顯差異。凝膠過濾色譜是真正基于分子尺寸大小進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，適用于中性低聚寡糖，但其葡聚糖凝膠固定相因機(jī)械強(qiáng)度差不利于高柱壓的制備體系，而聚合物微球固定相所需的檢測溫度高、流量小，同樣也增加了工程放大的難度。離子交換色譜適用于酸性或者堿性低聚寡糖，其樹脂因機(jī)械強(qiáng)度高和交換容量大的特性，可實(shí)現(xiàn)制備級規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，但容易引入洗脫劑中的緩沖鹽或酸堿成分。金屬親和色譜多用于蛋白純化，在糖分離領(lǐng)域罕有報道。親水作用色譜是正相色譜的一種變化，可認(rèn)為是含水-有機(jī)流動相的正相色譜，可迅速有效地分離糖類、多肽以及低分子量的極性藥物，但高含量的有機(jī)相，特別是乙腈，限制了其在食品行業(yè)糖分離純化的應(yīng)用。

隨著糖生物學(xué)的發(fā)展，單一組分功能糖的分離需求愈發(fā)強(qiáng)烈，混合模式色譜和模擬移動床色譜在糖分離制備領(lǐng)域的應(yīng)用將有更大空間。混合模式色譜是兩種或多種機(jī)理混合的色譜技術(shù)，往往在分離選擇性和色譜峰形等方面能得到不同于單一模式操作所得到的效果，分離選擇性以及色譜峰形等都能得到極大的改善與提高［26］。模擬移動床技術(shù)是一種連續(xù)色譜技術(shù)，將二元組分或假二元混合物分離，生產(chǎn)能力和分離效率高于單柱色譜，目前已在低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等功能性低聚糖分離純化中得到應(yīng)用［27-28］，為單一聚合度殼寡糖的連續(xù)色譜分離技術(shù)研究提供了參考。