高效液相色譜法測定化妝品中水楊酸含量的不確定度評定

李靜靜，范菲，朱清

（西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054）

水楊酸最早是從柳樹皮中分離出的一種活性成分，后被證實(shí)是植物體內(nèi)廣泛存在的一種天然酚類化合物，對一些重要的代謝過程起調(diào)控作用，所以被看作為一種植物激素［1］。水楊酸除具有防腐殺菌作用外，還有止痛消炎，角質(zhì)剝脫，促進(jìn)皮膚新陳代謝的功能，被廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)，存在于各種去屑、美白和祛痘類化妝品中［2-3］。但水楊酸的角質(zhì)層剝脫功能在去角質(zhì)同時也具有腐蝕作用，易刺激皮膚、黏膜，過量使用會使皮膚的防御力變差［4-5］。因此不適宜長期使用，尤其不適用于兒童。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）［6］中采用高效液相色譜法對化妝品中的水楊酸進(jìn)行測定，并且明確規(guī)定了水楊酸在駐留類產(chǎn)品和淋洗類皮膚用產(chǎn)品中最大許可用量為2.0%，在淋洗類發(fā)用產(chǎn)品中最大許可用量為3.0%，但是在化妝品中作為防腐劑使用時，最大許可用量為0.5%，并注明除香波外，不得用于三歲以下兒童使用的產(chǎn)品中?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 版）對水楊酸的限量要求與舊版（2007 版）相同，但不同于舊版中將水楊酸作為去屑劑組分和其它組份共同測定。2015 年版首次增加了單獨(dú)針對化妝品中水楊酸含量的專屬檢測方法，反映了我國對于化妝品質(zhì)量安全性保障、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的專屬性和可操作性等在進(jìn)一步提高，加強(qiáng)了市場監(jiān)管力度。

測量不確定度是對測量結(jié)果準(zhǔn)確度的定量表征，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于不確定度的大?。?］?？紤]到測量過程中影響因素復(fù)雜，測定結(jié)果必然會帶有一定的不確定性，會導(dǎo)致評判依據(jù)可信度降低。所以測量結(jié)果附有不確定度說明才是完整并有意義的。近年來，各類檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)都開展了大量的不確定度評定工作［8-12］，以此提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度和可用性。筆者參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版），用高效液相色譜法對化妝品中水楊酸的含量進(jìn)行了測定，根據(jù)新版JJF 1059.1—2012 《測量不確定度評定與表示》［13］，建立數(shù)學(xué)模型，對這一實(shí)驗(yàn)過程的各項(xiàng)影響因素進(jìn)行了不確定度評估，為評定測量結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：ULTIMATE 3000 型，配DAD 檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司；

電子天平：MS105 型，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

電子天平：BSA124S-CW，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司；

水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品：99.9%，中國藥品生物制品檢定所；

甲醇、磷酸、氨水：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

磷酸溶液：稱取11.5 g 磷酸，加入950 mL 水，用氨水調(diào)節(jié)至pH2.3～2.5，加水至1 000 mL；

實(shí)驗(yàn)用具為計量檢定合格的A 級玻璃量器；

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 自制超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本SHISEIDO CAPCELL PAK）；檢測波長：300 nm；柱溫：30℃；流動相A：量取200 mL 磷酸溶液，并用水稀釋至1 000 mL；流動相B：量取250 mL 磷酸溶液，并用甲醇稀釋至1 000 mL；流量1.2 mL／min；梯度洗脫程序見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件

溫度為(20±5)℃，相對濕度不大于75%。

表1 梯度洗脫程序

1.4 水楊酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取水楊酸對照品50 mg 置于50 mL 容量瓶，用甲醇溶解并定容，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別精密量取1，2，5，10，20 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容后作為水楊酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 樣品處理

稱取樣品約0.25 g，置25 mL 具塞比色管中，加入甲醇20 mL，旋渦60 s，分散均勻，超聲提取15 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至標(biāo)線，渦旋振蕩搖勻后，用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后，作為待測溶液。

2 數(shù)學(xué)模型及測量不確定度的來源

2.1 數(shù)學(xué)模型

樣品中水楊酸含量按照式(1)計算：

式中：w——化妝品中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

D——稀釋倍數(shù)（不稀釋則為1）；

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的水楊酸質(zhì)量濃度，μg／mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g。

樣品測定結(jié)果的不確定度除上述計算公式中的ρ，V和m的影響外，重復(fù)測定樣品時的均勻性和一致性也會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 測量不確定度的來源

由式(1)分析，不確定度的來源如下。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度u(w)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱重u(m1)、玻璃量瓶u(V1)、玻璃移液管u(V2)、由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定 度u(C)；

（2）被測樣品引入的不確定度：包括樣品稱重u(m2)、定容u(V3)、樣品平行測定重復(fù)性引入的不確定度u(f)；

（3）測量時液相色譜儀引入的不確定度u(r)。

式(1)中各分量相互獨(dú)立，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照式(2)計算。

3 測量不確定度評定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.1 純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(w)

水楊酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)說明書標(biāo)識其純度為99.9%，但未給出其純度誤差范圍，假定其分布區(qū)間為±0.1%，其區(qū)間半寬度為0.1%，按均勻分布（矩形分布）考慮，包含因子3k=，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.2 天平稱重引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量所用天平的精度為十萬分之一，其不確定度來源主要考慮兩項(xiàng)：示值誤差u(m1a)、重復(fù)性誤差u(m1b)。

校準(zhǔn)證書給出的重復(fù)性誤差為0.15 mg，其區(qū)間半峰寬為0.075 mg，按矩形分布計算（3k=），則重復(fù)性引入的不確定度：

由以上兩項(xiàng)合成得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

實(shí)際稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為49.94 mg，其純度為99.9%，則天平稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.3 容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)

容量瓶引入的不確定度分量包括容量允差u(V1a)，和實(shí)驗(yàn)溫度與校正溫度差異引入的不確定度u(V1b)。

容量允差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）溫度校正引入的不確定度u(V1b)。已知實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為25℃，容量瓶校準(zhǔn)溫度為20℃，甲醇和玻璃的膨脹系數(shù)分別為1.2×10-3，2.5×10-4℃-1，按照均勻分布，包含因子3k=，溫度差異引入的不確定度：

u(V1b-1)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×50×(25-20)／k=0.14 (mL)

u(V1b-2)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×100×(25-20)／k=0.27 (mL)

溫度校正引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.4 移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)

同理，移液管引入的不確定度分量包括容量允差、實(shí)驗(yàn)溫度與校正溫度差異帶來的影響，數(shù)據(jù)列于表2。

表2 移液管引入的不確定度

移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

采用最小二乘法，以濃度C為橫坐標(biāo)，平均峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，結(jié)果列于表3。

表3 水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)結(jié)果

由表3 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=26.126 6C+5.385 5，其中，相關(guān)系數(shù)r2=1.000 0，斜率a=26.126 6，截距b=5.385 5。

按照式(3)計算標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

式中：n——標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，n=10；

a——線性回歸方程斜率；

b——線性回歸方程截距。

將上述各值代入式(3)，計算得s(A)=5.701 1。

按照式(4)計算由工作曲線變動引起濃度C的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C)：

式中：s(A)——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

N——樣品平行測定次數(shù)，N=4；

C——被測樣品溶液中水楊酸的質(zhì)量濃度，18.73 μg／mL；

C——標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均質(zhì)量濃度，75.83 μg／mL；

將上述各值代入式(4)，計算得u(C)=0.152 1，則標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2 被測樣品引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.1 樣品稱重引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)

合成得樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

已知樣品稱取兩份，分別為0.261 3 g，0.265 0 g，則樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 比色管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)

（2）溫度校正引入的不確定度。已知實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為25℃，比色管校準(zhǔn)溫度為20℃，甲醇和玻璃的膨脹系數(shù)分別為1.2×10-3和2.5×10-4℃-1，按照矩形分布（3k=），溫度校正引入的不確定度：

u(V3b)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×10×(25-20)／k=0.027 (mL)

比色管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.3 重復(fù)性測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f)

該不確定度為A 類評定，在實(shí)際測量樣品時，對2 份樣品各測定2 次（n=4），含量分別為18.44，18.50，18.98，18.99 μg／mL，實(shí)際測量中以平均值18.73 μg／mL 作為測量結(jié)果。

重復(fù)性測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 液相色譜儀引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(r)

由校準(zhǔn)證書上可知，高效液相色譜儀的定量重復(fù)性為0.21%，則其相對擴(kuò)展不確定度為0.21%。按分布計算，包含因子3k=，則液相色譜儀引入的的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.4 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

測量不確定度各分量的分析結(jié)果見表4。

表4 各分量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總

根據(jù)式(2)計算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.5 相對標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度

根據(jù)公式(1)和兩次獨(dú)立測定結(jié)果計算得到2 份化妝品樣品中水楊酸的含量為0.177%和0.179%，平均值為0.178%。因此其平均含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

取置信概率為95%，包含因子k=2。則相對標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度：

3.6 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度

化妝品中水楊酸含量的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度為：

3.7 不確定度報告

化妝品中水楊酸含量為0.178%±0.004%，k=2。

4 結(jié)語

高效液相色譜法測定水楊酸含量不確定度的主要影響來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品重復(fù)測定、玻璃量器的使用，以及樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稱重等。工作曲線各校準(zhǔn)點(diǎn)濃度均值應(yīng)盡量與被測樣品濃度均值C接近，可降低標(biāo)準(zhǔn)曲線變動引入的不確定度。在稱量樣品時，兩份樣品的稱量值應(yīng)當(dāng)盡量接近，可降低樣品重復(fù)測定引入的不確定度。在使用玻璃量器時，盡量使用校正級別高的量器，并且控制實(shí)驗(yàn)室溫度與量器校準(zhǔn)時溫度接近，可降低玻璃量器引入的不確定度。在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稱重時，在可操作范圍內(nèi)盡量加大取樣量，可降低由稱重引入的不確定度。