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    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中色氨酸和犬尿氨酸

    2020-07-31 08:16:04周資凱鄭柳鮑益帆楊麗章志遠(yuǎn)
    化學(xué)分析計(jì)量 2020年4期
    關(guān)鍵詞:色氨酸氨酸基質(zhì)

    周資凱,鄭柳,鮑益帆,楊麗,章志遠(yuǎn)

    (1.南昌大學(xué)環(huán)境資源與化工學(xué)院,南昌 330031; 2.臺(tái)州市臺(tái)環(huán)環(huán)境檢測(cè)科技有限公司,浙江臺(tái)州 318020)

    人體中的色氨酸和犬尿氨酸代謝途徑已被證實(shí)與許多疾病和失調(diào)有相關(guān)聯(lián)性,如人類免疫缺陷病毒的感染、亨廷頓病、阿爾茨海默病和精神分裂癥[1-2]。色氨酸先經(jīng)色氨酸-2,3-雙加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase,TDO)催化,再經(jīng)吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)和犬尿氨酸甲酰胺酶氧化代謝為犬尿氨酸。研究表明,色氨酸存在于紅肉類、乳制品和豆制品食物中,人體可從飲食或保健品中獲取。色氨酸為人體多種重要生物活性分子的前驅(qū)物質(zhì),其代謝過程及代謝產(chǎn)物犬尿氨酸與多種疾病的發(fā)生有關(guān),保持體內(nèi)色氨酸的代謝平衡對(duì)人體健康有著重要意義,因此定量測(cè)定體內(nèi)色氨酸及犬尿氨酸含量,對(duì)相關(guān)疾病的診斷治療具有重要價(jià)值。

    色氨酸和犬尿氨酸常用的分析方法是高效液相色譜法搭配不同的檢測(cè)器,如紫外光檢測(cè)器[3-5]、熒光檢測(cè)器[6-7]、二極管陣列檢測(cè)器[8-10]、電化學(xué)檢測(cè)器[11-12]和串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器等[13-18]。串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏和絕佳的選擇性,是目前試驗(yàn)生物基質(zhì)樣品檢測(cè)的首選。生物樣本基質(zhì)復(fù)雜,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度,常用的前處理方法有有機(jī)溶劑液相萃取[15,18]、固相萃?。?2-14]、固相微萃取和液相微萃 ?。?9]等。為了提高靈敏度有時(shí)也進(jìn)行衍生化液相微萃?。?7],但具有成本高,耗時(shí)長,樣品損失多,選擇性不佳和波峰分辨率不足甚至變形等缺點(diǎn),不利于大量多通道樣品的檢測(cè)。

    在藥物動(dòng)力學(xué)研究中,因某些藥物代謝的研究需去除色氨酸以對(duì)比犬尿氨酸的變化,從而判斷藥物作用,這種方法需要對(duì)大量生物樣本進(jìn)行研究。此外,考慮到色氨酸在營養(yǎng)食品中的添加狀況,需在低濃度線性范圍測(cè)定,因此有必要建立較寬的檢測(cè)范圍和簡便的凈化提取方式。在利用LC-MS/MS法對(duì)人和大鼠血漿進(jìn)行研究的文獻(xiàn)報(bào)道中[13-18],文 獻(xiàn)[14]方法測(cè)定色胺酸、犬尿氨酸的濃度分別為0.018~0.282,0.017~0.276 μmol/L,可應(yīng)用的測(cè)定范圍有限;文獻(xiàn)[18]方法測(cè)定色胺酸、犬尿氨酸的最低定量限分別為100,25 μg/L,殘留基質(zhì)會(huì)影響方法靈敏度。筆者建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)法同時(shí)測(cè)定和驗(yàn)證大鼠血漿中的色氨酸和犬尿氨酸,使用血液基質(zhì)樣本,因此更容易適用于其它基質(zhì)(血清、尿液等)樣品。該方法測(cè)定范圍廣,是一種快速、靈敏、簡便的生化分析方法。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:6130 型,配有1200 G1329 自動(dòng)進(jìn)樣器,1200 G1322A 真空裝置,1200 G1311A 二元泵,1200 G1316A 進(jìn)樣和管柱溫控裝置,1200 MSD 單四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器(G1948B 電噴霧離子源),04.01B 版化學(xué)工作站,美國安捷倫科技有限公司;

    臺(tái)式離心機(jī):Allegra 6R 型,美國貝克曼庫爾特有限公司;

    色氨酸:純度不小于99.0 %,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;

    犬尿氨酸:純度不小于98.0 %,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;

    4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯:純度為96.0%,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;

    甲酸:ACS 級(jí),純度為98%~100%,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;

    活性碳:西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;

    乙腈:色譜純,純度為99.9%,美國John Town send Baker;

    甲醇:色譜純,純度為99.9%,美國Macron Fine Chemicals;

    高氯酸:ACS 級(jí),純度為70.0 %,日本Showa Chemicals Industry;

    去離子水:R≥18 MΩ,Milli-Q 純水制造系統(tǒng)生產(chǎn),美國默克密理博有限公司,用于制備所有溶液。

    1.2 儀器工作條件

    1.2.1 色譜條件

    色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C8 型(150 mm× 4.60 mm,5 μm,美國安捷倫科技有限公司);流動(dòng)相:A 相為0.20%甲酸水溶液,B 相為乙腈;梯度洗脫程序:0.00~0.50 min 為85% A,1.00~3.00 min 為45% A,3.60~5.00 min 為85% A;流量:1.20 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。

    1.2.2 質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧(ESI);毛細(xì)管電壓:3 000 eV;碎片電壓:70.0 eV;干燥氣體:氮?dú)猓髁繛?2.5 L/min;噴霧器壓力:345 kPa;干燥溫度:350℃;管柱溫度:25℃;色氨酸、犬尿氨酸及EHQC 離子碎片特征離子:分別為205.1,209.1 和218.0m/z。

    1.3 血漿樣品前處理

    收集大鼠血漿利用活性碳凈化去除色氨酸。向1.00 mL 血漿中加入50.0 mg 活性碳混合,在室溫下震蕩0.5 h,然后以15 000 r/min 離心10.0 min,將上清液轉(zhuǎn)移至干凈微量離心管中,制成空白大鼠血漿于-80℃存放待用[20]。

    取40.0 μL 上述空白大鼠血漿加入25%高氯酸10.0 μL,0.2%甲酸50.0μL(或標(biāo)準(zhǔn)品溶液)和200 μg/L 4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯10.0μL,漩渦混合10.0 s,室溫下以15 000 r/min 離心10.0 min,將上清液轉(zhuǎn)移至干凈微量離心管內(nèi)待用。

    1.4 溶液的配制

    色氨酸和犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別取適量色氨酸和犬尿氨酸,用0.2%甲酸溶液溶解,制備成質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

    4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯溶液:取適量4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯,用甲醇-水(1∶100)混合液溶解制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L 的4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯溶液,然后稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg/L 的溶液,作為內(nèi)標(biāo)溶液。

    系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用空白大鼠血漿對(duì)色氨酸和犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行連續(xù)稀釋,制成質(zhì)量濃度均分別為0.500,1.00,5.00,10.0,50.0,100,500,1.00×103,5.00×103,1.00×104μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    質(zhì)控樣品:向空白大鼠血漿中加入適量已知濃度的色氨酸、犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制備成質(zhì)量濃度均分別為2.00,40.0,80.0,800,8.00×103μg/L的質(zhì)控樣品。

    1.5 穩(wěn)定性考察

    凍融循環(huán)穩(wěn)定性:取5 組質(zhì)控樣品分別在4℃和-80℃下進(jìn)行5 次凍融循環(huán),然后進(jìn)行測(cè)定,考察該條件下的穩(wěn)定性。

    室溫穩(wěn)定性:將配制好的質(zhì)控樣品分別在室溫下保存3,6,9,12,15,36,48,60,72,84,96,108,120 h,然后進(jìn)行測(cè)定,考察該條件下的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 樣品前處理方法選擇

    生化樣品常見的快速脫蛋白和去基質(zhì)干擾的前處理方法是直接加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀反應(yīng)[10,12,17-18,20-21],再剝離取上清液。研究發(fā)現(xiàn)這種方式會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低,且選擇性不足,以及色譜峰拖尾和滯留時(shí)間延長[15-16,18]。據(jù)文獻(xiàn)[20]介紹,活性碳可吸附血漿中絕大部分生物基質(zhì)??疾煜?.00 mL 血漿樣品中加入不同量(25.0,50.0 和75.0 mg)的活性炭,經(jīng)過不同混合時(shí)間(0.5,1,2,4,6 和24 h)后進(jìn)行測(cè)定。其中,混合24 h 與混合6 h的試驗(yàn)結(jié)果相比已無明顯優(yōu)化,因此不再考慮。其它條件下試驗(yàn)結(jié)果圖1 所示。

    由圖1 可知,活性炭添加量為75.0 mg,混合時(shí)間為6 h 時(shí)純化效果最佳,但是其色氨酸與LOD 比值與50 mg 混合0.5 h 差異不明顯,對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。考慮減少總耗時(shí),并對(duì)后續(xù)分析無明顯影響的原則,選擇活性炭添加量為50 mg,混合時(shí)間為0.5 h。優(yōu)化后的前處理可以獲得較低的檢出限和定量限,可快速,簡便的獲取大量優(yōu)質(zhì)純化血漿樣品。

    圖1 活性碳添加劑量與混合時(shí)間對(duì)空白血漿中色氨酸吸附的影響

    在1.2 儀器工作條件下,對(duì)空白大鼠血漿樣品進(jìn)行測(cè)定并評(píng)估方法特異性,將空白血漿樣品中色氨酸和犬尿氨酸的色譜峰面積與質(zhì)量濃度為0.200 μg/L 的樣品溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行比較,試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知,空白血漿樣品中測(cè)定的色譜峰面積僅為檢出限試驗(yàn)樣品對(duì)應(yīng)色譜峰面積的6.43%(被測(cè)物含量小于檢出限的20.0%),表明前處理方法對(duì)于色氨酸和犬尿氨酸具有有效特 異性。

    表1 空白血漿與檢出限試驗(yàn)樣品色譜峰面積(n=6)

    2.2 緩沖溶液的選擇

    為得到更好的分析物峰形,對(duì)同濃度下不同緩沖液(乙酸鈉、硼酸鈉、磷酸鹽、乙酸銨和甲酸溶液)進(jìn)行了平行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,使用0.2 %甲酸溶液可獲得最佳分辨率和最尖銳的波峰,同時(shí)發(fā)現(xiàn)緩沖溶液中某些離子與分析物會(huì)發(fā)生較強(qiáng)的相互作用,導(dǎo)致色譜圖出現(xiàn)寬峰,影響分離結(jié)果,而甲酸可有效增加分析物離子化程度[20]。綜合上述條件,色氨酸和犬尿氨酸的測(cè)定滯留時(shí)間分別為2.71,2.07 min。大鼠血漿的質(zhì)控樣品色譜圖如圖2 所示。在優(yōu)化好的最佳條件下,總分析時(shí)間小于4.00 min。

    圖2 大鼠血漿的質(zhì)控樣品色譜圖

    2.3 線性關(guān)系與檢出限

    在1.2 儀器條件下,對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析,以待測(cè)物質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算線性方程與相關(guān)系數(shù)R2。用全空白血漿(只加入4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯)進(jìn)行基質(zhì)測(cè)定,以3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限,以10 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算定量限。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限列于表2。

    表2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

    由表2 可知,待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度在 0.500~ 1.00×104μg/L 的范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好,可應(yīng)用于多數(shù)生物基質(zhì)樣本的分析。

    據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,測(cè)定色氨酸和犬尿氨酸的檢出限分別為4.23~7.21,0.0250~3.60 μg/L,測(cè)定色氨酸和犬尿氨酸的定量限分別為8.46~500 和9.81~25.0 μg/L[12-17],對(duì)比表3 可知,本方法靈敏度高,適合運(yùn)用于生物基質(zhì)樣品中的分析檢測(cè)

    2.4 精密度試驗(yàn)

    將凈化好的血漿樣品配制高中低3 種不同濃度進(jìn)行測(cè)定,將樣品按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果列于表3。由表3 可知,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.7%,表明該方法測(cè)定色氨酸和犬尿氨酸精密度良好。

    表3 大鼠血漿中分析物的精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

    2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

    以凈化處理過的空白血液樣品為基底進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率數(shù)據(jù)列于表4。由表4 可知,色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率分別為99.2%~101%和100%~102%。結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

    表4 大鼠血漿樣品的絕對(duì)回收率(n=5)

    2.6 穩(wěn)定性考察

    按1.6 方法對(duì)兩種成分濃度均為2.00 μg/L的樣品在4,-80℃下進(jìn)行凍融循環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn),以及在室溫120 h 內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果列于表5和表6。由表5 和表6 可知,大鼠血漿樣品在4℃和-80℃下凍融循環(huán),以及室溫120 h 內(nèi)表現(xiàn)極為穩(wěn)定,沒有顯著降解和其它變化,存儲(chǔ)過程中使用不含或含極少量的有機(jī)溶劑,也能夠有效幫助樣品儲(chǔ)備溶液長期保存,對(duì)復(fù)雜的生物基質(zhì)樣品前處理方法具有重要性。

    表5 大鼠血漿樣品凍融循環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

    表6 大鼠血漿室溫放置120 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

    3 結(jié)語

    采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中色氨酸和犬尿氨酸,優(yōu)化了適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理方法,有效地解決了生物基質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。此方法可為藥物動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究提供參考。與文獻(xiàn)方法[13-18]相比,本方法可達(dá)到與文獻(xiàn)報(bào)道的方法相同甚至更佳的結(jié)果,全過程幾乎不需要有機(jī)溶劑或有毒溶液,污染小,廢棄物少,相對(duì)更綠色環(huán)保,節(jié)省時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本,效益極高,樣品溶液穩(wěn)定性好。該凈化方法和分析方法已成功應(yīng)用于人類、小鼠、狗的血漿處理與分析。

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