鎘砷在線蚓中的毒物-毒效動(dòng)力學(xué)過(guò)程及定量模擬

李 敏，龔 冰，黃雪瑩，肖 雪，何爾凱*，仇榮亮

（1.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006；2.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200240；3.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)，廣州510006；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州510642）

隨著人類(lèi)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，土壤重金屬污染形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，在導(dǎo)致土壤環(huán)境產(chǎn)生污染的元素中，重金屬鎘（Cd）、類(lèi)金屬砷（As）問(wèn)題尤為突出，已引起人們的廣泛關(guān)注[1]。環(huán)境中的Cd主要來(lái)源于核工業(yè)、農(nóng)業(yè)、電鍍及化工領(lǐng)域[2]，As 主要來(lái)源于采礦、冶煉及化石燃料的燃燒[3-4]，這些人為來(lái)源產(chǎn)生的Cd、As大量進(jìn)入水體和土壤中，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成潛在危害。在自然界中過(guò)量的Cd、As等毒性元素不可降解，被生物吸收后會(huì)在其體內(nèi)不斷累積，根據(jù)毒性閾值假設(shè)（Critical body residue，CBR），當(dāng)累積濃度達(dá)到元素的毒性閾值時(shí)就會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的毒性效應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Cd 污染會(huì)抑制米氏凱倫藻細(xì)胞的增長(zhǎng)[6]，造成玉米、黃瓜葉片發(fā)黃、生長(zhǎng)緩慢[2]。As 污染會(huì)對(duì)淡水魚(yú)的皮膚造成損傷，引起肌肉萎縮惡化[7-8]，As進(jìn)入人體后還會(huì)蓄積在甲狀腺、腎以及頭發(fā)等處，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害[9]。

以往對(duì)金屬的毒理學(xué)研究多關(guān)注某一固定暴露時(shí)間下對(duì)生物體的毒性效應(yīng)，以此確定污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。然而研究顯示污染物在生物體內(nèi)的累積過(guò)程具有時(shí)間依賴(lài)性，導(dǎo)致毒性效應(yīng)會(huì)隨暴露時(shí)間而變化[10]。Zhang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，鉛（Pb）暴露下線蚓的存活率明顯下降；He 等[12]研究表明隨著暴露時(shí)間的增加，金屬鎳（Ni）對(duì)線蚓的半數(shù)致死濃度（LC50）逐漸變小。由此可見(jiàn)，基于急性毒性結(jié)果往往不能全面反映污染物的長(zhǎng)期暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此，為準(zhǔn)確評(píng)估不同時(shí)間尺度下的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，有必要深入開(kāi)展Cd、As的動(dòng)態(tài)毒性效應(yīng)研究，建立健全重金屬污染土壤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。利用毒物毒效動(dòng)力學(xué)模型（TK-TD）可以同時(shí)考慮暴露濃度與暴露時(shí)間的影響，從而闡明污染物在生物體內(nèi)的累積和毒性作用過(guò)程[13-14]。毒物動(dòng)力學(xué)描述了污染物在暴露期間從體外進(jìn)入體內(nèi)的過(guò)程，包括其吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化和排除；毒效動(dòng)力學(xué)過(guò)程將體內(nèi)濃度和毒性作用有機(jī)地聯(lián)系在一起，描述了時(shí)間和毒性響應(yīng)的關(guān)系，包括機(jī)體損傷和恢復(fù)過(guò)程。

除了暴露時(shí)間外，生物有效性是影響污染物毒性的另一重要因素。重金屬的環(huán)境暴露濃度通常被作為指示毒性效應(yīng)的暴露劑量，然而金屬的毒性實(shí)際是由其被生物吸收并和毒性作用位點(diǎn)結(jié)合的部分（即生物有效濃度）決定的[15]。金屬的生物有效性受到環(huán)境因素，如：pH 值、環(huán)境共存陽(yáng)離子、有機(jī)/無(wú)機(jī)配體等的影響[16-18]。相較于重金屬的環(huán)境暴露濃度，體內(nèi)濃度考慮了生物吸收過(guò)程中環(huán)境因素對(duì)重金屬生物有效性的影響，因此能更好地指示毒性作用[12，19]。對(duì)于進(jìn)入到生物體內(nèi)的金屬，生物體也能夠通過(guò)調(diào)控金屬與毒性作用位點(diǎn)的結(jié)合來(lái)降低其毒性作用[20]。研究Cd、As在線蚓體內(nèi)含量與毒性作用的相關(guān)性，對(duì)理解其生物有效性具有重要意義。

線蚓（Enchytraeus crypticus）屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)寡毛綱單向蚓目線蚓科，廣泛分布于多種土壤中，因其生命周期短、繁殖率高、對(duì)土壤特性（例如pH值、黏土含量、有機(jī)質(zhì)含量、溫度）的耐受范圍大[21-22]，且對(duì)環(huán)境脅迫較為敏感，已成為陸生生態(tài)毒理學(xué)研究的重要模式生物，能夠用以預(yù)示土壤的生態(tài)和環(huán)境健康狀況。在土壤-動(dòng)物研究體系中，目前對(duì)重金屬進(jìn)入土壤中的環(huán)境行為過(guò)程已有較多了解，但對(duì)于不同時(shí)間尺度下重金屬對(duì)土壤動(dòng)物的毒性效應(yīng)過(guò)程認(rèn)知較少，因此，有必要構(gòu)建TK-TD 模型定量描述Cd、As 在線蚓中的動(dòng)態(tài)累積和毒性作用過(guò)程。

本文以我國(guó)污染土壤中常見(jiàn)的Cd、As 為研究對(duì)象，典型土壤動(dòng)物線蚓（Enchytraeus crypticus）為受試生物，采用室內(nèi)試驗(yàn)和模型擬合等手段，系統(tǒng)研究Cd、As對(duì)線蚓的動(dòng)態(tài)累積和毒性作用過(guò)程，從毒物動(dòng)力學(xué)-毒效動(dòng)力學(xué)角度闡明Cd、As毒性作用機(jī)制。以期深入了解Cd、As 作用下土壤動(dòng)物的毒性響應(yīng)規(guī)律和機(jī)理，為精準(zhǔn)評(píng)價(jià)Cd、As污染對(duì)陸生生態(tài)系統(tǒng)的影響提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 受試生物

線蚓（Enchytraeus crypticus）因?qū)χ亟饘?、有機(jī)物等化學(xué)物質(zhì)的敏感性而作為模式生物廣泛應(yīng)用于土壤生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)中[22]。本試驗(yàn)中的受試生物線蚓取自中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，線蚓被置于溫度為20 ℃、相對(duì)濕度為75%的黑暗氣候室中，在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖。每周給其喂兩次燕麥制成的食物。選取同一時(shí)期繁殖、長(zhǎng)度約為1 cm 且大小相對(duì)一致的線蚓成蟲(chóng)用于毒性試驗(yàn)，可通過(guò)觀測(cè)其頭部是否具有白色的生殖環(huán)帶來(lái)確定其是否為成蟲(chóng)。

1.2 暴露介質(zhì)

本研究采用溶液-惰性沙體系作為暴露介質(zhì)。從河灘采集的沙經(jīng)自來(lái)水不斷沖洗干凈后烘干，用60 目的篩網(wǎng)分選得到顆粒較小的沙粒，隨后置于600 ℃的馬弗爐中燒制3 h 以去除沙中的有機(jī)質(zhì)，待冷卻后用2%～3%的硝酸浸泡0.5 h，以去除有機(jī)殘留物及鐵錳的碳酸鹽化合物，浸泡之后用自來(lái)水沖洗，洗去殘余的酸，再用去離子水清洗，最后置于60 ℃的烘箱中烘干后即可得到惰性沙。

用含有0.2 mmol·L-1Ca2+、0.05 mmol·L-1Mg2+、2.0 mmol·L-1Na+和0.078 mmol·L-1K+的模擬土壤溶液作為基礎(chǔ)溶液，制備不同濃度的Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（Na3AsO4）暴露溶液。用0.75 g·L-1MOPS[3-（N-嗎啉代）丙烷磺酸]和0.75 mg·L-1MES[2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸]pH緩沖液將所有暴露溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0。

1.3 毒性測(cè)試

動(dòng)態(tài)累積和毒性測(cè)試設(shè)置6 個(gè)不同的暴露時(shí)間：1、2、4、7、10 d 和14 d。Cd、As 的暴露濃度分別設(shè)置為：0.04、0.08、0.16、0.20、0.24、0.32、0.40、0.48 mmol·L-1和0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00、2.40 mmol·L-1。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱(chēng)取20 g 制備好的惰性沙，然后分別加入5.5 mL 配制好的暴露溶液，放置24 h 使其達(dá)到平衡即得到模擬土壤溶液體系。待體系平衡1 d 后，選擇10 條線蚓成蟲(chóng)放入平衡體系中進(jìn)行毒性暴露[12]。

整個(gè)試驗(yàn)暴露期間均在溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為75%、光照16 h、黑暗8 h的人工氣候室進(jìn)行，且在暴露期間每2 d給樣品補(bǔ)充因蒸發(fā)作用而失去的水分，確保整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定的暴露濃度。為避免食物中有機(jī)質(zhì)對(duì)金屬形態(tài)的影響，在此期間不進(jìn)行喂食。在每個(gè)毒性試驗(yàn)暴露終點(diǎn)統(tǒng)計(jì)線蚓的死亡率，收集存活的線蚓，用高純水清洗數(shù)遍，去除線蚓表面殘留的暴露溶液，然后放入-20 ℃的冰箱中保存待測(cè)其體內(nèi)濃度。

1.4 樣品測(cè)試及數(shù)據(jù)分析

將收集到的線蚓樣品冷凍干燥至少48 h，并用微量天平（Mettler-Toledo XPR2U）稱(chēng)質(zhì)量，然后轉(zhuǎn)移到潔凈的玻璃管中，加入HNO3（65%～68%，GR）通過(guò)逐步升溫加熱步驟消解線蚓樣品，將玻璃管中的殘留物溶于5 mL HNO3（1%）中，用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS；NexION 350D；Perkin Elmer）分別測(cè)定線蚓體內(nèi)Cd、As 的濃度。每次消解時(shí)需設(shè)置2 個(gè)空白樣，以確保消解過(guò)程中無(wú)污染。暴露溶液中Cd、As的濃度由電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES，Optima 5300DV，PE）測(cè)定，實(shí)測(cè)的Cd、As 濃度用于進(jìn)行本研究中所有數(shù)據(jù)處理和模型擬合。

1.5 毒物動(dòng)力學(xué)-毒效動(dòng)力學(xué)模型

1.5.1 毒物動(dòng)力學(xué)模型

假設(shè)化學(xué)物質(zhì)（Cd、As）的濃度在暴露過(guò)程中保持穩(wěn)定，可利用一室模型（One-compartment model）通過(guò)吸收速率常數(shù)（Ku，mg·kg-1·d-1）和排出速率常數(shù)（Ke，d-1）描述Cd、As在生物體中的動(dòng)態(tài)積累過(guò)程：

式中：C0（t）是在不同暴露時(shí)間下生物體內(nèi)Cd、As 的濃度，mg·kg-1；Cw是Cd、As 的體外暴露濃度，mmol·L-1。通過(guò)公式（1）擬合Cd、As 不同暴露濃度、暴露時(shí)間下在生物體內(nèi)的濃度數(shù)據(jù)，可以分別得出其吸收速率常數(shù)（Ku，mg·kg-1·d-1）和排出速率常數(shù)（Ke，d-1）。

1.5.2 毒效動(dòng)力學(xué)模型

不同暴露時(shí)間下，線蚓在不同暴露濃度溶液中的存活率可采用log-logistic模型來(lái)進(jìn)行描述：

式中：S（t）是在不同暴露時(shí)間下線蚓的存活量；Cw是Cd、As溶液實(shí)測(cè)暴露濃度（mmol·L-1）或Cd、As的體內(nèi)濃度（mg·kg-1）；Smax是在暴露濃度下的最大存活數(shù)；LC50（t）是不同暴露時(shí)間下線蚓的半數(shù)致死濃度，mmol·L-1；b是斜率參數(shù)。

LC50與暴露時(shí)間之間的關(guān)系可以用時(shí)間-毒性響應(yīng)方程表示：

式中：LC50∞是指最終LC50值，mmol·L-1；Kd是根據(jù)毒性數(shù)據(jù)得出的毒效動(dòng)力學(xué)過(guò)程的損傷速率常數(shù)，d-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中的模型擬合采用軟件JMP 16.0（SAS Institute）中的求解功能。例如，Cd、As 的吸收和排出速率常數(shù)（Ku和Ke），需要利用最小二乘法，通過(guò)最小化體內(nèi)濃度模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的殘差平方和擬合一室方程得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于一室模型定量描述Cd、As動(dòng)態(tài)累積過(guò)程

不同Cd、As暴露濃度下，線蚓體內(nèi)濃度與暴露時(shí)間的關(guān)系如圖1 所示?？傮w上，生物體內(nèi)Cd、As 的累積濃度與暴露濃度和暴露時(shí)間呈顯著正相關(guān)性。Cd在線蚓體內(nèi)的濃度隨時(shí)間變化不斷升高，而As 暴露下（除最高濃度1.593 mmol·L-1）其體內(nèi)濃度在暴露4 d 后基本達(dá)到平衡狀態(tài)。Cd 在線蚓體內(nèi)的累積濃度顯著高于As，Cd、As體內(nèi)濃度的最大值分別出現(xiàn)在暴露后的第10 d和第4 d，分別為459.6、32.91 mg·kg-1。

當(dāng)使用一室模型[公式（1）]擬合不同暴露濃度下線蚓體內(nèi)的Cd、As含量隨時(shí)間變化的關(guān)系時(shí)，可以得到如表1 所示的不同暴露濃度下Cd、As 在線蚓體內(nèi)的吸收速率常數(shù)Ku和排出速率常數(shù)Ke。Cd、As 的Ku值均隨著濃度的增加而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，Cd、As的Ku最小值分別出現(xiàn)在暴露濃度為0.338、1.126 mmol·L-1時(shí)，分別為1.648、0.063 mg·kg-1·d-1。而Cd、As的排出速率常數(shù)Ke值隨暴露濃度的變化無(wú)明顯規(guī)律。將所有Cd、As 暴露濃度下線蚓的體內(nèi)濃度數(shù)據(jù)一同擬合時(shí)，得到Cd、As總吸收速率Ku和總排出速率Ke分別為1.761、0.102 mg·kg-1·d-1和0.015、0.287 d-1。

圖1 不同暴露濃度下線蚓體內(nèi)Cd和As含量隨暴露時(shí)間的變化Figure 1 Relationship between body concentration and exposure time in Enchytraeus crypticus exposed todifferent concentrations of Cd and As

表1 基于一室模型擬合得到的Cd、As吸收-釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Estimated uptake，elimination parameters of Cd and As by fitting dynamic body concentration to One-compartment model

2.2 基于時(shí)間-毒性響應(yīng)方程描述Cd、As 的動(dòng)態(tài)毒性效應(yīng)

不同Cd、As 暴露濃度下線蚓的存活率隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖2 所示。在14 d 的暴露時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)生物死亡，隨著Cd、As暴露濃度和暴露時(shí)間的增加，線蚓的存活率不斷降低?；隗w外暴露濃度，利用log-logistic 模型得到不同暴露時(shí)間下Cd、As 對(duì)線蚓的半數(shù)致死濃度LC50（表2）。隨著暴露時(shí)間的增加，Cd、As 的LC50值分別從0.537 mmol·L-1下降到0.208 mmol·L-1、從1.856 mmol·L-1下降到1.128 mmol·L-1，均在暴露7 d 后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)（圖3）。通過(guò)比較相同暴露時(shí)間下Cd、As的LC50值，可以看出Cd 的毒性強(qiáng)度是As 的3～5 倍。利用時(shí)間-毒性響應(yīng)方程對(duì)不同暴露時(shí)間下Cd、As的LC50值進(jìn)行擬合，得到最終半致死濃度LC50∞和損傷速率常數(shù)Kd值，Cd、As 的LC50∞值分別為0.314、1.253 mmol·L-1，Kd值分別為0.738、1.077 d-1（表2）。

2.3 基于Cd、As體內(nèi)吸收預(yù)測(cè)動(dòng)態(tài)毒性效應(yīng)

不同暴露濃度和暴露時(shí)間下Cd、As 在線蚓中的體內(nèi)濃度與其相應(yīng)存活率的相關(guān)性如圖4 所示。整體上可以看出，Cd、As的毒性效應(yīng)隨其體內(nèi)濃度的增加而不斷加強(qiáng)，相較于Cd，As的體內(nèi)濃度與毒性效應(yīng)（存活率）具有更好的相關(guān)性（R2=0.75）。利用公式（2）擬合不同Cd、As 體內(nèi)濃度和毒性數(shù)據(jù)，得到基于體內(nèi)濃度的半數(shù)致死濃度LC50inter值（表3），Cd、As 的總LC50inter值分別為468.8、26.65 mg·kg-1，說(shuō)明線蚓體內(nèi)As 的毒性強(qiáng)于Cd。當(dāng)分別擬合不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)濃度與毒性數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cd 的LC50inter值隨著暴露時(shí)間的增加而上升，而As 的LC50inter值隨著時(shí)間基本保持不變。

圖3 基于體外暴露濃度獲得的Cd、As半數(shù)致死濃度隨暴露時(shí)間的變化Figure 3 Toxic effects（LC50）of Cd and As on Enchytraeuscrypticus with exposure time

圖2 不同暴露時(shí)間下線蚓存活率與Cd、As暴露濃度之間的劑量-響應(yīng)關(guān)系Figure 2 Dose-response relationship between Enchytraeus crypticus survival fraction of organisms and exposure concentration of Cd and As under different exposure times

表2 基于體外暴露濃度利用log-logistics方程擬合得到的不同暴露時(shí)間下Cd、As半數(shù)致死濃度及基于時(shí)間-毒性響應(yīng)方程擬合得到的動(dòng)態(tài)毒性參數(shù)Table 2 LC50 values of Cd and As to Enchytraeus crypticus calculated using a log-logistics model and the estimated parametersby fitting LC50 values under different exposure

圖4 不同暴露濃度和暴露時(shí)間下Cd、As的體內(nèi)濃度與存活率的相關(guān)性Figure 4 Correlation between survival fraction and the body concentrations of Cd and As under different exposure concentrations and exposure time

3 討論

3.1 重金屬Cd和As在線蚓體內(nèi)動(dòng)態(tài)累積過(guò)程的差異性

已有研究表明，重金屬在生物體內(nèi)的累積具有濃度依賴(lài)性，同時(shí)暴露時(shí)間也是影響生物體內(nèi)濃度的重要因素，重金屬的生物累積與劑量和時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)跳蟲(chóng)和線蚓體內(nèi)的Cd、Zn 含量會(huì)隨暴露時(shí)間增加而不斷升高，并最終達(dá)到平衡狀態(tài)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)重金屬Cd 和類(lèi)金屬As 在線蚓體內(nèi)的累積過(guò)程也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，這表明金屬在生物體中的累積是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。本研究利用一室模型來(lái)描述金屬在線蚓體內(nèi)的吸收和排出過(guò)程，模型很好地?cái)M合了Cd、As的動(dòng)態(tài)累積數(shù)據(jù)，表明吸收和排出速率常數(shù)可以用來(lái)描述環(huán)境中不同暴露水平下Cd、As的毒物動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在本研究中，Cd 的總吸收速率Ku大于As，而排出速率Ke小于As，Cd 在線蚓體內(nèi)的累積量遠(yuǎn)大于As，表明Cd相較于As更容易在生物體內(nèi)富集。Sheppard 等[28]指出Cd 排出速率低的原因可能是金屬Cd 易與生物體內(nèi)金屬硫蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致生物體內(nèi)Cd 的濃度隨著時(shí)間變化呈明顯增加趨勢(shì)。同樣，研究發(fā)現(xiàn)[29]Cd、As 在枇杷中的累積情況與本研究結(jié)果類(lèi)似，Cd 的生物體內(nèi)濃度遠(yuǎn)大于As 的濃度。而吳慶其[30]研究發(fā)現(xiàn)在金針菇培養(yǎng)料中添加Cd（0.1～20 mg·kg-1）和As（0.1～15 mg·kg-1）后，子實(shí)體的Cd、As 累積濃度相差不大，這表明不同金屬在不同生物體中累積能力具有差異性。

表3 基于體內(nèi)濃度利用log-logistics方程擬合得到的不同暴露時(shí)間下Cd、As對(duì)線蚓的半數(shù)致死濃度（LC50inter）Table 3 LC50 values of Cd and As to Enchytraeus crypticus related to body Cd and As concentrations at different exposure timesseparately and all data together

通過(guò)一室模型擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cd、As 的吸收速率Ku值隨著濃度增加呈下降趨勢(shì)，先前的研究[31]也有相似發(fā)現(xiàn)，將蚯蚓暴露于含Cd 10 mg·kg-1和100 mg·kg-1的土壤中時(shí)，Cd 的吸收速率常數(shù)從0.214 mg·kg-1·d-1降至0.104 mg·kg-1·d-1。Zhang 等[11]和He 等[12]分別研究了Ni 和Pb 在線蚓體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)吸收速率常數(shù)在達(dá)到峰值后會(huì)隨暴露濃度升高而降低。暴露濃度升高導(dǎo)致吸收速率下降一方面可能是受到負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的載體的限制，另一方面在金屬高暴露濃度下細(xì)胞死亡率增加，進(jìn)而導(dǎo)致生物對(duì)毒物的吸收能力降低[32]。與吸收速率常數(shù)Ku相比，排出速率常數(shù)Ke在很大程度上取決于受試生物本身，較少受到暴露濃度的影響[33]。

3.2 重金屬Cd和As對(duì)線蚓的動(dòng)態(tài)毒性影響區(qū)別

重金屬的暴露會(huì)顯著降低生物的存活率[34]，而且金屬的毒性會(huì)隨著暴露時(shí)間的增加而增強(qiáng)，然后達(dá)到穩(wěn)態(tài)[10]。本研究結(jié)果同樣顯示隨著暴露時(shí)間的增加，Cd、As的毒性不斷增強(qiáng)并在7 d后達(dá)到平衡。前人研究發(fā)現(xiàn)暴露在Pb 中的赤子愛(ài)勝蚓的LC50值隨時(shí)間增加而降低，最后在21 d 趨于平衡[35]。王順昌等[36]將秀麗線蟲(chóng)暴露在5 mmol·L-1的砷酸鈉中，發(fā)現(xiàn)隨著暴露時(shí)間的增加，線蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯大于對(duì)照組，表明As 的毒性效應(yīng)隨著時(shí)間增加而明顯增強(qiáng)。因此，在對(duì)Cd、As的生物毒性研究中應(yīng)該充分考慮時(shí)間因素的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)Cd、As 的損害速率Kd值均大于0，最終半致死濃度LC50∞Cd小于LC50∞As，表明Cd和As均對(duì)線蚓產(chǎn)生毒性且Cd 的毒性作用強(qiáng)As。Vellinger 等[37]將淡水魚(yú)分別暴露在Cd、As 中240 h 后，發(fā)現(xiàn)以存活率為終點(diǎn)的LC50As遠(yuǎn)大于LC50Cd，與本研究結(jié)果一致。Cd、As 毒性作用的差異可能是由于二者進(jìn)入細(xì)胞的方式和毒性作用機(jī)理不同，Reid 等[38]研究發(fā)現(xiàn)Cd 會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)Ca的運(yùn)輸和代謝，Cd2+在細(xì)胞基底膜水平通過(guò)Ca2+-ATPase 或Na+/Ca2+交換的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[39-41]，由于Cd2+和Ca2+的離子形式相似，所以它們可以競(jìng)爭(zhēng)同一種類(lèi)型的配體，因此Cd 的二價(jià)離子形態(tài)具有更高的生物利用度及毒性[42]。As 則通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[43]進(jìn)入細(xì)胞，砷酸鹽可能會(huì)干擾電子傳輸鏈或葡萄糖代謝中的磷酸化反應(yīng)[44-47]，進(jìn)而阻礙葡萄糖的代謝及能量的產(chǎn)生[48]。

3.3 Cd和As在線蚓體內(nèi)的累積和毒性的關(guān)系

先前的研究表明，體內(nèi)濃度由于已經(jīng)考慮了暴露介質(zhì)及暴露時(shí)間對(duì)毒物動(dòng)力學(xué)過(guò)程的影響，因此相較于體外暴露濃度可以更好地作為動(dòng)態(tài)毒性的指示指標(biāo)[12，49]。本研究發(fā)現(xiàn)基于體內(nèi)濃度計(jì)算得到As 的LC50inter值隨著時(shí)間變化整體保持不變，這與之前的研究結(jié)果類(lèi)似[27]。而Cd 的LC50inter值隨著暴露時(shí)間的增加不斷變化，而且基于體內(nèi)濃度表達(dá)毒性效應(yīng)時(shí)Cd的毒性強(qiáng)度小于As，這與基于體外濃度得到的毒性作用結(jié)果不同。這可能是由于金屬Cd進(jìn)入生物體后會(huì)誘導(dǎo)金屬硫蛋白MT 的產(chǎn)生，而MT 是生物體內(nèi)重要的解毒物質(zhì)[50]，Wallace 等[51]研究表明，將草蝦飲食中的Cd 暴露量增加5 倍會(huì)導(dǎo)致總Cd 組織濃度增加18 倍，但由于MT 的誘導(dǎo)，其細(xì)胞溶質(zhì)中Cd 的儲(chǔ)存量增加了32 倍。MT 的增加導(dǎo)致更多的Cd 與其結(jié)合，進(jìn)而不斷減弱生物體內(nèi)Cd 的毒性作用，這也進(jìn)一步表明Cd 的體內(nèi)濃度并不能完全代表其生物有效濃度以指示其毒性生物。趙俊杰[52]研究也指出，在Cd暴露下蚯蚓體內(nèi)MT 含量隨著暴露時(shí)間而升高，產(chǎn)生的MT 會(huì)不斷與Cd 結(jié)合，因此會(huì)降低Cd 對(duì)生物體的毒性。積累在生物體內(nèi)的金屬會(huì)被生物體通過(guò)代謝排出，或分布在不同組織中，從而抑制其與毒性作用位點(diǎn)的結(jié)合，這些生物體內(nèi)部的解毒機(jī)制影響了金屬在生物體內(nèi)累積濃度與其毒性效應(yīng)的相關(guān)性，進(jìn)而影響體內(nèi)濃度對(duì)金屬毒性效應(yīng)的有效預(yù)測(cè)[53]。

累積在生物體內(nèi)的部分金屬通過(guò)與毒性作用位點(diǎn)的結(jié)合從而對(duì)生物產(chǎn)生毒性。金屬會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生過(guò)氧化氫和自由基等活性氧物質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物累積，從而破壞細(xì)胞膜，造成DNA 損傷并干擾抗氧化防御系統(tǒng)[52，54]。研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)受到重金屬Cd 脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O-2）、羥自由基（·OH）和H2O2等[55]。如果這些ROS 不能被及時(shí)有效地清除，將造成氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)組織和器官的損傷。楊瑞瑛等[56]研究發(fā)現(xiàn)累積在大鼠體內(nèi)的As 主要分布在細(xì)胞的微粒體中，這些As會(huì)與巰基酶結(jié)合使酶失活，干擾細(xì)胞的生物功能、結(jié)構(gòu)和正常代謝，其中分布在細(xì)胞核中的As會(huì)引起DNA 的氧化損傷并抑制抗氧化酶的產(chǎn)生，使得細(xì)胞中的過(guò)氧化氫（H2O2）蓄積，進(jìn)而對(duì)大鼠產(chǎn)生毒性影響。

目前針對(duì)環(huán)境污染物的研究主要集中在單一金屬的毒物-毒效動(dòng)力學(xué)過(guò)程的描述，在實(shí)際環(huán)境中金屬大多以混合物形式存在，而有關(guān)混合物存在下污染物的累積和毒性作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究較少，應(yīng)當(dāng)充分考慮Cd、As交互作用對(duì)其在線蚓體內(nèi)動(dòng)態(tài)吸收、釋放及毒性作用的影響。此外，現(xiàn)階段的研究手段主要采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究對(duì)象也主要針對(duì)單一的生物物種，不能全面反映Cd、As在實(shí)際土壤中的生態(tài)毒性效應(yīng)，因此有必要采用微宇宙生態(tài)系統(tǒng)方法原位研究金屬毒性影響，并從整個(gè)土壤生物群落出發(fā)研究污染物對(duì)群落結(jié)構(gòu)和多樣性等的影響，從而更全面地評(píng)估污染物的生態(tài)毒性作用。此外，當(dāng)前絕大多數(shù)的毒理學(xué)研究仍是基于生物體在個(gè)體水平上對(duì)污染物的毒性響應(yīng)，而對(duì)其分子水平的毒性研究仍較為欠缺，為了進(jìn)一步揭示Cd、As對(duì)生物的毒性效應(yīng)機(jī)制，可以利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合手段闡釋Cd、As對(duì)生物體分子水平的毒性作用。

4 結(jié)論

（1）整體上，Cd 和As 在線蚓體內(nèi)的含量受暴露濃度和暴露時(shí)間的影響，Cd的吸收速率大于As，而排出速率小于As，因此Cd更容易在線蚓體內(nèi)累積。

（2）當(dāng)基于外部暴露濃度表達(dá)毒性效應(yīng)時(shí)，Cd、As 的毒性效應(yīng)（LC50）隨暴露時(shí)間的增加而不斷增強(qiáng)并最終趨于穩(wěn)定，Cd對(duì)線蚓的毒性效應(yīng)大于As。

（3）當(dāng)基于體內(nèi)濃度表達(dá)毒性效應(yīng)（LC50inter）時(shí)，As 的LC50inter值基本不受暴露時(shí)間的影響，而Cd 的LC50inter值隨暴露時(shí)間的增加持續(xù)升高，Cd對(duì)線蚓的毒性效應(yīng)小于As；相較于Cd，As 的體內(nèi)濃度能更好地預(yù)測(cè)其對(duì)線蚓的動(dòng)態(tài)毒性效應(yīng)，說(shuō)明體內(nèi)累積的Cd不能代表其生物有效濃度以指示其毒性效應(yīng)。