極端嗜熱功能菌篩選及其促進堆肥腐熟效果研究

王 玉，張 晶，曹 云，吳華山，黃紅英*，劉愛民

（1.安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖241000；2.江蘇省農業(yè)科學院循環(huán)農業(yè)研究中心，南京210014；3.農業(yè)農村部種養(yǎng)結合重點實驗室，南京210014；4.江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210014）

目前，畜禽糞便的利用仍然是個難題，堆肥是實現畜禽糞便資源化、無害化、減量化利用的重要途徑。然而傳統(tǒng)堆肥也面臨著許多問題，諸如發(fā)酵溫度低、發(fā)酵周期長、無害化不徹底、臭味污染嚴重等。近年來，有研究表明[1-2]，在堆肥過程中接種菌劑，能有效提高堆肥腐熟度，縮短堆肥周期。然而也有研究表明[3-4]，外源接種菌劑并不能在堆肥過程中很好地發(fā)揮作用。究其原因，主要是接種的微生物與土著微生物相比，對堆肥環(huán)境的適應性差，導致對堆肥有機物分解利用不充分，從而達不到預期效果。因此，如何獲得對堆肥環(huán)境適應性好，并能穩(wěn)定發(fā)揮作用的微生物菌劑是研究重點。

根據環(huán)境中微生物最適生長溫度的不同，可以將其分為嗜冷微生物（＜20 ℃）、嗜溫微生物（25～40 ℃）、嗜熱微生物（40～60 ℃）、極端嗜熱微生物（60～85 ℃）和超嗜熱微生物（＞85 ℃）[5]。Oshima 等[6]首次發(fā)現極端嗜熱微生物在高溫堆肥過程中具有非常重要的作用。廖漢鵬等[7]發(fā)現土芽孢桿菌屬（Geobacillus）、棲熱菌屬（Thermus）和Calditerricola等屬的極端嗜熱菌對提高堆肥堆體溫度、促進堆肥腐熟的作用顯著。目前，國內外關于堆肥用極端嗜熱菌劑的報道不多，尤其是針對堆肥環(huán)境制備具有良好適應性和功能性的極端嗜熱菌劑產品更是少有研究。為此，本研究從不同高溫堆肥樣品中篩選既能在高溫、高pH、高鹽濃度的畜禽糞便堆肥環(huán)境中存活，且同時具備大分子有機物降解能力的極端嗜熱功能菌，按一定要求復配成極端嗜熱菌劑，在豬糞堆肥中添加該復配菌劑，并考察不同堆肥時期的種子發(fā)芽指數、腐殖質組分及含量的變化來確定復配菌劑促進堆肥腐熟、提高堆肥品質的效果，以期獲得具有商業(yè)價值的極端嗜熱菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料

分菌樣品取自江蘇、湖南等地不同有機肥廠的高溫期畜禽糞便及秸稈堆肥。

新鮮豬糞取自江蘇鎮(zhèn)江樂甜仕豬場，水稻秸稈取自江蘇省農科院水稻試驗基地。

培養(yǎng)基：（1）LB 培養(yǎng)基為胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2～7.4。固體培養(yǎng)基每1 L 加瓊脂10 g 和結冷膠10 g。（2）富集培養(yǎng)基為NH4NO31.0 g·L-1，K2HPO41.5 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.2 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，胰蛋白胨0.2 g·L-1，酵母浸粉0.2 g·L-1，pH 7.0。

1.2 極端嗜熱菌的分離及鑒定

菌株分離：取不同堆肥高溫期的樣品10 g，放入90 mL 富集培養(yǎng)基中，60 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后，以5%接種量轉接至新鮮的富集培養(yǎng)基中，65 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，按相同方法再次轉接，70 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。吸取第3次富集液梯度稀釋后涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，將平板置于70 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，挑取形態(tài)不同的單菌落，進一步劃線純化。最終分離出的單菌置于終濃度為10%的甘油中，-80 ℃保存。

菌株鑒定：各菌株提取總DNA 進行PCR 擴增，擴增引物為細菌16S rDNA序列通用引物27F/1492R，擴增體系及程序參考文獻[8]，擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果在GenBank 中進行blast比對，運用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株的生長特性研究

溫度對菌株生長的影響：以2%的接種量，將新鮮菌體接種到LB 液體培養(yǎng)基中，置于不同的生長溫度下（35、45、55、65、70、75、80 ℃）振蕩培養(yǎng)，24 h后取樣測定其在OD600處的吸光值。

pH 對菌株生長的影響：以2%的接種量，將新鮮菌體接種到LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH 分別為3.5、5.5、6.5、7.5、9.5和11.5，65 ℃振蕩培養(yǎng)，24 h后取樣測定其在OD600處的吸光值。

鹽濃度對菌株生長的影響：以2%的接種量，將新鮮菌體接種到NaCl含量分別為1、5、10、20、50 g·L-1和100 g·L-1的LB液體培養(yǎng)基中（pH 7.2～7.4），65 ℃振蕩培養(yǎng)，24 h后取樣測定其在OD600處的吸光值。

1.4 不同溫度條件下的酶活測定

蛋白酶活力的測定：采用福林（Folin）法測定蛋白酶活力[9]，粗酶液與2%酪蛋白溶液分別在不同溫度下（70、80、85、90、95 ℃）反應20 min，加入三氯乙酸終止反應，上清液加入碳酸鈉和福林試劑進行顯色反應，測定OD680處的吸光值，根據酪氨酸標準曲線計算生成的酪氨酸量。酶活單位定義：一定條件下每分鐘水解酪蛋白溶液生成1 μg 酪氨酸所需要的酶量為1個酶活力單位。

淀粉酶活力的測定：采用DNS 法測定淀粉酶活力[10]，粗酶液與1%的淀粉溶液分別在不同溫度下（70、80、85、90、95 ℃）反應10 min，加入DNS 試劑進行顯色反應，測定OD540處的吸光值，根據麥芽糖標準曲線計算生成的麥芽糖量。酶活單位定義：一定條件下每分鐘水解淀粉釋放1μmol 還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位。

木聚糖酶活力的測定：采用DNS 法測定木聚糖酶活力[11]，粗酶液與1%木聚糖溶液分別在不同溫度下（70、80、85、90、95 ℃）反應10 min，加入DNS 試劑進行顯色反應，測定OD540處的吸光值，根據木糖標準曲線計算生成的木糖量。酶活單位定義：一定條件下每分鐘水解木聚糖產生1μmol 還原糖（以木糖計）所需的酶量為1個酶活性單位。

脂肪酶活力的測定：采用滴定法測定脂肪酶活力[12]，粗酶液與橄欖油乳化液分別在不同溫度下（70、80、85、90、95 ℃）反應20 min，用NaOH滴定計算生成的脂肪酸量。酶活單位定義：一定條件下每分鐘水解底物釋放1μmol脂肪酸所需要的酶量為1個酶活力單位。

1.5 極端嗜熱菌劑制備

根據菌株生長特性和酶活測定結果，挑選出6 株菌（NN-86、NY-44、LB-3、B、D、E）用于構建具有較好環(huán)境耐受性和有機物降解能力的復合菌劑。進一步通過拮抗試驗確認各復配菌株間不存在拮抗現象。將各菌株分別培養(yǎng)制備成菌懸液后，取各菌株種子液等比例混合后接種于新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，至培養(yǎng)液中有效活菌數≥1×108cfu·mL-1時即獲得極端嗜熱復合菌劑。

1.6 極端嗜熱菌劑促進堆肥腐熟效果研究

堆肥所用原料的基本性質見表1。

表1 堆肥原料的理化性質Table 1 Physiochemical properties of raw materials for composting

采用實驗室模擬堆肥方法，將豬糞（主料）和秸稈（輔料）按比例混合，調節(jié)初始C/N 為25，初始含水率為65%。試驗設常規(guī)堆肥（未接種）和接種極端嗜熱菌劑堆肥（接種，2%接種量），為排除培養(yǎng)基對堆肥結果的影響，常規(guī)堆肥組加入2%的液體培養(yǎng)基，每個處理組重復3 次。將盛有混合物料的小型堆肥裝置（2 L 圓形帶蓋塑料桶）放入烘箱中，模擬自然高溫堆肥溫度變化控制堆體溫度，堆肥過程中的溫度控制條件見圖1。每隔2 d 翻堆一次，分別在第0、6、12、18、24、30 d 和42 d 取樣，測定堆肥各時期的GI 及腐殖質、胡敏酸和富里酸含量。GI 測定參照Ke 等[13]的方法進行，具體計算公式見式（1）。

堆肥腐殖質及其組分的測定采用焦磷酸鈉提取-重鉻酸鉀氧化容量法。

圖1 模擬堆肥溫度控制Figure 1 Temperature control in the mimic experiment

2 結果與討論

2.1 極端嗜熱菌株的分離鑒定

堆肥高溫期樣品經過富集培養(yǎng)和分離純化，共得到9株能在70 ℃生長的極端嗜熱菌株，各菌株的菌落形態(tài)見圖2，詳細形態(tài)描述見表2。16S rDNA 序列比對結果表明（表2）：菌株NN-36、NN-86、LB-3、B與土芽孢桿菌屬相似度最高；菌株NY-44 與副土芽孢桿菌屬相似度最高；菌株80-31、80-39、E與棲熱菌屬相似度最高；菌株D 與紅嗜熱菌屬相似度最高。同時，從構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知（圖3）：菌株NN-36、NN-86、LB-3、B與土芽孢桿菌屬聚為一類，因此初步鑒定其為Geobacillussp.；菌株NY-44 與副土芽孢桿菌屬聚為一類，因此初步鑒定其為Parageobacillussp.；菌株80-31、80-39、E與棲熱菌屬聚為一類，因此初步鑒定其為Thermussp.；菌株D 與紅嗜熱菌屬聚為一類，因此初步鑒定其為Rhodothermussp.。Geobacillussp.和Thermussp.是堆肥高溫期常見優(yōu)勢菌株[14-15]，Para?geobacillussp.和Rhodothermussp.在堆肥中少有報道。本研究從高溫堆肥環(huán)境分離獲得的極端嗜熱菌中，土芽孢桿菌和棲熱菌占比高達80%左右，與前人研究結果一致。

表2 菌株16S rDNA序列相似性分析及菌落形態(tài)描述Table 2 Similarity analysis of the 16S rDNA sequences of the isolated strains and descriptions of colony morphology

圖2 9株菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 2 Colony morphology of nine strains on the LB medium

2.2 菌株生長特性及酶活測定結果

2.2.1 菌株的生長特性

溫度是影響菌株生長、繁殖、新陳代謝的重要指標之一。由圖4a 可以看出，菌株80-31、80-39、D、E的最適生長溫度為70 ℃，菌株NN-36、NN-86、NY-44、LB-3 和B 的最適生長溫度為65 ℃。近年來已有研究表明提高堆體溫度可加速腐殖化進程，縮短發(fā)酵周期[16-17]。在傳統(tǒng)過程堆肥中溫度超過70 ℃將抑制幾乎所有微生物（包括嗜熱微生物）的活性，導致后續(xù)堆肥過程難以穩(wěn)定運行，因此分離篩選最適生長溫度為65 ℃和70 ℃的高溫菌株資源并應用到堆肥中具有重要意義。

由圖4b 可知，各個菌株對鹽濃度的耐受能力不同。多數菌株的最適生長鹽濃度為10 g·L-1，而菌株NY-44 的最適生長鹽濃度是20 g·L-1，比其他菌株能耐受更高鹽濃度，屬于嗜鹽菌[18]。

由圖4c 可知，所分離菌株都能在pH 7.5 以上生長，都屬于耐堿菌。其中菌株NY-44、D 和E 的最適生長pH 為9.5，屬于嗜堿菌[19]。曹云等[20]在研究畜禽糞便堆肥前期理化性質發(fā)現，堆肥前期由于微生物分解蛋白質類有機物產生氨氮，促使pH 值上升，pH 可達到8～9。

圖3 9株菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of nine strains based on 16S r DNA sequences

綜上，所分離菌株具有耐高溫、耐堿和耐鹽等特性，而堆肥過程是有著高溫、高pH 和高鹽環(huán)境的，菌株的這些特性有助于它們在堆肥過程中更好地適應堆肥環(huán)境從而存活，而這也是菌劑在堆肥中發(fā)揮功能的先決條件。

2.2.2 菌株不同溫度條件下的酶活性質

圖4 溫度、NaCl濃度、pH值對各菌株生長的影響Figure 4 Effects of temperature，NaCl concentration，and pH value on the growth of each strain

圖5 各菌株在不同溫度下的蛋白酶活、淀粉酶活、木聚糖酶活和脂肪酶活Figure 5 Protease activity，amylase activity，xylanase activity，and lipase activity of each strain at different temperatures

如圖5a 所示，所分離菌株都能檢測出高溫蛋白酶活性，菌株NN-36 和NY-44 所產蛋白酶在80 ℃酶活最大，分別為25.6 U·mL-1和21.8 U·mL-1；菌株NN-86、LB-3和D所產蛋白酶均在90 ℃酶活最大，分別為22.9、23.3 U·mL-1和29.1 U·mL-1。所有菌株均能檢測出高溫淀粉酶和木聚糖酶活性，但活性都較弱，其中菌株B所產淀粉酶在70 ℃酶活最大，為0.20 U·mL-1；菌株E 所產木聚糖酶在70 ℃酶活最大，為0.25 U·mL-1（圖5b、圖5c）。如圖5d所示，只有菌株NY-44、NN-36和B 檢測到了脂肪酶活，且活性均不高，其中菌株NY-44所產脂肪酶在70 ℃酶活最大，為1.80 U·mL-1。

有研究表明，土芽孢桿菌可產生多種高溫酶，比如高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶等[21]。本研究結果也證明土芽孢桿菌同時具有高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性，且部分土芽孢桿菌還同時具備脂肪酶活性，說明土芽孢桿菌有較強的飼料酶系[22-23]，有利于堆肥過程中大分子有機物的降解，從而促進堆肥升溫和腐熟。高溫菌所產的降解酶具有較好的熱穩(wěn)定性，能將發(fā)酵溫度維持在較高的溫度下，可以更加有效地殺死病原微生物，達到衛(wèi)生化的要求。此外，高溫酶不僅耐熱，而且對不良化學環(huán)境也具有高度的耐受性，從而能提高有機廢棄物處理效率，縮短堆肥生產周期。

2.3 接種極端嗜熱菌劑對豬糞堆肥腐熟進程的影響

2.3.1 極端嗜熱菌劑的復配

經過比較各菌株生長特性和不同溫度下的酶活結果：NY-44 既是嗜堿菌又是嗜鹽菌；D 和E 是嗜堿菌；NN-86、LB-3 在90 ℃時有最大蛋白酶活；菌株B能產脂肪酶和淀粉酶。最終選擇NN-86、NY-44、LB-3、B、D 和E 這6 株菌用于復配耐堿、耐鹽和具備良好蛋白質、淀粉、脂肪和半纖維素高溫降解能力的極端嗜熱菌劑。

2.3.2 極端嗜熱菌劑對堆肥GI的影響

GI 是判斷堆肥腐熟程度極為重要的指標之一。不同堆肥處理的GI變化如圖6所示。在堆肥過程中，接種和未接種處理的GI都呈先下降再上升的趨勢，且兩組處理均在12 d 時GI 降到最低。堆肥初期發(fā)芽指數降低可能是因為有機物降解產生大量酚類化合物、揮發(fā)性有機酸和氨等植物毒素[24-25]。12 d后接種和未接種處理的GI 均呈逐漸上升趨勢，且接種處理的GI增加更為迅速，在30 d即達到了56.8%，已達到基本腐熟標準[26]，而此時未接種堆肥的GI 僅為41.8%。堆肥結束時，接種處理的GI 為72.1%，比未接種處理高14.8%，堆肥結束時，未接種處理與接種處理的GI均超過50%，表明此時堆體已無明顯植物毒性[27]。以上結果說明接種極端嗜熱菌劑有利于加快豬糞堆肥的腐熟進程，從而縮短堆肥周期。

圖6 堆肥過程中種子發(fā)芽指數（GI）變化Figure 6 Changes of GI during composting

2.3.3 極端嗜熱菌劑對堆肥腐熟進程的影響

在堆肥過程中，有機質在微生物的作用下，進行降解的同時還進行著腐殖化的過程。從圖7a 可以看出，接種和未接種堆肥總腐殖質含量均呈現先下降后上升再下降的變化趨勢。堆肥12 d 后接種處理的腐殖質含量一直高于未接種組，直至堆肥結束，接種處理腐殖質含量較未接種高出4.2%。堆肥結束時，接種處理和未接種處理腐殖質含量較初始值分別降低了12.8%和16.3%?，F有研究關于堆肥過程腐殖質總量變化趨勢沒有統(tǒng)一結論，與堆肥原料以及堆肥工藝的選擇有關。鮑艷宇等[28]研究以奶牛糞為原料的堆肥，發(fā)現腐殖質碳呈逐漸增加的趨勢。本研究結果與曹云等[29]的研究結果相一致，以豬糞為原料堆肥時，堆肥腐熟后腐殖質總含量與初始相比均降低。

胡敏酸是一種分子量大、穩(wěn)定性高的物質。圖7b 顯示，在整個堆肥過程中胡敏酸含量總體呈現先略降低后逐漸上升的趨勢。堆肥12 d 后接種處理的胡敏酸含量一直高于未接種組，直至堆肥結束，接種處理胡敏酸含量較未接種高出7.8%。42 d 時，接種處理和未接種處理胡敏酸含量分別為52.87 g·kg-1和49.03 g·kg-1，較初始值分別提高了58.0%和46.5%。富里酸是腐植酸中分子量較小、活性較大、氧化程度較高的組分[30]。由圖7c可知，堆肥過程中富里酸含量呈下降趨勢，這主要是由于富里酸類物質分子量相對較小、分子結構簡單，易被微生物降解。堆肥結束時，未接種處理和接種處理富里酸含量分別是34.97 g·kg-1和34.63 g·kg-1，差異不顯著。

圖7 堆肥過程中總腐殖質、胡敏酸、富里酸、HA/FA變化Figure 7 Dynamics of humic substance，humic acid，fulvic acid，and HA/FA during composting

胡敏酸和富里酸含量的比值（HA/FA）是評價堆肥腐殖化程度的一個重要指標，能較好地反映出堆肥過程中腐殖質的聚合程度[31-32]。如圖7 d 所示，在整個堆肥過程中，各處理的HA/FA 總體呈現增加的趨勢。18 d 后，接種處理HA/FA 一直高于不接種處理組，42 d 時，接種處理的HA/FA 較未接種處理高出7.1%。有研究表明[33-34]，堆肥過程中HA/FA 值在1.4以上，就可以判斷堆肥腐熟。在42 d 時，兩組處理都超過1.4，說明堆肥結束時，兩組堆肥都已腐熟。但接種處理的HA/FA 在第36 d 時已達到1.4，達到腐熟時間縮短了6 d。

結果表明，接種極端嗜熱菌劑對豬糞堆肥腐殖質組成及含量的變化有著顯著影響。接種菌劑促進了腐殖化進程，有利于胡敏酸的形成，提高了HA/FA，表明接種極端嗜熱菌劑可以提高豬糞堆肥的腐殖化程度，提高堆肥產品質量。

3 結論

（1）本研究從高溫堆肥環(huán)境中篩選出9株極端嗜熱菌，經16S rDNA序列同源性比對，鑒定為：Geobacil?lussp.4 株，Thermussp.3 株，Parageobacillussp.1 株，Rhodothermussp. 1 株。Geobacillussp.和Thermussp.是堆肥高溫期常見優(yōu)勢菌株，Parageobacillussp.和Rhodothermussp.在堆肥中的應用少有報道，本研究為堆肥高溫菌劑制備擴充了菌種資源。

（2）所分離菌株最適生長溫度均在65～70 ℃；NY-44、D 和E 最適生長pH 為9.5，屬于嗜堿菌，其中NY-44最適生長鹽濃度是20 g·L-1，同時屬于嗜鹽菌；所分離土芽孢桿菌同時具有高溫蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶活性，且部分土芽孢桿菌還兼具高溫脂肪酶活性，有利于堆肥過程中大分子有機物的降解。

(3)堆肥結束時，接種極端嗜熱菌劑的處理與未接種相比，GI 提高了14.8%，總腐殖質含量和胡敏酸含量分別增加了4.2%和7.8%，HA/FA 高出了7.1%?？梢?，接種本研究的極端嗜熱菌劑有利于加快堆肥腐熟，增強堆肥的腐殖化程度和堆肥產品質量。對復配菌株比例的優(yōu)化可能會進一步提升該極端嗜熱菌劑促進堆肥腐熟效果，有待后續(xù)研究確認。