夏枯草PvGGPPS基因的克隆和誘導表達分析

張夢佳 董誠明 朱畇昊

摘 要： 為探究夏枯草中GGPPS基因的生物學特性及功能，該文在夏枯草轉錄組測序的基礎上設計特異性引物，采用逆轉錄 PCR 技術獲得夏枯草中GGPPS基因的全長核苷酸序列，并進行生物信息學分析;采用 qPCR 法分析PvGGPPS基因在不同外源性物質誘導下在夏枯草果穗中的表達量以及該基因在夏枯草不同組織中的表達量。結果表明：PvGGPPS基因開放閱讀框1 092 bp，編碼363個氨基酸，理論分子量為38 815.68 D，等電點為5.69。PvGGPPS蛋白具有異戊烯基焦磷酸合酶家族的特征結構域。系統(tǒng)進化樹表明PvGGPPS蛋白與丹參、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有較高的親緣關系。qPCR分析表明，PvGGPPS基因在葉中表達量高于果穗及莖。對果穗施加7種外源性物質處理24 h后，GA3 處理組該基因表達量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同組織中表達量差異較大，且受外源物質誘導表達。該研究結果為進一步研究PvGGPPS基因對夏枯草萜類成分合成途徑中的功能及表達調控奠定基礎。

關鍵詞： 夏枯草， PvGGPPS， 基因克隆， 誘導表達， 表達分析

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）06-0882-09

開放科學（資源服務）標識碼（OSID） ：

Abstract： In order to explore the biological characteristics and functions of GGPPS gene in Prunella vulgaris， the specific primers were designed based on the sequencing of P. vulgaris transcriptome. The full-length nucleotide sequence of GGPPS gene was obtained in P. vulgaris by reverse transcription PCR technology， and the bioinformatics analysis was done. qPCR was used to analyze the expression of PvGGPPS gene in ear induced by different exogenous substances and in different organs in P. vulgaris. The results showed that the PvGGPPS gene had an open reading frame of 1 092 bp and encoded 363 amino acids， with a theoretical molecular weight of 38 815.68 D and an isoelectric point of 5.69. PvGGPPS protein had the characteristic domain of isopentenyl pyrophosphate synthase family. Phylogenetic tree showed that PvGGPPS protein was closely related to Salvia miltiorrhiza and Coleus forskohlii GGPPS protein. qPCR analysis showed that the expression of PvGGPPS gene in leaves was higher than that in ears and stems. The expression level of PvGGPPS gene was increased in the ear after GA3 treatment for 24 h， one of seven exogenous substances treated. The expression of PvGGPPS gene in different tissues of Prunella vulgaris was quite different and was induced by exogenous substances treatment. The results of this study lay a foundation for further study on the function and expression regulation of PvGGPPS gene in the synthesis pathway of terpenoids from P. vulgaris.

Key words： Prunella vulgaris， PvGGPPS， gene cloning， induced expression， expression analysis

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科植物夏枯草的干燥成熟果穗，始載于《神農本草經》，具有清肝明目、消腫散結的功效（《中華人民共和國藥典》，2015），廣泛分布于全國各地。夏枯草中含有三萜類、黃酮類、有機酸類、香豆素類、甾體類等多種化學成分（汪曉河等，2019）。夏枯草中次生代謝成分齊墩果酸和熊果酸具有明顯的消炎、抗腫瘤和抗HIV等藥理作用（張金華等，2018），應用前景巨大。夏枯草作為藥食兩用之品，具有重要的藥用價值和經濟價值，尤其是作為涼茶原材料的需求量巨大，使得夏枯草市場需求量呈增加態(tài)勢，夏枯草資源逐漸變得緊張?？焖侔l(fā)展的高通量測序技術和生物信息學分析方法為基因的鑒定和功能分析提供了更多的途徑，吸引著越來越多的研究者把目光投入到分子領域。然而，目前已有的夏枯草分子水平相關研究還不夠全面和準確，夏枯草分子相關數據庫也不夠完善。

香葉基香葉基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS），是植物萜類物質合成的關鍵酶之一（唐美瓊等，2017;方潔，2017）。目前已經在擬南芥、丹參、地黃等多種植物中克隆到GGPPS基因（化文平，2008;Li et al.，2015;趙樂等，2017;張藝丹，2018）。GGPPS在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，GGPPS通過催化三分子IPP和一分子DMAPP反應生成GGPP。GGPP不僅是二萜類物質的前體物，還是類胡蘿卜素、葉綠素、生育酚、脫落酸、赤霉素等物質的共同前體物，是植物多條重要次生代謝通路的節(jié)點（韓立敏，2015;梁敏華等，2018）。本研究在前期獲得的夏枯草轉錄組數據庫的基礎上，克隆得到夏枯草GGPPS基因，通過誘導表達的分析探討GGPPS基因對夏枯草中萜類成分合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

夏枯草樣品采自河南省確山縣夏枯草GAP種植基地，由河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為夏枯草（Prunella vulgaris）。

總RNA提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），反轉錄試劑盒（Thermo公司），熒光定量試劑盒（QIAGEN），DNA Marker（TaKaRa公司），PCR產物回收試劑盒（上海生工），PCR儀（美國 Bio-Rad 公司C1000 Touch ThermalCycler），熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司 Step One Plus）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取與cDNA第一條鏈的合成 利用康為試劑植物總RNA 提取試劑盒提取夏枯草不同組織的總RNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。cDNA 的合成步驟按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行操作，反轉錄得到的cDNA置于-20 ℃ 備用。

1.2.2 cDNA全長克隆 根據夏枯草轉錄組數據庫基因注釋信息，選取表達豐度（FPKM）較高、E-value值較低且序列長度完整的GGPPS基因的核苷酸序列，利用Primer Premer 5.0軟件設計GGPPS基因的特異性引物。

以夏枯草葉片cDNA 為模板進行擴增：cDNA 2.0 μL，2 × Es Taq mix 10 μL，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，dd H2O 6 μL至體積為20.0 μL。反應程序： 95 ℃預變性1 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min（朱畇昊等，2016）。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將擴增的目的條帶切膠回收純化，并連接到pMD19-T載體上，藍白斑篩選，菌落經PCR檢測后的陽性克隆送往上海生工生物技術有限公司進行雙向測序。夏枯草中GGPPS基因的特異性引物見表1。

1.2.3 生物信息學分析 運用多種在線工具對夏枯草中GGPPS基因及編碼蛋白進行生物信息學分析。利用ORF finder在線軟件分析開放閱讀框;運用DNAMAN軟件翻譯目的基因氨基酸序列，比對同源蛋白的序列;利用ExPASy Proteomics Server Protparam在線軟件分析目的蛋白的理化性質;在線軟件SinalP4.1 Server用于預測信號肽;運用軟件SMART分析目的蛋白功能域。在線軟件NPSA server和Swiss-Model分別用于預測蛋白質的二級和三級結構;運用在線工具BaCeIlo和ChloroP預測細胞定位和葉綠體轉運肽切割位點。運用MEGA 7軟件對目的基因及同源基因的氨基酸序列構建進化樹分析。

1.2.4 夏枯草GGPPS基因的表達特性分析 采集新鮮的夏枯草葉片、果穗和莖，用自來水清洗干凈，濾紙吸干水分，置液氮中冷凍后，放-80 ℃超低溫冰箱備用。在夏枯草生長旺盛的時期（6月份），對生長狀態(tài)一致的夏枯草果穗進行處理，分別噴灑50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、17.14 μmol·L-1吲哚乙酸（IAA）、100 μmol·L-1乙烯利（ETH）、100 μmol·L-1硝普鈉（SNP）、1 mmol·L-1無水氯化鈣、10 μmol·L-1水楊酸（SA）、2.88 μmol·L-1赤霉素（GA3）。以噴灑前（0 h）的果穗為對照，24 h后采集處理組樣品。

對夏枯草果穗、莖、葉及噴施7種外源物質的果穗中GGPPS基因相對表達量進行實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR） 檢測，qPCR檢測的反應體系：2× SYBR Green PCR Master Mix10 μL，QN Rox Reference Dye 0.1 μL，正反向引物均為0.4 μL，模板cDNA 2 μL，RNase-Free Water 7.1 μL至終體積為20 μL。反應程序：95 ℃預變性20 s后，進行40個循環(huán)（95 ℃，1 s;56 ℃，20 s;95 ℃，1 s），60 ℃，20 s;95 ℃，1 s。夏枯草actin基因作為內參，擴增完成后進行溶解曲線測定，2-ΔΔCt法分析GGPPS相對表達量。

2 結果與分析

2.1 夏枯草GGPPS基因的cDNA全長克隆

瓊脂糖凝膠電泳檢測夏枯草GGPPS基因約為1 100 bp，經克隆測序后序列使用ORF Finder預測開放閱讀框，克隆所得序列含有1個1 092 bp的完整開放閱讀框，命名為PvGGPPS，NCBI基因登陸號為MK993565。夏枯草GGPPS基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。

2.2 夏枯草GGPPS蛋白的生物信息學分析

2.2.1 夏枯草GGPPS蛋白的理化性質預測 PvGGPPS蛋白預測編碼363個氨基酸，理論分子量為38 815.68 D，等電點為5.69，帶負電的氨基酸殘基（Asp + Glu）有 44個，帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys）有37個，推測其為酸性蛋白;根據其不穩(wěn)定系數為39.06，推測其為穩(wěn)定蛋白（表2）。

2.2.2 夏枯草GGPPS蛋白的亞細胞定位和功能域分析 通過亞細胞定位預測分析（表3），發(fā)現PvGGPPS蛋白定位在葉綠體中。利用SMART在線軟件對PvGGPPS蛋白進行功能域預測，圖2結果顯示：PvGGPPS蛋白具有異戊烯基焦磷酸合酶家族的特征結構域polyprenyl_synt，位于第101位到第357位。

2.2.3 夏枯草GGPPS蛋白的疏水性、跨膜區(qū)預測 對PvGGPPS蛋白進行疏水性預測，由圖3的預測結果可以看出該蛋白疏水氨基的數量大于親水氨基酸的數量，可推測其為疏水性蛋白。PvGGPPS蛋白跨膜區(qū)預測結果表明該蛋白有2個跨膜螺旋區(qū)，位置分別為從176位到195位;從250位到266位（圖4）。

2.2.4 夏枯草GGPPS蛋白的二級和三級結構預測 利用在線軟件對PvGGPPS蛋白進行二級結構預測。結果表明該蛋白是由54.27%的α-螺旋、14.05%的延伸鏈、5.51%的β-轉角和26.17%的不規(guī)則卷曲組成混合型蛋白。利用Swiss-Model在線軟件預測蛋白三級結構，得到的預測結果見圖5。結果顯示PvGGPPS蛋白與擬南芥中AtGGPPS11蛋白（5e8l.1）的相似度為75.25%。

2.2.5 夏枯草GGPPS蛋白系統(tǒng)進化樹的構建和多序列比對 通過BLAST序列比對，從NCBI數據庫中下載丹參（Salvia miltiorrhiza）、毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus）、芝麻（Sesamum indicum）、米團花（Leucosceptrum canum）、野甘草（Scoparia dulcis）、銹毛旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）、紫花風鈴（Handroanthus impetiginosus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、皺葉菸草（Nicotiana tomentosiformis）、煙草（Nicotiana attenuata）、大腸桿菌（Escherichia coli）、曼地亞紅豆杉（Taxusx media）、銀杏（Ginkgo biloba）、玉米（Zea mays）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、馬尾松（Pinus massoniana）、水稻（Oryza sativa）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、湖生紅球藻（Haematococcus lacustris）、鈍頂螺旋藻（Arthrospira platensis）的GGPPS蛋白的氨基酸序列與PvGGPPS蛋白的氨基酸序列通過MEGA 7軟件采用鄰近法（N-J法，bootstarp值設為1 000，其余為默認條件）構建系統(tǒng)進化樹，并選取部分植物的氨基酸序列利用DNNMAN軟件進行多序列比對分析。

通過構建系統(tǒng)進化樹（圖6），可以看出PvGGPPS蛋白與丹參、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有較高的親緣關系，進化關系具有較高的保守性;與雙子葉植物進化關系較近， 與菌類、蘚類、藻類、裸子植物、單子葉植物的進化關系較遠。多序列比對顯示PvGGPPS與6個物種間蛋白質氨基酸序列一致性達87.03%，序列中存在異戊烯基焦磷酸合酶家族的兩個富含天冬氨酸的特征性序列：DDxxxxD和DDxxD（王中等，2018），分別為位于第157到第164位的“DDLPCMD”和第296到第300位的“DDILD”，起到底物結合與碳鏈延伸的功能;且含有1個CxxxC基序（D為天冬氨酸殘基，C為半胱氨酸，x 為任意氨基酸殘基）（圖7）。

2.3 夏枯草GGPPS基因表達分析

利用qPCR方法檢測PvGGPPS基因在夏枯草果穗、葉和莖中的表達量，以果穗為參照。結果顯示PvGGPPS基因在3個樣本中均有不同程度的表達量;在葉中高表達，其次是莖，在果穗中的表達量最少。PvGGPPS基因在葉中的相對表達量是在果穗中的95.39倍。PvGGPPS基因表達趨勢與轉錄組測序結果一致（圖8）。

通過外源施加7種外源物質來評價這些信號物質對夏枯草PvGGPPS基因表達的影響。在7種外源物質處理24 h后，可以看到GA3處理下PvGGPPS基因的表達量顯著上調;SNP、MeJA、IAA、乙烯利和CaCl2處理在24 h時對該基因表達量均表現為明顯下調。

3 討論與結論

在多種植物GGPPS基因的研究中發(fā)現該基因的表達模式在不同植物間有明顯的組織差異性（孫君等，2016;薛生玲等，2018;Wang et al.，2019）。本研究結果顯示PvGGPPS基因在夏枯草的果穗、莖、葉3個樣本中均有不同程度的表達量，在葉中高表達，其次是莖，在果穗中的表達量最少。通過亞細胞定位預測分析，發(fā)現PvGGPPS蛋白預測定位在葉綠體中。我們推測PvGGPPS可能主要與夏枯草葉片中葉綠素、赤霉素等的合成有關。在趙樂等（2016）的研究中發(fā)現地黃中的RgGGPPS1基因定位在葉綠體中，在根中的表達量最高，可能參與地黃中葉綠素等次生代謝產物的合成。這與本文研究結果相一致。

GGPPS基因易受植物激素誘導表達為其明顯的表達共性。丹參中的GGPPS基因可能受到水楊酸的誘導表達，卻被茉莉酸甲酯抑制表達（Kai et al.，2010）。在錢丹等（2013）的研究中發(fā)現不同誘導子處理后海南粗榧葉片中GGPPS基因的表達量明顯上調，其中以MeJA誘導的效果最好。在本次實驗中發(fā)現GA3處理下PvGGPPS基因的表達量顯著上調。多項研究表明外源激素對植物的生長及某些基因的表達有一定影響（常青山等，2017;潘君飛等，2018;李璐等，2019），其中赤霉素（ GA3 ） 是一種調節(jié)植物生長和發(fā)育的雙萜植物激素（王燦，2018）。鄭偉等（2019）的研究發(fā)現在太子參中三個GH3基因的表達均受外源GA3誘導，且GA3能夠誘導太子參發(fā)育過程中內源 IAA 的積累。張晨等（2018）研究發(fā)現在太子參塊根生長發(fā)育過程中GA3 可通過影響 JA 從而促進皂苷的積累。因此，我們推測GA3能誘導夏枯草萜類生物合成途徑中部分關鍵酶基因的表達。本研究豐富了GGPPS基因的種類，為后期的基因功能研究奠定了基礎。

本研究結果表明，夏枯草中的PvGGPPS基因主要在葉中高表達且受外源GA3的調控， 并首次對夏枯草中的GGPPS基因進行研究，豐富了GGPPS基因家族的種類。但是對于PvGGPPS基前面序列號為NCBI登錄號。

因參與具體哪一類成分的調節(jié)及該基因對夏枯草中三萜類成分合成的影響目前尚不清楚，還有待進一步研究。

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（責任編輯 何永艷）