酶法自茶葉中提取茶多酚工藝和口味研究

李映　陳佳蕓　吳亞楠　聞雪暢　葛喜珍

[摘 要]目的：探討酶法對(duì)茶葉和茶葉渣中茶多酚提取效果及口味的影響。方法：設(shè)計(jì)單因素及正交試驗(yàn)，使用纖維素酶和果膠酶酶解茶葉和茶葉渣，紫外分光光度法和HPLC法檢測(cè)茶多酚含量，HPLC法檢測(cè)氨基酸含量，評(píng)價(jià)提取液口味。結(jié)果：酶法提取最佳條件為復(fù)合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，酶解pH 5.6，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間75 min。酶法自茶葉和茶葉渣提取茶多酚產(chǎn)率分別為23.36%、10.38%，與不加酶相比分別提高55.94%、15.46%;酶法自茶葉和茶葉渣提取氨基酸產(chǎn)率分別為4.98%、3.12%，與不加酶相比分別提高20.42%、25.32%;茶葉加酶處理得到氨基酸含量高、收斂強(qiáng)度和苦味弱，總體接受度與氨基酸含量一致。結(jié)論：酶法可高效提取茶葉有效成分，茶葉渣可作為原料提取茶多酚，用于食品工業(yè)。

[關(guān)鍵詞]茶葉;茶葉渣;茶多酚;口味

[中圖分類(lèi)號(hào)]TS 272[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]1005-0310（2020）03-0077-06

0 引言

作為世界三大飲品之一，茶葉具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。茶葉富含茶多酚、氨基酸、多糖、維生素等物質(zhì)。茶多酚有抗癌、抗衰老、降血糖、抗輻射等作用;氨基酸具有鮮味，如酸、甜等[1-2]。茶多酚和氨基酸普遍用于食品加工行業(yè)。茶葉中茶多酚的提取方法包括溶劑萃取法、超聲波提取法、微波提取法、離子沉淀法、樹(shù)脂吸附法和酶法等，其中酶法提取安全、溫和、環(huán)保、效率高、簡(jiǎn)潔[3]。本研究基于酶法從茶葉和茶葉渣中提取茶多酚和氨基酸，并檢測(cè)其味質(zhì)，探討酶法提取對(duì)茶多酚、氨基酸和提取物口味的影響，以及探究自茶葉或茶葉渣中提取茶多酚的高效、環(huán)保生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：綠茶購(gòu)自山東日照天潤(rùn)茶業(yè)有限公司，茶葉渣（用100 ℃水浸泡茶葉30 min，連續(xù)沖泡3遍，烘干茶葉，得茶葉渣）;纖維素酶（400 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）由上海瑞永生物科技有限公司提供;乙醇、茚三酮、氯化亞錫、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉（北京化工廠，分析純）;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純）;標(biāo)準(zhǔn)品：表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）標(biāo)準(zhǔn)品、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素（EC）標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸（GA）標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（異亮氨酸）均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;咖啡堿（CAF）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 儀器設(shè)備

分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）;LC-16高效液相色譜儀（島津儀器（蘇州）有限公司）;Waters 2695 高效液相色譜儀（Empower 工作站）;PHS-3CpH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;JM-A6002電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）;HCP-500 A高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）;TG16臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）。

1.3 茶多酚提取工藝

取茶葉或茶葉渣，將復(fù)合酶溶液加入茶葉或茶葉渣、酶解;加乙醇溶液提取，提取物過(guò)濾，離心，得上清液;檢測(cè)上清液中茶多酚和氨基酸含量，計(jì)算茶多酚和氨基酸提取率，同時(shí)評(píng)估口味。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 酶用量（復(fù)合酶占茶葉質(zhì)量百分比）篩選

配制復(fù)合酶水溶液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果纖維素酶、果膠酶各2.0 mg/mL）。稱取茶葉1.0 g于三角瓶，加入復(fù)合酶溶液（1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0%），加水至60 mL，調(diào)pH=5.4，溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，探討不同酶用量對(duì)茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.2 料液比（茶葉質(zhì)量與提取劑體積比）篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，加1.2%的復(fù)合酶，加水至60 mL，調(diào)pH=5.4，溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇（料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL），50 ℃提取60 min，探討不同料液比對(duì)茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.3 酶解pH篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復(fù)合酶用量1.2%，加水至60 mL，調(diào)pH（3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8），溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，料液比為1∶10 g/mL，探討不同pH對(duì)茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.4 提取溫度篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復(fù)合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH為5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃提取60 min，料液比為1∶10 g/mL，探討不同提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對(duì)茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.5 提取時(shí)間篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復(fù)合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH為5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃，料液比為1∶10 g/mL，探討不同提取時(shí)間（15、30、45、60、75、90 min）對(duì)茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平的L9（3）4正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。分別以茶葉和茶葉渣為原料，以復(fù)合酶用量（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）為因素，以茶多酚提取率為指標(biāo)，利用Latin正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立酶法自茶葉、茶葉渣中提取茶多酚的最優(yōu)工藝參數(shù)，見(jiàn)表1。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

以不加酶為對(duì)照，分別用茶葉和茶葉渣為底物，利用正交試驗(yàn)所得最佳條件提取茶多酚和氨基酸，用酒石酸亞鐵比色法和高效液相色譜法測(cè)定茶多酚提取率，高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量。

1.6.1 茶葉中茶多酚含量測(cè)定

將提取液冷卻至室溫，過(guò)濾，取濾液，3 600 r/min離心10 min，取上清，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測(cè)定》中的酒石酸亞鐵比色法來(lái)測(cè)定提取液中茶多酚含量。精確吸取1 mL待測(cè)液于25 mL容量瓶，加入5 mL酒石酸亞鐵溶液和4 mL蒸餾水，混合搖勻，再滴加pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容，以空白溶液作參比，在540 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度A。

1.6.2 兒茶素和咖啡堿含量檢測(cè)

對(duì)照品制備：分別稱量表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）標(biāo)準(zhǔn)品、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子酸（GA）、咖啡堿（CAF）標(biāo)準(zhǔn)品，用三蒸水定容。ECG、EGCG和CAF的質(zhì)量濃度均為2 mg/mL，GA質(zhì)量濃度 0.1 mg/mL，備用。兒茶素和咖啡堿用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定：ZORBAX SB-C18 ODS色譜柱，5 μm，4.6 mm×150 mm，柱溫：35 ℃，流動(dòng)相為30%甲醇加0.5‰ H3PO4;進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相流速1 mL/min，紫外檢測(cè)器λ=284 nm。供試茶葉或茶葉渣提取液，冷卻至室溫，過(guò)濾，濾去反應(yīng)體系中的茶粉或茶渣，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.6.3 氨基酸含量檢測(cè)

氨基酸組分含量測(cè)定參考尹軍峰等方法[4]。采用Waters 高效液相色譜儀檢測(cè)，Empower 軟件工作站， Agilent G1 321 A熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）：250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）：395 nm，AccQ-Tag 氨基酸（15 mm×3.9 mm×4.6 mm），流速：1 mL/min，柱溫：27 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相A（乙腈∶水=60∶40），流動(dòng)相B（乙腈∶磷酸鹽緩沖液=10∶90，0.013 mol/L的磷酸鹽緩沖液pH 8.1），檢測(cè)波長(zhǎng)： 360 nm。梯度洗脫（0～2 min，A∶B=0∶100;2～15 min，A∶B=20∶80;15～30 min，A∶B=30∶70;30～40 min，A∶B=80∶20;40～45 min，A∶B=100∶0），用外標(biāo)法定量氨基酸組成的含量。

1.6.4 茶多酚提取率計(jì)算

茶多酚提取率用茶葉干物質(zhì)的質(zhì)量百分比表示，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測(cè)定》中的酒石酸亞鐵比色法，用以下公式計(jì)算：

茶多酚提取率=A×1.957 ×21 000×L1L2×M×m×100%。

其中，L1為試液的總量（mL）;L2為測(cè)定時(shí)的用液量（mL）;M為試樣的質(zhì)量（g）;m為試樣的干物質(zhì)含量（%）;A為吸光度。

1.7 口味評(píng)定

口味評(píng)估由7位訓(xùn)練有素的專(zhuān)家（男4名，女3名，35～56歲）組成，樣品在室溫（約25°C）下提供，每個(gè)小組成員對(duì)口味屬性（苦味、收斂性、鮮味和接受程度）進(jìn)行評(píng)分。采用十分制，其中8～10為“極強(qiáng)”，6～8為“強(qiáng)”，4～6為“中性”，2～4為“弱”，0～2為“極弱”。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定不同樣本得分差異，每個(gè)評(píng)估在不同的日期重復(fù)3次[5]。

2 試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖1可知，復(fù)合酶含量在0～1.2%范圍，底物和酶充分接觸，隨酶量增加茶多酚提取率提高;當(dāng)復(fù)合酶用量大于1.2%時(shí)，茶多酚提取率下降，推測(cè)復(fù)合酶飽和后，酶解反應(yīng)效率下降，故復(fù)合酶添加量以1.2%為宜。

2.1.2 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比在1∶6～1∶10 g/mL時(shí)，有助于茶多酚向溶劑轉(zhuǎn)移，當(dāng)料液比超過(guò) 1∶10 g/mL時(shí)，溶劑用量增加，浸出物被稀釋?zhuān)罄m(xù)濃縮、干燥成本增加，故最佳料液比為1∶10 g/mL。

2.1.3 酶解pH對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖3可知，隨酶解pH增加，茶多酚提取率先升后降，復(fù)合酶pH值為5.6時(shí)酶解作用最強(qiáng)，當(dāng)pH偏離最佳值時(shí)，酶活中心的部分基團(tuán)離子發(fā)生變化，酶活性減弱;當(dāng)pH大大偏離最佳值時(shí)，酶蛋白結(jié)構(gòu)改變、變性失活，茶多酚提取率隨之降低。

2.1.4 提取溫度對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖4可知，隨酶解溫度升高，茶多酚的提取率增高，適當(dāng)升溫能有效破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)滲出，當(dāng)溫度達(dá)50 ℃后，繼續(xù)升溫，酶失活，故最佳酶解溫度為50 ℃。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖5可知，在30～90 min范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，茶多酚提取率提高，提取60 min后，茶多酚含量增加偏緩，提取時(shí)間太長(zhǎng)，茶葉中有效成分可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，一些酶解產(chǎn)物例如酚類(lèi)、單寧、花色素，可成為纖維素酶的抑制劑，且隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取成本增加，適宜的提取時(shí)間為60 min。

2.2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表3。

據(jù)正交結(jié)果，各因素影響茶多酚得率的主次排列如下：料液比 B>提取時(shí)間 D>提取溫度 C>酶用量A，最佳組合為A2B2C2D3，即復(fù)合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間75 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 不同提取方法對(duì)游離氨基酸和茶多酚提取率的影響

由表4可知，在茶葉或茶葉渣提取體系中加入復(fù)合酶，采用最佳工藝參數(shù)提取，茶多酚提取率分別為23.36%、10.38%，與不加復(fù)合酶比較，分別提高55.94%、15.46%;氨基酸提取率分別為4.98%、3.12%，與不加復(fù)合酶比較，分別提高20.42%和25.32%。

2.3.2 提取液中兒茶素及咖啡堿含量

表5高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)結(jié)果表明，與茶葉或茶葉渣不加酶比較，用復(fù)合酶酶解，表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG增加12.13%、3.70%）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG增加10.69%、2.42%）、咖啡堿（CAF增加8.31%、4.35%）的提取量均有不同程度的增加，且酶解未發(fā)現(xiàn)有新成分。色譜未檢測(cè)到?jīng)]食子酸（GA）。另外，茶葉經(jīng)開(kāi)水浸泡后茶葉渣中尚含大量茶多酚，通過(guò)酶法提取可以將其中的有效成分提取，避免資源浪費(fèi)。

2.4 不同處理對(duì)提取液口味的影響

由表4、圖6看出，茶葉加酶處理游離氨基酸含量最高，其他依次是茶葉不加酶、茶葉渣加酶、茶葉渣不加酶;總體接受度同游離氨基酸含量一致，即氨基酸含量越高被接受程度越高;收斂強(qiáng)度和苦味由強(qiáng)到弱依次是：茶葉渣不加酶、茶葉渣加酶、茶葉不加酶和茶葉加酶。

3 討論與結(jié)論

茶多酚的溶劑萃取法純化難度大;超聲波提取利用超聲波與媒介物質(zhì)互相作用，發(fā)生機(jī)械及空穴作用，破壞茶葉細(xì)胞壁，加速細(xì)胞中活性物質(zhì)的溶出，其缺點(diǎn)是設(shè)備費(fèi)用高[6];微波提取利用不同物質(zhì)在微波場(chǎng)中吸收微波能力不同，待提取成分被選擇性加熱時(shí)，與提取體系分離，進(jìn)入吸收微波能力較差的提取劑中，提取成本高;離子沉淀法利用茶多酚與一些重金屬離子發(fā)生絡(luò)合形成沉淀，將金屬離子作沉淀劑，從混合物中分離純化得高純度茶多酚，此法重金屬可對(duì)產(chǎn)品造成二次污染;樹(shù)脂吸附法利用樹(shù)脂選擇性吸附茶多酚成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7]。本研究表明，酶法自茶葉或茶葉渣中提取茶多酚的提取率比不加酶分別提高55.94%和15.46%，HPLC法檢測(cè)結(jié)果，茶多酚提取率較比色法提高幅度小，因茶多酚的主要成分是黃烷酮類(lèi)、花色素類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、花白素類(lèi)和酚酸及縮酚酸類(lèi)化合物，其中黃烷酮類(lèi)（兒茶素類(lèi)化合物）占茶多酚總量的60%～80%，其次是黃酮類(lèi)、酚類(lèi)。茶多酚是混合物，兒茶素是其中的一類(lèi)物質(zhì)，高效液相色譜法測(cè)定兒茶素雖能反映茶多酚的提取率高低，但不能完全檢測(cè)茶多酚中所有成分的變化，從總趨勢(shì)推斷，纖維素酶和果膠酶作為復(fù)合酶浸提茶多酚是一種有效的提取方式[3]。

結(jié)果表明，酶法提取兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、咖啡堿和游離氨基酸的含量均有不同程度的增加。兒茶素分酯型與非酯型，酯型兒茶素收斂性強(qiáng)，主要對(duì)茶湯苦澀味起作用，而非酯型兒茶素具有先苦后甜的滋味特征，口味甜[8]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和咖啡堿（CAF）是苦味的主要貢獻(xiàn)者;氨基酸類(lèi)表現(xiàn)為酸、甜、苦、鮮4種特征，是鮮味和甘味的主要貢獻(xiàn)者[9]，可緩解茶的苦澀味[10]。酶法提取氨基酸含量增加，口感清爽度高、總體可接受程度高。

以茶葉渣為底物提取茶多酚和氨基酸含量均比茶葉低，因熱水沖泡，部分茶多酚和氨基酸溶出，研究表明熱水沖泡后還有37.75%茶多酚、36.18%氨基酸保留在茶葉渣中，采用酶法提取，所得的茶多酚和氨基酸含量比對(duì)照（不用酶）分別高15.46%、25.32%，通過(guò)酶法可以將殘留在茶葉渣的有效成分提取。與茶葉相比，茶葉渣酶法提取物感官收斂、澀味較濃，但化學(xué)成分無(wú)明顯區(qū)別，茶葉渣可作為原料提取茶多酚，用于食品原料工業(yè)。

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（責(zé)任編輯 李亞青）