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    丁烯酸內(nèi)酯二萜衍生物的制備及抗腫瘤活性研究

    2020-07-29 08:03:36左笑菲張曉梅陳凌云
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒二萜丁烯

    左笑菲,楊 帆,張曉梅,陳凌云,趙 慶

    云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,昆明 650500

    二萜成分在姜科姜花屬植物中廣泛存在,其中部分二萜具有顯著的細(xì)胞毒、抗腫瘤等生物活性[1-3]。本課題組對(duì)該屬植物二萜進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,從滇姜花、圓瓣姜花和毛姜花[4-7]中分離得到一些對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著體外細(xì)胞毒活性的二萜成分。對(duì)滇姜花的粗提物、二萜成分滇姜花素A和hedychenone進(jìn)行了小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試,結(jié)果表明它們均能顯著性抑制小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22的生長,其中滇姜花素A對(duì)H22腫瘤生長抑制率較高,為54.27%[4]。進(jìn)一步的研究表明,化合物滇姜花素C、7-hydroxy-hedychenone對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22的生長也具有顯著的抑制作用[8]。前期工作還表明,具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的二萜成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞大多具有較高的體外細(xì)胞毒活性。例如呋喃二萜coronarin E沒有細(xì)胞毒活性;但如果將coronarin E氧化,得到的一個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的二萜(4,圖1)對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株具有不同程度的細(xì)胞毒活性[6]。據(jù)此初步推測(cè):具有呋喃型二萜成分呋喃環(huán)轉(zhuǎn)化為具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物,有可能提高其細(xì)胞毒活性。雖然呋喃二萜轉(zhuǎn)化為丁烯酸內(nèi)酯型二萜通??梢蕴岣咂潴w外細(xì)胞毒活性,但其體內(nèi)抗腫瘤活性是否也同時(shí)提高,需要進(jìn)一步探討。因此,我們的后續(xù)工作以二萜coronarin E、hedychenone和滇姜花素A[9]為原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,制備了三個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物,并對(duì)這三個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行了對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180的抗腫瘤活性測(cè)試。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    核磁共振氫譜、碳譜由BrukerAM-400超導(dǎo)型核磁共振儀測(cè)定。柱色譜硅膠(300~400目)和硅膠H(青島海洋化工廠)。薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠),薄層顯色的常規(guī)方法為:5%硫酸-乙醇溶液在150 ℃下烘烤顯色明顯。

    二萜成分coronarin E(1)、hedychenone(2)、滇姜花素A(3)均由云南中醫(yī)藥大學(xué)趙慶課題組提供。

    H22細(xì)胞株(江陰齊式生物科技有限公司)。S180細(xì)胞株(昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫)。清潔級(jí)ICR小鼠共100只,雌雄各半,體重18~21 g,由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(編號(hào)SCXK(滇)K2015-0002)。白血病細(xì)胞株HL-60、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、肺癌細(xì)胞株A-549、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480均由中國科學(xué)院昆明植物研究所分析測(cè)試中心提供。

    1.2 三個(gè)二萜成分的結(jié)構(gòu)改造

    1.2.1 Coronarin E(1)的光敏氧化反應(yīng)制備化合物4

    Coronarin E(1)光敏氧化制備化合物4參見文獻(xiàn)[10]:取1.00 g coronarin E(1),溶于250 mL干燥的二氯甲烷中,加入5 mLN,N-二異丙基乙胺,加入20 mg四苯基卟啉(TPP),通入氧氣并攪拌,在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)6 h,TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。蒸干溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離,石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫,得到化合物4[10](0.81 g,白色粉末,產(chǎn)率73%),其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

    圖1 化合物1的光敏氧化

    1.2.2 Hedychenone(2)的光敏氧化反應(yīng)制備化合物5

    取hedychenone(2)1.00 g,溶于250 mL干燥的二氯甲烷中,加入5 mLN,N-二異丙基乙胺,加入20 mg四苯基卟啉(TPP),通入氧氣并攪拌,在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)6 h,TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。蒸干溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離,石油醚-乙酸乙酯2∶1洗脫,得到化合物5(0.74 g,白色粉末,產(chǎn)率為67%)?;衔?的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與姜科植物草果藥(Hedychiumspicatum)中發(fā)現(xiàn)的二萜成分spicatanol[11]一致,由此確定化合物5為spicatanol。

    圖2 化合物2的光敏氧化

    1.2.3 滇姜花素A(3)的?;c光敏氧化反應(yīng)制備化合物7

    稱取滇姜花素A(3)2.30 g,溶解于15 g吡啶,緩慢加入苯甲酰氯10 g,在100 ℃下加熱3 h,在常溫下再靜置兩天。將反應(yīng)液傾入200 mL 5%碳酸鈉溶液中,攪拌2 h。用乙酸乙酯萃取兩次(200 mL×2),萃取液合并后,用10 %磷酸二氫鈉水溶液洗滌三次(50 mL×3)。乙酸乙酯層用無水Na2SO4干燥24 h,濃縮回收。用硅膠柱色譜分離,石油醚:乙酸乙酯(60∶1→10∶1)洗脫。得化合物6(1.40 g,產(chǎn)率40%)。

    稱取化合物61.00 g,溶于250 mL無水二氯甲烷中,加入5 mLN,N-二異丙基乙胺,10 mg四苯基卟啉(TPP),通入氧氣并攪拌。在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)7 h,TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。反應(yīng)液濃縮回收,殘余物用二氯甲烷溶解,經(jīng)硅膠柱色譜分離,石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫,得到化合物7(0.47 g,產(chǎn)率31.5%)。7為白色無定形粉末,無明確熔點(diǎn)。根據(jù)反應(yīng)機(jī)理,7的結(jié)構(gòu)式應(yīng)如圖3所示,該結(jié)構(gòu)與高分辯質(zhì)譜確定的分子式C27H32O5相吻合,也與NMR數(shù)據(jù)相符。7與文獻(xiàn)報(bào)道的二萜滇姜花素C[12]結(jié)構(gòu)相似,差別僅在于:7的C-6位為β-羥基取代,而滇姜花素C的C-6位為β-苯甲酰氧基取代。因此,7的二萜結(jié)構(gòu)單元1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)與滇姜花素C很相似,將二者的NMR數(shù)據(jù)對(duì)比,即可對(duì)7的二萜結(jié)構(gòu)單元的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸宿。再采用軟件Chemdraw對(duì)7的苯甲酰氧基部分的1H NMR和13C NMR進(jìn)行預(yù)測(cè),根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果對(duì)照,可對(duì)分子中的甲酰氧基結(jié)構(gòu)單元的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。

    圖3 化合物7的制備

    1.3 化合物1、2、5、6和7的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試

    采用MTT法[13,14],測(cè)定化合物1、2、5、6和7對(duì)五個(gè)腫瘤細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒活性。陽性對(duì)照采用順鉑。

    1.4 小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

    清潔級(jí)ICR小鼠共100只,雌雄各半,體重18~21 g。每次實(shí)驗(yàn)采用50只小鼠,將小鼠隨機(jī)分為5組,分別為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、化合物4組、化合物5組和化合物7組,每組10只小鼠,雌雄各半。小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后,于左前肢皮下接種新鮮的H22(或者S180)腫瘤細(xì)胞懸液(0.1 mL/鼠,1×106細(xì)胞)。在接種腫瘤細(xì)胞后的第2日開始按分組給藥。陰性對(duì)照組腹腔注射給予DMSO,陽性對(duì)照組給予異環(huán)磷酰胺,其它各組給予相應(yīng)的待測(cè)物。每天給藥1次,于給藥的第7天將動(dòng)物脫臼處死,完整剝離腫瘤并在電子稱稱腫瘤重量及腫瘤剝離后的動(dòng)物體重。比較分析各組腫瘤重量及瘤重抑制率。

    瘤重抑制率=(陰性對(duì)照組腫瘤平均重量(g)-樣品組腫瘤平均重量(g))/陰性對(duì)照組平均腫瘤重量(g)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 新化合物的波譜數(shù)據(jù)

    化合物7HR-ESI-MS:m/z475.188 4[M+K]+(calcd for C27H32O5K+,475.188 7);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.04(3H,s,H-18),1.25(3H,s,H-19),1.38(3H,s,H-20),4.60/4.69(1H,H-17a),5.77(1H,s,H-17b),4.62(1H,s,H-6),5.88(1H,s,H-16),6.29/6.68(1H,s,H-14),6.36(1H,d,J= 15.9 Hz,H-12),6.68~6.74(1H,m,H-11),7.43~7.47(2H,m,H-4′),7.55~7.58(1H,m,H-5′),8.02~8.05(2H,m,H-3′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:42.2(t,C-1),19.1(t,C-2),43.3/43.4(t,C-3),34.4(s,C-4),55.8(d,C-5),71.1(d,C-6),44.0(t,C-7),144.2(s,C-8),62.3(d,C-9),40.5/40.4(s,C-10),142.9(d,C-11),115.9(d,C-12),144.0(s,C-13),142.8(d,C-14),171.2(s,C-15),97.6/97.7(d,C-16),111.7/112.1(t,C-17),33.4(q,C-18),23.6(q,C-19),18.1/18.2(q,C-20),166.2(s,C-1′),130.5(s,C-2′),129.6(d,C-3′),128.5(d,C-4′),133.0(d,C-5′)。

    2.2 化合物1、2、5、6和7對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性

    采用MTT法[13,14]測(cè)定化合物1、2、5、6和7對(duì)五種人腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性,測(cè)試結(jié)果見表1?;衔?和7對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株均具有顯著的細(xì)胞毒活性,這兩個(gè)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、肺癌細(xì)胞株A-549、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的抑制活性均超過陽性對(duì)照順鉑。此外,我們的前期研究工作已表明,化合物4對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株亦具有不同程度的細(xì)胞毒活性[6]。

    表1 化合物1、2、5、6和7對(duì)五種人腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度IC50

    2.3 化合物4、5及7對(duì)小鼠體內(nèi)H22腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性

    體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖4。小鼠的體重,瘤重均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    圖4 化合物4、5、7和異環(huán)磷酰胺對(duì)H22荷瘤鼠腫瘤的影響

    表2 小鼠體內(nèi)抗H22腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

    2.4 化合物4、5及7對(duì)小鼠體內(nèi)S180腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性

    體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見表3和圖5。小鼠的體重,瘤重均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    圖5 化合物4、5、7和異環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤的影響

    表3 小鼠體內(nèi)抗S180腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

    對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180抑制活性研究結(jié)果表明,化合物4、5及7均顯示了明顯的體內(nèi)抑瘤活性,其中4對(duì)H22體內(nèi)抑瘤活性較強(qiáng),抑制率接近陽性對(duì)照藥物異環(huán)磷酰胺?;衔?、7對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180的體內(nèi)抑瘤活性較強(qiáng),抑制率均超過陽性對(duì)照藥物異環(huán)磷酰胺。

    3 討論

    采用三個(gè)姜科二萜成分1、2和3經(jīng)結(jié)構(gòu)改造,得到的三個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物4、5和7,它們不僅對(duì)五種人類腫瘤細(xì)胞株有很好的體外細(xì)胞毒活性,而且對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180的生長均具有顯著的抑制作用。呋喃型二萜1和2均未顯示細(xì)胞毒活性,而它們?cè)谘趸蟮玫降摩?羥基丁烯酸內(nèi)酯型二萜4[6]和5均具有顯著的細(xì)胞毒活性。在前期工作中,二萜coronarin E(1)對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22未顯示抗腫瘤活性[8];但是其氧化后得到的化合物4,對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180生長的抑制作用較強(qiáng)?;衔?和7的抗腫瘤活性也較強(qiáng)。這說明,將姜科的二萜類成分改造為具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物,有可能提高其抗腫瘤活性。從具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的二萜成分中尋找有苗頭的抗腫瘤活性成分或先導(dǎo)化合物,可作為未來抗腫瘤藥物的一個(gè)研究方向。

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