光譜法和分子對接研究3種獸醫(yī)臨床常用抗菌藥對脲酶的影響及作用機制

王玨,徐佳迎,程粟裕,趙鴿,蔣靜艷

(南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,江蘇 南京 210095)

抗菌藥是細菌、真菌等微生物所產(chǎn)生的或者人工化學合成的一類具有抗病原體和其他活性的物質(zhì),可用于人和動物細菌感染性疾病的預(yù)防和治療,被廣泛用于動物飼料中,是目前世界上使用范圍最廣、使用量最大的一類藥物[1]。有些抗菌藥不能被有機體完全吸收,大部分以母體化合物的形式隨畜禽糞便排出體外[2]。已有研究表明磺胺類和四環(huán)素糞尿排出物隨污水處理廠污泥、有機肥施用、污水灌溉、魚類底泥施用等途徑進入水體或土壤環(huán)境中,對水體或土壤中的生物產(chǎn)生直接或間接毒害作用,并且誘導(dǎo)抗性細菌及抗性基因出現(xiàn),從而導(dǎo)致特殊的生態(tài)毒理效應(yīng),最終進入食物鏈威脅人類健康[3]。

脲酶(urease,EC3.1.1.5)廣泛存在于各種細菌、真菌、動物、植物和人體中,能快速催化尿素水解為氨和二氧化碳,脲酶的活性直接影響尿素的利用率,有脲酶催化情況下,尿素的水解速率是無催化反應(yīng)速率的1014倍[4]。環(huán)境中污染物的攝入可能改變脲酶的結(jié)構(gòu),從而引起其功能和特性的改變,進而影響尿素的利用率。國彬等[5]通過室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗結(jié)果表明,培養(yǎng)前期磺胺類抗菌藥對脲酶活性的影響表現(xiàn)為“低促高抑”,培養(yǎng)后期呈現(xiàn)一定的抑制作用。閆賽紅[6]研究表明典型喹諾酮類抗菌藥恩諾沙星對土壤脲酶活性的影響表現(xiàn)高濃度有顯著抑制作用。金蘭淑等[7]研究表明,四環(huán)素的加入對土壤脲酶活性的影響為低濃度促進,高濃度抑制,不同濃度四環(huán)素對酶活性的影響不一樣。關(guān)于外源物質(zhì)如何作用于脲酶、作用力是什么、作用位點在哪里,這些問題尚不清楚。

光譜法具有分析速度快、操作簡便、靈敏度高等特點,是研究小分子與蛋白質(zhì)之間相互作用的最為典型的方法之一[8]。目前常用的方法有熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色光譜法等。分子對接法是一種分子模擬技術(shù),依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”,將小分子配體置于受體的活性位點處,通過理論計算得到配體和受體相互作用的最佳匹配,以達到模擬小分子和生物大分子相互作用的目的[9]。Bagheri等[10]運用光譜法和分子對接法研究表明,黃曲霉素B1和G1以氫鍵和疏水力為主要作用力與人血清蛋白(HSA)相互結(jié)合,導(dǎo)致HSA熒光光譜發(fā)生猝滅,且G1與HSA的結(jié)合能力高于B1。Zeng等[11]運用多種光譜法結(jié)合分子對接研究表明,蘆薈大黃素通過靜電作用與酪氨酸酶在其活性部位形成1個結(jié)合位點,引起酪氨酸酶構(gòu)象改變,同時占據(jù)酶的催化中心,避免底物進入,導(dǎo)致酪氨酸酶活性降低。目前,關(guān)于獸用抗菌藥與脲酶相互作用的機制尚未明確。

本文選擇了磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類三類抗菌藥的典型代表磺胺二甲嘧啶(SMZ,EC200-346-4)、恩諾沙星(ENR,EC618-911-2)和四環(huán)素(TC,EC200-481-9)及脲酶為研究對象,測定水溶液中3種抗菌藥對脲酶活性的影響,運用熒光光譜法結(jié)合紫外-可見吸收光譜法探究其與脲酶相互作用的參數(shù)信息和構(gòu)象變化,通過分子對接預(yù)測二者的最佳結(jié)合位點和作用力信息,研究一些抗菌藥對脲酶活性的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脲酶(精制級)和鹽酸四環(huán)素(USP級)購自上海源葉生物科技有限公司,磺胺二甲嘧啶鈉(純度:98%)和恩諾沙星(純度:98%)購自上海麥克林生化科技有限公司,其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)濃度為0.05 mol·L-1,pH7.0。用超純水將脲酶配制成1 mg·mL-1的儲備液;準確稱取適量SMZ、TC標準品,配制成2.0×103μmol·L-1的儲備液,ENR儲備液濃度為4.0×103μmol·L-1;準確稱取適量尿素,配制成4 mol·L-1的儲備液。試驗用水為超純水(≥18.25 MΩ·cm),其他試劑均為分析純。

UV-1601紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);Ensight多功能成像酶標儀(美國Perkin Elmer公司);759S紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性[12]。取10 mL容量瓶,加入不同體積(SMZ、TC:0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 mL;ENR:0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mL)抗菌藥儲備液和0.65 mL 脲酶儲備液,10 ℃下充分混合反應(yīng)1 h后,作為酶液備用,酶液中加入2 mL尿素儲備液和4 mL PBS緩沖液,超純水定容,室溫下反應(yīng)20 min后,作為工作液備用。移取工作液10 μL于50 mL容量瓶中,加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液,邊加邊搖勻,20 min 后顯色,定容,1 h內(nèi)在分光光度計于578 nm波長處比色。預(yù)試驗結(jié)果證明,SMZ和TC濃度為 400 μmol·L-1時,脲酶活性變化趨勢基本保持平穩(wěn),而ENR呈增加趨勢,因此SMZ和TC濃度范圍設(shè)置為0～400 μmol·L-1,而ENR濃度范圍適當增加,設(shè)置為0～800 μmol·L-1。標準曲線繪制方法:取10 mL容量瓶,加入不同體積脲酶儲備液,10 ℃下放置1 h后,作為酶液備用,其他步驟同上。以脲酶濃度為橫坐標,A值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 熒光光譜法取一系列10 mL容量瓶,加入0.65 mL 脲酶儲備液(0.065 mg·mL-1)和不同體積(SMZ、TC:0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 mL;ENR:0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mL)抗菌藥儲備液,超純水定容,設(shè)置3組平行,在10 ℃ 下靜置1 h后,在激發(fā)波長為280 nm,于295～700 nm掃描混合體系?？咕帩舛确秶富钚詼y定。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜法準確量取0.65 mL 脲酶儲備液(0.065 mg·mL-1)和不同體積(SMZ、TC:0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mL;ENR:0、0.025、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250和0.300 mL)抗菌藥溶液加入10 mL容量瓶中,超純水定容,設(shè)置3組平行,在10 ℃下靜置1 h后于紫外可見分光光度計上于190～500 nm掃描混合體系。預(yù)試驗證明SMZ、ENR、TC檢測上限為100～150 μmol·L-1,因此紫外-可見吸收光譜測定時,3種抗菌藥的濃度范圍設(shè)為0～120 μmol·L-1。

1.2.4 分子對接法脲酶晶體結(jié)構(gòu)來自于RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/),編碼為3LA4。采用Gauss View 95.0軟件繪制配體(SMZ、TC、ENR)的三維結(jié)構(gòu),并用Gaussian09軟件通過DFT/B3LYP方法進行優(yōu)化,得到其能量最小的構(gòu)象。利用AutoDock 4.2.6軟件進行分子對接,通過拉馬克遺傳算法預(yù)測蛋白質(zhì)分子和配體的最佳結(jié)合位置,選取結(jié)合能最低的復(fù)合物構(gòu)象,利用PyMOL軟件進行可視化研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺二甲嘧啶(SMZ)、恩諾沙星(ENR)、四環(huán)素(TC)對脲酶活性的影響

由圖2可知:SMZ和ENR對脲酶活性有一定的促進作用,而TC對脲酶活性呈低濃度促進、高濃度抑制作用。隨SMZ濃度逐漸增加,SMZ對脲酶活性促進作用逐漸增強。當SMZ濃度為400 μmol·L-1時,促進率達到37.20%;ENR濃度為0～800 μmol·L-1,其對脲酶活性的促進作用隨ENR濃度增加逐漸增強,且當ENR為800 μmol·L-1時,促進率達47.00%;TC在較低濃度(0～50 μmol·L-1)時對脲酶活性有促進作用,當濃度進一步增加,其對脲酶活性由促進作用轉(zhuǎn)為抑制作用,且當TC濃度為350 μmol·L-1時,抑制率達89.00%,之后基本穩(wěn)定。當SMZ、ENR、TC在同一濃度水平時,TC對脲酶活性的影響程度明顯大于SMZ和ENR。除150和400 μmol·L-1之外,ENR對脲酶活性的影響程度均大于SMZ。

2.2 SMZ、ENR、TC對脲酶熒光光譜的影響

激發(fā)波長為280 nm時,脲酶的特征熒光峰在340 nm左右。由圖3可知:保持脲酶濃度不變,隨SMZ、ENR、TC濃度的增加,脲酶的熒光強度均呈有規(guī)律的降低,有明顯的猝滅作用。在SMZ的作用下,脲酶熒光強度逐漸降低且最大發(fā)射波長發(fā)生紅移;ENR的加入導(dǎo)致熒光強度逐漸降低,且隨ENR濃度增加,脲酶特征峰消失;在TC的作用下,脲酶熒光強度逐漸降低且最大發(fā)射波長發(fā)生輕微藍移。這初步表明3種抗菌藥SMZ、ENR、TC與脲酶發(fā)生了相互作用,導(dǎo)致脲酶熒光發(fā)生猝滅。

熒光猝滅的類型分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[9]。動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或物理碰撞導(dǎo)致;靜態(tài)猝滅是小分子與蛋白質(zhì)之間形成復(fù)合物導(dǎo)致。所得熒光數(shù)據(jù)利用Stern-Volmer方程進行分析[13]:F0/F=1+KSVQ=1+Kqτ0Q。式中:F0為脲酶在340 nm處的熒光強度;F為SMZ-脲酶、ENR-脲酶、TC-脲酶混合體系在340 nm處的熒光強度;Q為猝滅劑的濃度;KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù);Kq為猝滅速率常數(shù);τ0為猝滅劑不存在時熒光分子平均壽命(生物大分子的平均壽命約為10-8s);各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1。以F0/F對Q作圖,由直線斜率得到Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV,由此計算出相應(yīng)的猝滅速率常數(shù)Kq,數(shù)據(jù)見表1。在一定濃度范圍內(nèi),3種抗菌藥SMZ、ENR、TC的猝滅速率常數(shù)Kq均遠大于2.0×1010L·mol-1·s-1,因此推測脲酶的熒光猝滅是由于SMZ、TC、ENR與脲酶形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

采用位點結(jié)合模型描述天然產(chǎn)物分子與蛋白之間的相互作用。對于靜態(tài)猝滅過程,蛋白質(zhì)熒光強度與猝滅劑濃度的關(guān)系滿足Lineweaver-Burk雙對數(shù)方程:lg[(F0-F)/F]=lgK+nlgQ[13],以lg[(F0-F)/F]對lgQ作圖,可根據(jù)斜率和截距得到結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點數(shù),結(jié)果見表2。SMZ、ENR、TC與脲酶的結(jié)合常數(shù)分別為1.10×104、6.20×103和1.74×106,結(jié)合位點數(shù)分別為1.06、0.82和1.43,均約等于1,表明 3種抗菌藥均能與脲酶形成1∶1的復(fù)合物,其中TC的結(jié)合作用較強。

表2 SMZ-脲酶、ENR-脲酶和TC-脲酶相互作用的結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點數(shù)(n)Table 2 Binding constants(KA)and binding sites(n)of the SMZ-urease,ENR-urease and TC-urease interactions

2.3 SMZ、ENR、TC對脲酶紫外-可見吸收光譜的影響

蛋白質(zhì)在200 nm處的吸收峰是肽骨架本身電子位移的躍遷,而280 nm處的吸收峰則是蛋白質(zhì)殘基的特征吸收峰[14]。為進一步研究脲酶的構(gòu)象變化,分別測定不同濃度SMZ、ENR、TC與脲酶反應(yīng)體系的紫外吸收光譜圖(圖4)。未添加抗菌藥時,脲酶在202和278 nm處各有1個吸收峰,分別表示脲酶蛋白質(zhì)骨架的光譜性質(zhì)和氨基酸殘基的特征吸收。隨SMZ、ENR、TC的加入,202 nm處的吸收峰隨濃度的增加逐漸增強,并發(fā)生輕微紅移,表明SMZ、ENR、TC均與脲酶發(fā)生相互作用,導(dǎo)致脲酶蛋白質(zhì)骨架更加緊密。隨SMZ的加入,278 nm處的吸收峰藍移至260 nm,并且吸收峰強度隨SMZ濃度增加而逐漸增強。當SMZ濃度為80 μmol·L-1時,SMZ在240 nm處也有吸收峰產(chǎn)生,并隨SMZ濃度增加而增強;隨ENR濃度的增加,278 nm處的吸收峰藍移至271 nm,且吸收峰強度逐漸增強,表明脲酶氨基酸殘基周圍環(huán)境發(fā)生改變;隨TC濃度的增加,278 nm處的吸收峰逐漸增強,并發(fā)生輕微藍移,TC在360 nm處也有1個吸收峰,且隨TC濃度的增加而增強。

2.4 SMZ、ENR、TC與脲酶的分子對接

脲酶未發(fā)生分子對接時,其自身活性中心有2個Ni原子,Ni(1)與HIS-519(組氨酸)和HIS-545(組氨酸)配位,Ni(2)與ASP-633(天冬氨酸)、HIS-409(組氨酸)、HIS-407(組氨酸)和KCX-490(羧化賴氨酸)配位,脲酶的催化尿素水解活性主要靠其活性部分的Ni(2)離子發(fā)揮作用[15]。由圖5可知:SMZ、ENR、TC與脲酶發(fā)生結(jié)合作用時,脲酶活性中心與Ni配位的氨基酸殘基未發(fā)生改變,且3種抗菌藥均與脲酶產(chǎn)生氫鍵,表明氫鍵是重要的結(jié)合方式。SMZ分別與ARG-439(精氨酸)和VAL-591(纈氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為2.5和2.4 nm;ENR與ARG-439(精氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為1.9和2.6 nm,與CYS-592(半胱氨酸,標記為CME-592)形成1個氫鍵,鍵長為3.3 nm;TC與ASP-494(天冬氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為2.2和2.9 nm。

由表3可知:除氫鍵作用力以外,還有范德華力、去溶劑能和靜電作用力發(fā)揮作用。3種抗菌藥與脲酶最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象的結(jié)合能從大到小依次為:SMZ、ENR、TC,即隨苯環(huán)數(shù)目的增加,其與脲酶結(jié)合更緊密,結(jié)合生成的復(fù)合物也更穩(wěn)定。

表3 SMZ-脲酶、ENR-脲酶和TC-脲酶結(jié)合的對接參數(shù)信息Table 3 The docking parameter information results of SMZ-urease,ENR-urease and TC-urease binding

3 討論

酶蛋白具有多樣和復(fù)雜的結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)與其功能存在一定關(guān)系,其結(jié)構(gòu)的改變可能會引起相關(guān)功能的改變[16]。在本試驗濃度范圍內(nèi),SMZ和ENR對脲酶活性有促進作用,TC表現(xiàn)為低濃度促進,高濃度抑制作用,與文獻的研究結(jié)果[5-7]不同。已有研究多為稻田栽培試驗和室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗,且受培養(yǎng)時間影響,其中抗菌藥對土壤脲酶活性影響可能與土壤固氮和有機質(zhì)含量顯著相關(guān)[17],并且可能是抗菌藥母體與降解產(chǎn)物共同作用的結(jié)果。本試驗為純抗菌藥試劑與脲酶的短時間反應(yīng),試驗結(jié)果僅反映抗菌藥母體對脲酶活性與結(jié)構(gòu)的影響。

外源分子與脲酶相互作用可能引起脲酶熒光強度的變化,包括激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重排、能量轉(zhuǎn)移和基態(tài)配合物的形成[18]。本研究中,熒光光譜結(jié)果表明,SMZ、ENR、TC均與脲酶結(jié)合形成1∶1的復(fù)合物,導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅,其中SMZ導(dǎo)致脲酶熒光光譜發(fā)生輕微紅移,TC導(dǎo)致輕微藍移。張晟瑞等[19]研究表明SMZ改變了疏水性氨基酸殘基Trp(色氨酸)附近的微環(huán)境,使其疏水性減少,從而猝滅了人血清蛋白(HSA)的熒光且發(fā)生輕微紅移。本研究中SMZ的結(jié)果與此結(jié)果一致,SMZ的加入導(dǎo)致Trp殘基微環(huán)境極性增加,疏水性降低。Hao等[20]運用光譜法研究姜黃素(CUR)與牛血清蛋白(BSA)的相互作用結(jié)果表明,CUR與BSA結(jié)合形成1∶1復(fù)合物,且CUR改變了Trp殘基附近的微環(huán)境,使其疏水性增加,導(dǎo)致BSA熒光光譜發(fā)生猝滅且輕微藍移。本研究中TC的結(jié)果與此結(jié)果一致,表明TC的加入導(dǎo)致Trp殘基微環(huán)境極性降低,疏水性增加。

分子對接法進一步驗證,SMZ、ENR、TC均與脲酶產(chǎn)生氫鍵,其中與SMZ結(jié)合的ARG-439和與ENR結(jié)合的ARG-439、CME-592均為親水性氨基酸,導(dǎo)致脲酶活性中心親水性增強,疏水性降低,從而促進底物進入脲酶活性中心,表現(xiàn)為促進脲酶活性。Ali等[21]研究表明,疏水性氨基酸的作用抑制6-甲酰傘形酮膽堿酯酶活性,與本試驗結(jié)果一致。與TC結(jié)合的ASP-494為親水性氨基酸,導(dǎo)致脲酶表面親水性增強,推測在低濃度時親水性氨基酸的作用表現(xiàn)為促進脲酶活性。此外,空間阻位作用也會影響底物和酶的親和力,空間阻位作用大于氨基酸殘基,導(dǎo)致疏水性增加,熒光光譜表現(xiàn)為輕微藍移。李興春等[22]等研究表明,體積較大的基團與周圍氨基酸殘基間存在空間阻位。Gao[23]等通過分子對接表明TCH(鹽酸四環(huán)素)對半乳糖苷酶的抑制作用,可能是由于TCH插入酶活性中心產(chǎn)生空間阻位。本研究中,TC在脲酶活性中心的結(jié)合位置與SMZ、ENR不同,推測由于TC體積比SMZ和ENR大,隨TC濃度的升高,產(chǎn)生空間阻位,從而抑制底物與脲酶結(jié)合。這種抑制作用可能在TC濃度夠高且空間阻位作用大于親水性作用時才表現(xiàn)出來,因此低濃度TC由于氨基酸殘基微環(huán)境的改變表現(xiàn)為促進脲酶活性。

SMZ、ENR、TC對脲酶活性的影響程度從大到小依次為TC、ENR、SMZ,即影響程度隨苯環(huán)數(shù)的增加而增大,且分子對接進一步表明SMZ、ENR、TC與脲酶的結(jié)合作用隨苯環(huán)及苯環(huán)上羥基數(shù)目的增多而增強。苯環(huán)數(shù)量導(dǎo)致結(jié)合作用增強的原因尚不明確,還需進一步研究。