浮萍葉面細菌群落對砷的氧化及該過程受抗生素的影響

謝婉瀅,鄒希

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

稻田環(huán)境中砷(As)的生物地球化學(xué)循環(huán)與人類健康密切相關(guān)。As在環(huán)境中的形態(tài)決定其毒性及生物有效性[1]。作為As代謝的主要過程,環(huán)境中As的氧化還原顯著影響植物對As的吸收和累積[1-2]。稻田環(huán)境中,水稻根際微生物介導(dǎo)As的氧化和還原[2]。淹水條件下,土壤中的As主要被微生物還原為三價砷(AsⅢ)。AsⅢ被礦物吸附的能力弱,且移動性強,通過水稻硅吸收通道被吸收,導(dǎo)致水稻相對于旱作植物更容易累積As[3]。五價砷(AsⅤ)容易被礦物表面的鐵錳化合物吸附,水稻根際微生物將AsⅢ氧化為AsⅤ能夠降低水稻對As的吸收[2]。因此,增加水稻環(huán)境中AsⅢ的氧化是降低水稻As累積的潛在途徑[4]。從水稻環(huán)境中分離AsⅢ氧化細菌,可以作為水稻環(huán)境As污染的潛在修復(fù)手段[5]。

浮萍是水稻環(huán)境中常見的浮水植物,其葉面好氧與厭氧結(jié)合的微環(huán)境中生存著豐富多樣的細菌群落[6]。浮萍葉面的As代謝細菌由AsⅢ氧化菌主導(dǎo)[7]。然而,從浮萍或者其他水生植物葉面分離AsⅢ氧化細菌的研究報道較少。同時,由于抗生素在醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用,環(huán)境中的抗生素污染日趨嚴重,這其中也包括水稻田環(huán)境[8-9]。在抗生素污染的條件下,浮萍葉面細菌群落及可培養(yǎng)菌株對AsⅢ的氧化是否會有變化,這種變化對浮萍吸收和累積As影響如何還未見報道。因此,本研究主要測定浮萍葉面細菌群落對AsⅢ的氧化能力和對浮萍吸收累積As的作用,以及抗生素對該AsⅢ氧化過程、浮萍吸收累積As的能力和可培養(yǎng)AsⅢ氧化菌株的影響,探討As和抗生素復(fù)合污染條件下As生物地球化學(xué)循環(huán)的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

浮萍(Wolffiaaustraliana)由蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Prof. Dr. Elias Landolt提供。有菌浮萍在溫室中培養(yǎng)于水稻土(采集于湖南常德)中,液面保持5～10 cm。根據(jù)浮萍的生長情況,不定期向土壤中施加240 mg·kg-1CO(NH2)2和240 mg·kg-1K2HPO3·3H2O。無菌浮萍的獲取和維持方法為:純凈水洗凈在溫室中培養(yǎng)的浮萍,于10 g·L-1NaClO中浸泡3 min,用無菌水徹底沖洗;將單個葉片轉(zhuǎn)移至含10 g·L-1蔗糖的固體 Hoagland 培養(yǎng)基中。待浮萍成活后,選取培養(yǎng)基上不含細菌菌落的浮萍用于傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)基為含10 g·L-1蔗糖的Hoagland溶液。傳代浮萍于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每月更換培養(yǎng)基。為檢查浮萍的無菌條件,定期采集培養(yǎng)液涂布于LB培養(yǎng)基觀察是否有菌落生長。舍棄有菌落的傳代培養(yǎng)或者將傳代浮萍再按照以上的方法進行除菌,直到獲得不含細菌的浮萍。

Hoagland營養(yǎng)液(pH6):10 mmol·L-1KNO3,1 mmol·L-1KH2PO4,2 mmol·L-1MgSO4,2 mmol·L-1Ca(NO3)2,48.5 μmol·L-1H3BO3,20 μmol·L-1FeSO4-EDTA,10 μmol·L-1MnCl2,0.7 μmol·L-1ZnSO4,0.35 μmol·L-1CuSO4,0.1 μmol·L-1Na2MoO4。細菌篩選培養(yǎng)基(pH7):0.25 g·L-1NH4Cl,0.5 g·L-1KCl,0.1 g·L-1CaCl2,0.4 g·L-1MgCl2·6H2O,0.5 g·L-1NaCl,0.6 g·L-1NaH2PO4。培養(yǎng)基高溫滅菌冷卻至50 ℃左右加入10 mL·L-1礦質(zhì)元素母液和10 mL·L-1維生素母液[10]。

試驗處理設(shè)置為:無菌浮萍、有菌浮萍、有菌浮萍+抗生素(50 mg·L-1氯霉素[11])處理及不加浮萍的培養(yǎng)液對照。每個處理4個重復(fù)。

1.2 試驗方法與測定

1.2.1 浮萍葉面菌群對As的轉(zhuǎn)化能力測定于100 mL錐形瓶中加入50 mL培養(yǎng)液,用無菌塑料封膜封住瓶口,于121 ℃滅菌30 min。分別向滅菌后的培養(yǎng)液中加入2.5 g無菌浮萍、有菌浮萍和有菌浮萍+抗生素,以不加浮萍的培養(yǎng)液為空白對照。將錐形瓶于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入0.1 mL 50 mg·L-1無菌AsⅢ溶液(0.22 μm無菌過濾),使培養(yǎng)液中AsⅢ的最終質(zhì)量濃度為110 μg·L-1。加入AsⅢ后,于0、10、24、72和168 h分別取1 mL溶液,用于測定As的形態(tài)和總量。于168 h收集溶液,一部分用于測定As的形態(tài)和總量,一部分用于篩選浮萍葉面可培養(yǎng)細菌。光照培養(yǎng)條件為:相對濕度60%,光照強度 50 μmol·m-2·s-1,晝/夜時間14 h/10 h,晝/夜溫度30 ℃/25 ℃。

1.2.2 浮萍培養(yǎng)液和葉面可培養(yǎng)細菌的篩選和鑒定將浮萍葉面細菌用0.02%(體積分數(shù))Tween-20洗脫[6],將洗脫液和浮萍培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋,涂布于培養(yǎng)基上,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d,挑選形態(tài)不同的菌落,于固體培養(yǎng)基劃線純化。純化后的菌落通過菌落PCR用于細菌鑒定。PCR引物為27F和1492R。PCR體系:12.5 μL Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo Scientific),前、后引物各1 μL,無菌水10.5 μL,無菌牙簽蘸取適量菌落。PCR條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物測序由上海美吉生物醫(yī)藥有限公司完成。

1.2.3 浮萍培養(yǎng)液和葉面可培養(yǎng)細菌對As的轉(zhuǎn)化能力測定將從浮萍培養(yǎng)液和葉面篩選到的菌株在含100 μg·L-1AsⅢ的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600值為0.8,轉(zhuǎn)接50 μL菌液于含100 μg·L-1AsⅢ的5 mL液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r·min-1避光培養(yǎng)50 h。以不加菌液的含AsⅢ培養(yǎng)液為空白對照(CK),測定培養(yǎng)液中的As形態(tài)和濃度。

1.2.4 As形態(tài)的測定浮萍中As形態(tài)測定:稱取0.5 g新鮮浮萍于50 mL特氟龍的微波消煮管中,加入10 mL 1%(體積分數(shù))硝酸(優(yōu)級純,Merck,德國),靜置過夜后,微波消煮儀中消煮。消煮程序為:55 ℃ 10 min,75 ℃ 10 min,95 ℃ 30 min,每個階段溫度上升時間為5 min。消解液冷卻、過濾(0.22 μm濾頭)后用高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ICP-MS,PerkinElmer NexIon 300x)測定As形態(tài)。樣品中As形態(tài)通過與混標中As標準形態(tài)的出峰時間對比獲得。As標準形態(tài)包括:三價砷(AsⅢ)、五價二甲基砷(DMAⅤ)、五價單甲基砷(MMAⅤ)和五價砷(AsⅤ)。4種As形態(tài)的濃度采用峰面積外標法計算,以已知濃度DMAⅤ的峰面積為標準?？瞻自噭┖蜆藴饰镔|(zhì)(大米,GBW10010,國家標準物質(zhì)研究中心)各3個重復(fù)。大米中As的回收率為(95.8±2.0)%。溶液樣品過濾(0.22 μm濾頭)后,采用上述相同的方法測定溶液中As的形態(tài)和濃度。

1.2.5 As總濃度的測定浮萍中As總濃度測定:稱取0.2 g新鮮浮萍于50 mL特氟龍的微波消煮管中,加入2.0 mL 65%硝酸,靜置過夜,加入1 mL 30% H2O2。微波消煮程序同1.2.4節(jié)。消解液冷卻后用超純水稀釋到50 mL,過0.45 μm過濾器。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定濾液中As總濃度。試劑空白和標準物質(zhì)(灌木枝葉,GBW07603,國家標準物質(zhì)研究中心)各3個重復(fù)。標準物質(zhì)總As回收率為(97.5±4.6)%。溶液樣品中各種As形態(tài)濃度的總和作為As總濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12和Adobe Illustrator CS5軟件繪圖和處理。用Excel 2010計算平均值和標準差(SE,n=4)。用SPSS 18.0中One-way ANOVA或者t測驗對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理溶液中AsⅢ的轉(zhuǎn)化

從圖1可知:浮萍培養(yǎng)液中只檢測到AsⅢ和AsⅤ,有機As形態(tài)未檢出。在加浮萍的3種處理中,AsⅢ質(zhì)量濃度隨時間不斷降低,降低的速率從大到小的處理依次為有菌浮萍、有菌浮萍+抗生素、無菌浮萍處理。有菌浮萍處理中AsⅢ質(zhì)量濃度在10 h時降低為初始濃度的2.6%,之后一直保持低濃度(小于0.5 μg·L-1)。溶液中AsⅤ質(zhì)量濃度隨時間不斷增加,增加速率從大到小的處理依次為有菌浮萍、有菌浮萍+抗生素、無菌浮萍處理。對照處理中AsⅢ和AsⅤ的質(zhì)量濃度變化較小,但也有小部分AsⅢ被氧化為AsⅤ,AsⅤ質(zhì)量濃度在168 h時為7.2 μg·L-1。無菌浮萍處理溶液中AsⅤ質(zhì)量濃度在10 h時僅為3.3 μg·L-1,略低于空白對照(5.0 μg·L-1);但168 h后溶液中AsⅤ質(zhì)量濃度達22 μg·L-1,顯著高于空白對照。有菌浮萍處理中,10 h時溶液中 AsⅤ 質(zhì)量濃度急劇增加到96 μg·L-1(占As總質(zhì)量濃度的比例為97.1%),168 h后,溶液中AsⅤ質(zhì)量濃度降低到75 μg·L-1(占As總質(zhì)量濃度的比例為99.5%)。添加抗生素的有菌浮萍處理中,AsⅤ質(zhì)量濃度的增加速率相比有菌浮萍處理急劇降低,72和168 h時溶液中AsⅤ質(zhì)量濃度分別為49和54 μg·L-1(分別占As總質(zhì)量濃度的70.2%和72.9%)。有菌浮萍和添加抗生素的有菌浮萍處理中,AsⅤ質(zhì)量濃度超過AsⅢ質(zhì)量濃度的取樣時間分別為10和72 h,而在整個培養(yǎng)過程中,無菌浮萍體系中AsⅢ的質(zhì)量濃度始終高于AsⅤ質(zhì)量濃度。

2.2 不同處理中浮萍對As的吸收與累積

添加浮萍的溶液中As總質(zhì)量濃度隨處理時間延長不斷降低,72 h時,溶液中As總質(zhì)量濃度達到平衡(圖2)。無菌浮萍溶液中As總質(zhì)量濃度的降低速度最快,在72 h時已降低至初始值的50%。有菌浮萍處理溶液中As總質(zhì)量濃度降低速度比無菌浮萍慢,而添加抗生素可在一定程度上提高As總質(zhì)量濃度的降低速度。根據(jù)As在培養(yǎng)體系中的質(zhì)量守恒,無菌浮萍和有菌浮萍+抗生素處理溶液中減少的As主要被浮萍吸收,分別為2.83和2.04 μg(表1)。此外,與空白對照(0.48 μg)類似,無菌浮萍和有菌浮萍+抗生素處理溶液中還有一小部分As被溶液中的沉淀吸附,分別為0.55和0.39 μg(表1)。無菌浮萍以及添加抗生素的有菌浮萍中As的總含量和總量顯著高于有菌浮萍(P<0.05),總含量分別為后者的3.4和2.9倍(圖3,表1)。根據(jù)有菌浮萍初始體系與168 h體系間As差量(1.65 μg)可判斷,有菌浮萍處理中,除了浮萍吸收和沉淀吸附的As以外,還有部分As可能被體系中的微生物吸收或者吸附(表1)。無菌浮萍和有菌浮萍+抗生素處理的浮萍中As形態(tài)主要為AsⅢ(分別占As總含量的96.8%和94.0%),而AsⅤ所占比例小(分別只占As總含量的3.2%和6.0%)(圖4)。有菌浮萍中AsⅤ的比例顯著增加(P<0.05),占As總含量的49.7%(圖4)。

表1 浮萍培養(yǎng)體系中As的質(zhì)量平衡Table 1 Mass balance of As in the duckweed incubation systems

2.3 不同處理中可培養(yǎng)細菌對As的轉(zhuǎn)化

空白對照和無菌浮萍體系中沒有分離到可培養(yǎng)細菌。有菌浮萍和添加抗生素的有菌浮萍培養(yǎng)體系中總共分離到38株細菌。從圖5可知:培養(yǎng)50 h后,空白對照中的AsⅢ有小部分被氧化為AsⅤ。相對于空白對照,有25株可培養(yǎng)細菌表現(xiàn)出對AsⅤ的還原能力,只有7株菌株表現(xiàn)出微弱的AsⅢ氧化能力。D2、D3、D6、D8、D10、D12和D13都從有菌浮萍葉面上分離得到,對AsⅢ具有氧化能力。然而,這些細菌對AsⅢ氧化能力較弱,菌株培養(yǎng)液中AsⅤ的濃度都沒有超過空白對照的2倍。有菌浮萍的培養(yǎng)液中,以及添加抗生素的浮萍培養(yǎng)處理(包括葉面和溶液)中分離到的細菌都沒有表現(xiàn)出對AsⅢ的氧化能力。

其中D2、D8、D12和D13屬于α-變形菌,其16S rRNA基因與Asticcacaulissp.(GU199450.1)、Sphingomonassp.(AM900786.1)、Novosphingobiumsp.(MH392629.1)和Porphyrobactersp.(AB033326.1)的同源性分別為99.8%、97.7%、98.8%和99.3%;D3和D10屬于β-變形菌,其16S rRNA基因與Kinneretiasp.(KU360713.1)和Hydrogenophagasp.(MK751587.1)的同源性分別為99.0%和99.2%;D6屬于γ-變形菌,其16S rRNA基因與Pseudomonassp.(MG674651.1)的同源性為99.7%。

3 討論

水生植物葉面生存著具有較高多樣性的細菌群落,這些細菌群落在生物地球化學(xué)循環(huán)中有著不可忽略的作用[6]。本研究結(jié)果表明,浮萍葉面細菌群落導(dǎo)致有菌浮萍體系中AsⅢ的氧化,這主要體現(xiàn)在3個方面:1)有菌浮萍處理相對于無菌浮萍處理對AsⅢ的快速氧化;2)抗生素對該氧化過程的顯著抑制;3)AsⅢ氧化菌株全部分離于有菌浮萍葉面。在空白對照中,AsⅢ轉(zhuǎn)化為AsⅤ的速率非常慢,為AsⅢ的化學(xué)氧化[12]。當(dāng)加入無菌浮萍后,體系對AsⅢ氧化速率增強。高等植物對As的轉(zhuǎn)化主要表現(xiàn)為還原,因此無菌浮萍體系對AsⅢ的氧化可能主要由于浮萍的代謝(例如光合作用釋放氧氣)在一定程度上促進 AsⅢ的化學(xué)氧化。含有浮萍的3個處理中,被氧化的AsⅤ不斷在溶液中累積。這主要是由于植物主要通過磷吸收蛋白吸收AsⅤ[13],而培養(yǎng)液中高濃度的磷(1.0 mmol·L-1)抑制浮萍對AsⅤ的吸收。在大田環(huán)境中,由于磷肥的廣泛使用,水生植物吸收AsⅤ受到高濃度磷的抑制,這就使表層水體中的AsⅢ不斷被浮水植物葉面細菌群落氧化為AsⅤ,并以AsⅤ的形態(tài)進行累積。同時,由于AsⅤ相對于AsⅢ更容易被礦物質(zhì)吸附,葉面細菌群落驅(qū)動的AsⅢ氧化有利于降低水環(huán)境中As的生物有效性[1]。

由于不同培養(yǎng)體系中As形態(tài)動態(tài)變化的差異,浮萍對As的總累積量和形態(tài)在不同處理間也表現(xiàn)出顯著差異。無菌浮萍培養(yǎng)體系中AsⅢ為主要形態(tài),植物對AsⅢ的吸收主要受Si通道蛋白控制[13]。超純水配制的培養(yǎng)液中Si濃度低,對浮萍吸收AsⅢ的抑制作用小,因而無菌浮萍對AsⅢ的總吸收速率快,對As的累積濃度高。有菌浮萍體系中,葉面細菌快速將AsⅢ氧化為AsⅤ,受溶液中高濃度磷的抑制,AsⅤ進入浮萍的速率慢,導(dǎo)致As在浮萍中的累積濃度低。本研究中,有菌浮萍體系中微生物群落累積了非常高比例的As。這些結(jié)果表明葉面細菌群落的存在對浮萍累積As具有非常好的阻控作用。同時,由于葉面細菌的快速氧化,有菌浮萍培養(yǎng)溶液中AsⅢ長時間處于低濃度狀態(tài)。這增加浮萍與溶液中AsⅢ的濃度梯度,導(dǎo)致有菌浮萍中的AsⅢ更容易外排。有菌浮萍相對于無菌浮萍含有更低比例的AsⅢ,說明水生植物葉面細菌群落對水生植物中As的形態(tài)有顯著的影響。

添加抗生素抑制浮萍葉面細菌對AsⅢ的氧化,增加溶液中AsⅢ的比例,并減少浮萍葉面微生物對As的累積,這導(dǎo)致浮萍對AsⅢ的吸收增加,從而使浮萍中AsⅢ的比例和As累積總量也增加。本研究中采用的氯霉素能夠抑制細菌蛋白合成[14],因此有效抑制浮萍葉面細菌群落對AsⅢ的氧化。氯霉素的添加也能夠抑制沉積物中微生物群落對AsⅢ的氧化,但對AsⅤ的還原影響不顯著[10]。這說明環(huán)境中 AsⅢ的氧化更容易受抗生素污染的影響。近年來,由于抗生素在人類醫(yī)療和動物養(yǎng)殖中的大量使用,水體受抗生素污染的現(xiàn)象普遍[15-16]?？股卦谒w中的污染除了可能增加環(huán)境中的抗生素抗性基因外[16],在污染程度嚴重的情況下可能也存在增加水生植物對As的總累積量和改變水生植物中As形態(tài)比例的風(fēng)險。這對水生生態(tài)系統(tǒng)中As的生物地球化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生不可忽視的影響,值得進一步研究。

可培養(yǎng)的AsⅢ氧化細菌主要位于浮萍葉面,但這些細菌在單獨培養(yǎng)條件下對AsⅢ的氧化能力并不強。Zhang等[5]從被As污染的水稻土中分離到1株AsⅢ氧化菌株SY(Paracoccussp.),其能夠在24 h內(nèi)將 1 mmol·L-1AsⅢ完全氧化為AsⅤ。從浮萍葉面可培養(yǎng)細菌對AsⅢ較弱的氧化能力以及浮萍葉面細菌群落對AsⅢ的快速氧化推測,浮萍葉面可能存在不可培養(yǎng)的對AsⅢ氧化能力更強的細菌,同時浮萍葉面細菌群落對AsⅢ的氧化能力也可能由多種細菌協(xié)作完成。與浮萍培養(yǎng)試驗的結(jié)果類似,氯霉素可顯著減少具備As氧化能力的可培養(yǎng)的葉面細菌,這也證明AsⅢ氧化細菌對氯霉素的敏感性。從浮萍葉面分離到的AsⅢ氧化細菌均屬于變形菌。通過對以往的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),從不同生境中分離獲得純培養(yǎng)的大部分AsⅢ氧化細菌也屬于變形菌[5,12]。Xie等[6]研究結(jié)果表明,浮萍葉面細菌群落中變形菌的比例達97%以上。結(jié)合本研究中浮萍葉面細菌群落對AsⅢ的快速氧化能力,稻田環(huán)境中浮萍或者其他浮水植物的葉面可能是獲取AsⅢ氧化菌株的理想生境,值得進一步探索。