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    吳茱萸堿對缺氧微環(huán)境下膽囊癌細胞增殖及HIF-1α、VEGF表達的影響

    2020-07-27 16:28:56徐智劉春燕溫娟劉紹華
    中國醫(yī)藥導報 2020年17期
    關鍵詞:血管內(nèi)皮生長因子膽囊癌

    徐智 劉春燕 溫娟 劉紹華

    [摘要] 目的 探討吳茱萸堿對缺氧微環(huán)境下膽囊癌細胞(GBC-SD)增殖及缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響。 方法 以3%O2、5%CO2模擬缺氧微環(huán)境,將GBC-SD分為正常對照組、缺氧組、吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組,分別置于常氧和缺氧微環(huán)境下培養(yǎng)。MTT法檢測各組12、24、48、72、96 h細胞增殖能力;Annexin V-FITC/PI雙染流式法檢測各組細胞凋亡情況;Western blot檢測各組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達狀況。 結果 MTT結果顯示:12 h三組間細胞的光密度值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);24、48、72、96 h缺氧組細胞的光密度值低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05);24、48、72、96 h吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組細胞的光密度值低于缺氧組,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。流式細胞結果顯示:缺氧組細胞凋亡率高于正常對照組(P < 0.05);吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組的細胞凋亡率高于正常對照組和缺氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P < 0.05)。吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的蛋白表達均低于正常對照組和缺氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P < 0.05)。 結論 吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環(huán)境下GBC-SD增殖,并促進細胞凋亡,這可能與吳茱萸堿抑制腫瘤細胞內(nèi)的HIF-1α和VEGF的表達有關。

    [關鍵詞] 吳茱萸堿;膽囊癌;缺氧誘導因子1α;血管內(nèi)皮生長因子

    [中圖分類號] R735.8? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210(2020)06(b)-0030-04

    Effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells and the expression of HIF-1α and VEGF in anoxic microenvironment

    XU Zhi1? ?LIU Chunyan2? ?WEN Juan1? ?LIU Shaohua3

    1.Department of Clinical Medicine, Pingxiang Health Vocational College, Jiangxi Province, Pingxiang? ?337000, China; 2.Department of Nursing, Pingxiang Health Vocational College, Jiangxi Province, Pingxiang? ?337000, China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery, Pingxiang People′s Hospital, Jiangxi Province, Pingxiang? ?337000, China

    [Abstract] Objective To investigate the effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells (CBC-SD) and the expression of hypoxia-inducing factor 1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in GBC-SD in anoxic microenvironment. Methods Using 3%O2 and 5%CO2 to simulate anoxic microenvironment, CBC-SD cells were divided into normal control group, hypoxic group and evodotaxine (100 μg/mL) + hypoxic group, they were cultured in normal and hypoxic microenvironments. MTT assay was used to detect the proliferation of 12, 24, 48, 72 and 96 h cells in each group. Annexin V-FITC/PI double staining flow method was used to detect apoptosis in each group. HIF-1α, VEGF protein expression was detected by Western blot. Results MTT results showed that there was no statistically significant difference in the optical density values between the three groups at 12 h (P > 0.05). At 24, 48, 72 and 96 h, the optical density of the hypoxia group was lower than that of the normal control group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). At 24, 48, 72, and 96 h, the light density value of evodotaxine (100 μg/mL) + hypoxia group was lower than that of the hypoxia group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of hypoxia group was higher than that of normal control group (P < 0.05). The apoptosis rate of evodotaxine (100 μg/mL) + hypoxia group was higher than that of normal control group and hypoxia group, and the difference was statistically significant (all P < 0.05). The protein expression of the HIF-1α, VEGF in the cells of the evodotaxine (100 μg/mL) + anoxic group was lower than that of the normal control group and the hypoxic group, and the differences were statistically significant (all P < 0.05). Conclusion Evodotaxine can inhibit the proliferation of GBC-SD cells in gallbladder cancer under hypoxic microenvironment and promote apoptosis, which may be related to evodotaxine′s inhibition of HIF-1α and VEGF expression in tumor cells.

    [Key words] Evodiamine; Gallbladder carcinoma; Hypoxia-inducing factor 1α; Vascular endothelial growth factor

    膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,近年來該病的發(fā)生率和死亡率均有明顯上升趨勢[1-2]。長期以來,膽囊癌因其發(fā)病隱匿、病情進展迅速、手術切除率較低等特點,使該病在早期診斷及治療方面沒有取得有效進展,加之手術及放化療的效果不理想,患者預后不佳[3]。因此,急需尋找一種有效治療膽囊癌的方法。

    吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分,它不僅能調(diào)節(jié)免疫,同時也能抑制腫瘤增殖,促進腫瘤凋亡[4-5],但其具體的抗腫瘤分子機制仍不明確。本研究采用人膽囊癌細胞(GBC-SD)作為研究對象,探討吳茱萸堿對GBC-SD增殖的影響及相關分子機制,現(xiàn)報道如下:

    1 材料與方法

    1.1 材料與細胞培養(yǎng)

    DMEM培養(yǎng)基(Hyclone,貨號:SH30022.01);胎牛血清(GIBCO,貨號:42F7180K);Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Biolegend);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)兔抗人多克隆抗體(Abclonal,貨號:A2556);缺氧誘導因子1α(HIF-1α)鼠抗人多克隆抗體(Abcam,貨號:Ab113642),胰酶(Genview,貨號:89040101100),MTT(Genview,貨號:298-93-1)。熒光倒置顯微鏡(日本Nikon),流式細胞儀(美國BD),酶標儀(美國Thermo Labsystems),化學發(fā)光儀(上海勤翔)。GBC-SD(購于中國科學院細胞庫)置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃飽和濕度、含5%CO2的常氧孵箱中培養(yǎng);以37℃飽和濕度,含3%O2、5%CO2的條件模擬腫瘤細胞缺氧環(huán)境。

    1.2 MTT法檢測GBC-SD增殖能力

    分組:正常對照組(常氧組),缺氧組(模擬缺氧環(huán)境),吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組。取對數(shù)生長期的GBC-SD懸液,以0.8×104個/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng),放于常氧和缺氧環(huán)境下各培養(yǎng)24 h,按照分組加入?yún)擒镙菈A100 μg/mL,再繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72、96 h;棄培養(yǎng)液,每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min;選擇490 nm波長測定各孔吸光值,實驗重復3次。

    1.3 流式細胞術檢測GBC-SD的凋亡情況

    采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術進行檢測。細胞分組同MTT法,取處于對數(shù)生長期的GBC-SD懸液,以密度為3.5×104個/孔接種到6孔板中,放于常氧和缺氧環(huán)境下各培養(yǎng)24 h,按分組加入?yún)擒镙菈A100 μg/mL,再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細胞,PBS洗滌2次后加入Annexin V-PI,再加入FITC于室溫下孵育15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,實驗重復3次。

    1.4 Western blot檢測VEGF、HIF-1α蛋白表達

    實驗分組同MTT法,提取各組細胞的總蛋白,使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度檢測。分別制備濃縮膠和分離膠,加樣后進行蛋白電泳、轉膜,用含有5%脫脂牛奶封閉后,分別用一抗(稀釋倍數(shù)1∶1000)、二抗(稀釋倍數(shù)1∶1000)在室溫下孵育1 h,后在暗室內(nèi)加超敏發(fā)光液孵育5 min,放于化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像,采用Image J分析軟件進行圖像分析,實驗重復3次。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 23.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t多重檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組細胞光密度值比較

    三組GBC-SD光密度值在12 h時比較,差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與正常對照組比較,24、48、72、96 h缺氧組細胞光密度值均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P < 0.05);與缺氧組比較,吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組24、48、72、96 h的細胞光密度值均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P < 0.05)。見表1。

    2.2 各組凋亡情況比較

    三組GBC-SD的凋亡率分別:正常對照組為(6.97±0.36)%、缺氧組為(17.43±0.29)%、吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組為(26.60±0.23)%,與正常對照組比較,缺氧組GBC-SD凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組GBC-SD凋亡率高于正常對照組和缺氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P < 0.05)。見圖1。

    2.3 各組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較

    缺氧組GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達水平高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。與正常對照組比較,吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計意義(P < 0.05);與缺氧組比較,吳茱萸堿(濃度100 μg/mL)+缺氧組細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計意義(P < 0.05),吳茱萸堿能明顯抑制GBC-SD內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達。三組GBC-SD細胞的HIF-1α、VEGF蛋白表達帶及蛋白表達量。見圖2。

    3 討論

    缺氧是實體腫瘤生長過程中普遍存在的狀態(tài),HIF-1α是腫瘤細胞在缺氧應答中的重要轉錄調(diào)節(jié)因子[6]。由于缺氧的程度和時間不同,HIF-1α在缺氧組織細胞凋亡中發(fā)揮了雙重作用。一方面,隨著腫瘤體積不斷增大,其生長的微環(huán)境中氧含量出現(xiàn)降低時,腫瘤細胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解過程被抑制,導致其在腫瘤細胞內(nèi)不斷積聚,進而刺激腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下血管生成,改善腫瘤生長微環(huán)境[7-8];另一方面,HIF-1α也能促進腫瘤細胞的凋亡,在缺氧狀態(tài)下,抑制凋亡蛋白數(shù)量減少,而促進凋亡蛋白Bax及前凋亡蛋白BNIP3表達水平均增高,并與HIF-1α表達水平呈正相關;此外野生型p53與HIF-1α的氧依賴ODD相互作用促進缺氧導致的細胞凋亡[9]。

    VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的腫瘤血管生成促進因子,它也是HIF-1α的重要靶基因之一。VEGF能促進腫瘤細胞的增殖、抑制其凋亡,并且能夠誘導腫瘤細胞對放、化療產(chǎn)生耐受。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞高表達的HIF-1α不僅可與VEGF 5′-末端增強子相互作用,促進VEGF基因表達上調(diào);還可增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性,促進腫瘤細胞VEGF表達增加,從而調(diào)節(jié)腫瘤血管生成,增加腫瘤的供氧能力[10-11]。在腫瘤的血管生成和生長侵襲過程中VEGF和HIF-1α兩者起著相互協(xié)同的作用。多項研究提示,通過抑制HIF-1α的表達使VEGF的表達下調(diào),可減少腫瘤組織的血管生成,抑制腫瘤組織在缺氧微環(huán)境下的糖酵解,從而抑制腫瘤生長[12-14]。

    研究顯示,膽囊癌組織中的HIF-1α、VEGF均為高表達狀態(tài),二者的表達量不僅與膽囊癌組織中的微血管計數(shù)呈正相關,也與患者的疾病進展成明顯正相關[15-16]。細胞凋亡實驗結果提示,缺氧微環(huán)境誘導膽囊癌細胞的凋亡,推測可能是由于缺氧時間較短,HIF-1α介導的促凋亡作用強于抗凋亡作用。蛋白檢測結果顯示,無論是在常氧環(huán)境還是在缺氧微環(huán)境下,GBC-SD內(nèi)的HIF-1α和VEGF蛋白均有表達,但在缺氧的微環(huán)境下二者的表達要明顯增強。GBC-SD內(nèi)的HIF-1α在缺氧微環(huán)境的刺激下表達上調(diào),并誘導其下游靶基因VEGF的表達增強。

    吳茱萸堿是中藥吳茱萸的有效成分,具有抗腫瘤作用[17]。大量實驗結果證實,吳茱萸堿能夠抑制腫瘤細胞的生長、促進其凋亡,并能抑制腫瘤細胞的侵襲轉移[18-20]。吳茱萸堿可通過抑制HIF-1α使VEGF的表達下調(diào),導致過度增殖的腫瘤細胞無法適應缺氧微環(huán)境,達到抑制腫瘤增殖的效果[21]。此外,吳茱萸堿還可通過抑制缺氧狀態(tài)下腫瘤細胞HIF-1α的表達促進腫瘤細胞的凋亡[22-23]。本實驗結果顯示,在缺氧微環(huán)境下,吳茱萸堿能夠抑制GBC-SD的增殖,同時促進其凋亡。進一步的實驗結果提示,吳茱萸堿能夠明顯抑制GBC-SD的HIF-1α及VEGF蛋白的表達。由此,本研究認為在缺氧微環(huán)境下,通過抑制HIF-1α及其靶基因VEGF的表達可抑制GBC-SD增殖并促進其凋亡。因此,抑制腫瘤細胞HIF-1α及其靶基因VEGF的過表達,對于抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡有著十分重要的意義,這為抑制腫瘤生長帶來了新的思路。

    綜上所述,吳茱萸堿能夠抑制缺氧微環(huán)境下GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表達,使其無法適應缺氧微環(huán)境,從而抑制腫瘤細胞的生長,這為膽囊癌的治療提供了新方向。

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    (收稿日期:2019-12-16? 本文編輯:封? ?華)

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