多功能離子液體分散液液微萃取結合高效液相色譜法檢測人尿中5種鄰苯二甲酸酯代謝物

孫 倩, 戴浩強, 陳佩佩, 佘 慧, 武 佳*

(1. 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院檢驗科, 浙江 寧波 315040; 2. 溫州醫(yī)科大學, 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室, 浙江 溫州 325035)

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters, PAEs)物質是一類典型的環(huán)境激素或內分泌干擾物,可以蓄積在人體內并導致機體的突變與紊亂[1,2]。PAEs作為一類常用的塑料增塑劑,其污染物普遍存在于空氣、地表水、土壤等環(huán)境樣品中,人類可通過呼吸、食物、皮膚接觸、靜脈注射等途徑攝入該物質[1-3]。PAEs在人體內發(fā)生代謝,常見的PAEs代謝物有鄰苯二甲酸單乙酯(monoethyl ester, MEP)、鄰苯二甲酸單丁酯(mono-n-butyl phthalate, MBP)、鄰苯二甲酸單異丁酯(1-(2-methylpropyl) ester, MIBP)、鄰苯二甲酸單芐酯(1,2-benzene dicarboxylic acid, 1-(phenylmethyl) ester, MBZP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(2-ethylhexyl hydrogen phthalate, MEHP)。較多研究表明鄰苯二甲酸單酯代謝物具有更強的生物活性[4-10],例如MEHP、MIBP、MBZP與空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型相關性強。PAEs代謝物不僅能引起兒童的過敏性疾病、哮喘、濕疹、炎癥等[11],也導致青少年體內的胰島素耐受性增強[12,13],還與兒童高血壓有相關聯(lián)系[14]。它在體內的持續(xù)內暴露與老年人、婦女患糖尿病均相關[15,16]。

PAEs在人體內半衰期短,主要經歷兩個步驟:①鄰苯二甲酸酯被水解為初級代謝物——鄰苯二甲酸單酯;側鏈長的PAEs還會進一步發(fā)生羥基化和氧化反應。②鄰苯二甲酸單酯、羥基化產物和氧化產物在尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶的催化作用下生成親水的葡萄糖苷酸結合物;然后經尿液排出[5,6]。因此,將尿液中的PAEs羥基化代謝產物作為生物標志物,從而了解人群對PAEs的暴露水平及特征;同時,研究代謝產物可以很好地避免實驗室環(huán)境中無處不在的鄰苯二甲酸酯類本底值的干擾[17]。由于人們普遍暴露于鄰苯二甲酸酯這類環(huán)境激素中,因此全面地評價該物質通過呼吸、飲食、飲水、皮膚接觸等暴露途徑進入人體產生健康效應是亟須開展的工作。所以,建立精準、可靠的分析方法對監(jiān)督人類健康十分重要。

PAEs代謝物在尿液中的濃度非常低,無法用儀器直接分析,因此分析前需對樣品進行濃縮富集,主要的方法有固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)、液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、液相微萃取法(liquid-phase microextraction, LPME)和固相微萃取法(solid-phase microextraction, SPME)。分散液液微萃取法(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)是一種操作簡單、快速、富集倍數高的萃取方法[18-20],被廣泛應用于樣品預處理中。但在萃取過程中常使用揮發(fā)性的有機溶劑作為萃取劑。近年來,室溫離子液體(ionic liquid, IL)由于其具有較好的熱穩(wěn)定性、不揮發(fā)性以及對有機物強的萃取能力,同時還具有可設計性等獨特的物理化學性質,成為傳統(tǒng)揮發(fā)性有機溶劑的“綠色”替代品[18,19]。Sun等[21]構建了一種無有機溶劑的IL-DLLME技術,在這種方法中,親水性離子液體[EMIM][BF4]用作分散溶劑,以幫助萃取溶劑疏水性離子液體[C8MIM][PF6]完全分散,在萃取反應體系中未使用有機溶劑。吳翠琴等[18]建立了懸浮固化分散液液微萃取(SFO-DLLME)前處理方法檢測水體中的6種PAEs,在萃取過程中也未使用有機試劑,綠色環(huán)保,并獲得了較高的回收率?；谏鲜鲅芯勘尘?本文擬建立多功能離子液體DLLME技術,檢測人體尿液中的鄰苯二甲酸酯代謝物,并對影響萃取效率的各單因素進行優(yōu)化。最后將該方法應用于糖尿病患者尿液樣品中鄰苯二甲酸酯類化合物內暴露評價,為研究鄰苯二甲酸酯類暴露水平積累基礎數據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司); BS110S電子分析天平(德國賽多利斯公司,精密度0.1 mg); Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司); KH-100B型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、pH計(美國ThermoFisher公司)。

PAEs代謝物標準品(MEP、MBP、MIBP、MBZP、MEHP,純度>98%)購于美國AccuStand公司。離子液體(純度>99.5%): 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4MIM]PF6), 1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C6MIM]PF6), 1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸([C8MIM]PF6), 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽的離子液體([C4MIM]BF4), 1-丁基磺酸-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸鹽[BSO3HMIm][OTf]和六氟磷酸銨(NH4PF6)購自上海成捷化學有限公司。色譜級甲醇、乙腈、丙酮、甲酸、乙酸等購于上海百靈威公司;β-葡萄糖苷酸酶購于美國Sigma公司。實驗用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)純化的純凈水。

10份Ⅱ型糖尿病患者尿液樣本從醫(yī)院收集,患者均已簽署知情同意書。

1.2 標準儲備液及系列標準液的配制

分別稱取5種PAEs代謝物標準品100 mg(精確至0.01 mg),置于25 mL容量瓶中,用甲醇配制質量濃度為4.0 g/L的單標儲備液,于-40 ℃儲存。用甲醇分別稀釋成質量濃度為0.5、1、10、20、40、80、100、200、400、800、1 000 μg/L的系列標準溶液,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ】瞻啄蛞簲档确?分別加入5種PAEs代謝物標準溶液,配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、10、50、100、500和1 000 μg/L的尿基質標準溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1尿液樣品前處理方法

冷凍尿液先在4 ℃冰箱中解凍,然后放至室溫,充分振蕩后經過0.22 μm濾膜過濾。取過濾后的尿液1 mL,放入玻璃試管中,加入100 μL的β-葡萄糖苷酸酶溶液,于37 ℃的水浴中酶解60 min,在萃取前稀釋5倍?？瞻啄蛞褐苽浞椒?用1 mL H2O和1 mL甲醇分別對固相萃取小柱進行活化,然后將1 mL尿液加入柱中,收集后作為空白尿液。

1.3.2IL-DLLME實驗方法

取5 mL樣品,依次加入35 μL [C8MIM][PF6]、120 μL [C4MIM][BF6]、30 μL [BSO3HMIm][OTf]和0.1 g NH4PF6,充分振蕩,此時將形成霧狀懸濁液,保持體系溫度35 ℃,超聲分散5 min,冷卻5 min, 4 000 r/min下離心5 min,去除上清液,下層黏稠狀IL層用60 μL甲醇稀釋并充分振蕩混勻,經0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。萃取率(ER)按如下公式計算。

式中:CIL為萃取后離子液體相中PAEs代謝物的濃度;VIL為萃取后離子液體相的體積;Ca為水樣中鄰苯二甲酸酯的濃度;Va為初始水相的體積。

1.3.3色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動相A為0.1%乙酸水溶液,流動相B為0.1%乙酸乙腈溶液。梯度洗脫:0～8 min, 45%B～55%B; 8.1～17 min, 55%B; 17.1～20 min, 80%B; 20.1～25 min, 100%B。流速為1.0 mL/min,柱溫箱溫度為35 ℃,檢測波長為228 nm,進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 DLLME萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取劑種類及體積

在微萃取技術中,萃取劑的種類及體積是影響萃取效率的關鍵因素。疏水性IL因其在水中的低溶解度、對目標分析物良好的提取能力和良好的色譜行為,常被選作萃取劑。本研究中選用了3種烷基咪唑六氟磷酸鹽疏水性離子液體([C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]、[C8MIM][PF6])作為萃取劑,隨著烷基鏈長度的改變,它們的物理和化學性能(包括在水中的黏度和溶解度)對懸濁液的組成和沉積相的體積有巨大的影響[22]。按照1.3節(jié)進行實驗,每組實驗平行6次,結果(見圖1a)表明,相同陰離子的IL的萃取效率隨著碳鏈長度的增加而增加,當使用[C8MIM][PF6]作為萃取劑時效果最好,MEP、MBP、MIBP、MBZP、MEHP的回收率在89.3%～94.0%范圍內,因此選用[C8MIM][PF6]作為最佳萃取劑。

圖 1 萃取劑(a)種類和(b)體積對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effect of (a) the type and (b) the volume of extraction solvent on recoveries of PAE metabolites (n=6) MEP: monoethyl phthalate; MBP: mono-n-butyl phthalate; MIBP: mono-iso-butyl phthalate; MBZP: monobenzyl phthalate; MEHP: mono(2-ethylhexyl) phthalate. Conditions: spiked urine sample volume 5.0 mL; dispersants [BSO3HMIm][OTf] 30 μL, [C4MIM][BF6] 120 μL; NH4PF6 0.1 g; extraction at 35 ℃; ultrasonic dispersion for 5 min; cooling in ice water for 5 min; and centrifugation at 4000 r/min for 5 min. For Fig. 1a, extraction solvent volume 35 μL.

考察了不同體積(30～50 μL)的萃取劑[C8MIM][PF6]對5種PAEs代謝物回收率的影響。結果如圖1b所示,[C8MIM][PF6]的體積在30～50 μL時,隨著[C8MIM][PF6]體積的增大5種PAEs目標物的回收率先增大后減小,當體積為35 μL時回收率最大(95.3%);可能的原因是,隨著萃取劑用量的增加,體系對PAEs代謝物的萃取效率增加,但萃取劑體積過大,分散劑的體積偏小,破壞了體系的萃取平衡,減小了萃取劑與目標物的接觸面積,使得回收率降低。因此,選擇[C8MIM][PF6]的最佳體積為35 μL。

2.1.2分散劑的種類和體積

在傳統(tǒng)的微萃取技術中,甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、四氫呋喃這些有機溶劑常被用作分散劑。但是在無有機溶劑的全離子液體DLLME過程中,親水性的IL取代了有機溶劑被用作分散劑。比較了[C4MIM][BF6]、乙腈、丙酮、甲醇4種溶劑作為分散劑時的萃取效率。結果如圖2a, [C4MIM][BF6]、乙腈、丙酮3種試劑作為分散劑時,各目標物質的回收率均較高(66.7%～93.3%)。但與乙腈、丙酮等傳統(tǒng)有機試劑相比,[C4MIM][BF6]不但具有不易揮發(fā)、低毒、環(huán)保的優(yōu)點,且具有較高的萃取效率(88.7%～93.3%),因此選擇[C4MIM][BF6]作為分散劑。

同時考察了[C4MIM][BF6]的體積(60～140 μL)對PAEs代謝物回收率的影響。如圖2b所示,分散劑體積為120 μL時回收率最高(86.7%～93.7%)?？赡艿脑蚴?分散劑體積較小時,萃取劑不能均勻分散于水相與分析物充分接觸,導致回收率降低;分散劑體積較大時,分析物在水中的溶解度增大而不易被萃取。因此實驗選用[C4MIM][BF6]的最佳體積為120 μL。

圖 2 分散劑(a)種類和(b, c)體積對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of (a) the type and (b, c) the volume of dispersive solvent on recoveries of PAE metabolites (n=6) Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

實驗中同時加入親水性離子液體[BSO3HMIm][OTf]作為分散劑。[BSO3HMIm][OTf]帶有一個SO3H基團通過烷基鏈與陽離子共價連接引入作為分散溶劑。由于分析物的存在狀態(tài)與水相的pH值密切相關,且所產生的水解作用影響PAEs代謝物的萃取效率。根據文獻[21]報道, [BSO3HMIm][OTf]在水溶液中呈酸性。因此,[BSO3HMIm][OTf]具有雙重功能,不僅用作分散劑,又可用作pH調節(jié)劑,避免額外的pH值調整。分散劑的體積比直接影響萃取劑的分散度[21],固定[C4MIM][BF6]體積120 μL,考察[BSO3HMIm][OTf]的體積(10～50 μL)對微萃取體系回收率的影響,由結果(見圖2c)可知,當[BSO3HMIm][OTf]用量為30 μL,即[C4MIM][BF4]與[BSO3HMIm][OTf]的體積比為4∶1時,各物質的萃取回收率達到最大值(MEP(93.7%±2.1%)、MIBP(91.3%±3.2%)、MBP(89.3%±4.9%)、MBZP(90.0%±5.1%)、MEHP(97.3%±1.2%))。

2.1.3鹽效應

由于分析物的萃取效率受樣品基底的影響很大,根據“鹽析”原理,在萃取前向樣品溶液中加入一定量的無機鹽,如NH4PF6等,離子強度的增強有利于降低分析物在水溶液中的溶解度,從而增加其萃取效率[23]。

根據1.3節(jié)實驗方法,固定[C4MIM][BF6]體積為120 μL,向微萃取體系中加入不同量(0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 g)的NH4PF6鹽,由圖3可知,當添加0.1 g NH4PF6時,各PAEs代謝物的回收率達到最大值,但隨著添加NH4PF6質量的增加,MIBP、MBP、MBZP等物質的回收率有所降低。這可能是因為增加離子強度,會降低PAEs在水相中的溶解度,提高其在有機相中的分配系數;但當鹽濃度過大時,樣品溶液的黏度變大,目標物與鹽離子之間的靜電作用力增強,導致其傳質能力降低,從而降低了回收率。因此,本實驗選擇加入0.1 g的NH4PF6。

圖 3 萃取體系中NH4PF6的加入量對PAEs代謝物 回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effects of amount of NH4PF6 on recoveries of PAE metabolites (n=6) Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

2.1.4萃取溫度、超聲時間、冷卻時間與離心時間

萃取溫度會影響分析物的分配系數和IL在水中的溶解度[24]。溫度升高,IL的親水性增加,從而使IL在水中的溶解度增加。不同陽離子的IL,其熱分解溫度相似,但隨著陰離子親水性的增強,熱分解溫度降低。在較低的溫度范圍內,IL能夠穩(wěn)定存在,但如溫度過高,PAEs在水中的溶解度也會相應增加,此時被萃取到IL相中的PAEs會減少,降低萃取效率?？疾觳煌腿囟?25～60 ℃)對PAEs代謝物回收率的影響,結果如圖4a所示,在25～35 ℃之間,各物質回收率逐漸增加并達到最大值,但溫度高于35 ℃時,PAEs代謝物的回收率迅速下降,分析原因可能是由于體系溫度過高導致IL在水相中的溶解度增加,分析物又重新溶于水中導致萃取回收率降低。因此,選擇35 ℃為最佳萃取溫度。

圖 4 萃取條件對PAEs代謝物回收率的影響(n=6)Fig. 4 Effect of extraction conditions on the recoveries of PAE metabolites (n=6) a. extraction temperature; b. sonication time; c. cooling time; d. centrifugation time. Extraction solvent [C8MIM][PF6] 35 μL; other conditions are the same as in Fig. 1.

圖4b～d分別考察了超聲萃取和離心過程中時間對PAEs代謝物回收率的影響。結果表明:當超聲5 min時,回收率最高(見圖4b)。萃取時間被認為是從超聲處理的結束到離心分離之間的間隔[21]。由結果(見圖4c)可知冷卻時間為5 min時,各物質的回收率達到最大值。另外,如圖4d所示,離心時間5 min時,各物質的回收率達到最大值。因此,選擇體系的超聲時間為5 min,冷卻時間為5 min,離心時間為5 min。

2.2 方法性能評價

2.2.1線性范圍、檢出限與定量限

將尿基質標準溶液按1.3節(jié)萃取步驟處理并進行色譜分析后,以各PAEs代謝物的色譜峰峰面積為縱坐標,標準溶液質量濃度為橫坐標,繪制標準工作曲線。實驗結果表明:各PAEs代謝物在0.5～1 000 μg/L范圍內線性關系良好,決定系數(R2)≥0.995 5,檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOD,S/N=10)分別是0.16～0.19 μg/L和0.53～0.63 μg/L(見表1)。

表 1 尿液中5種PAEs代謝物的線性范圍、回歸方程、決定系數和檢出限

2.2.2加標回收率和精密度試驗

取空白尿液數等份,分別加入不等量的5種PAEs代謝物標準溶液,配制成低、中、高加標量分別為5、20和100 μg/L的樣品,每個濃度平行6個樣品,按照1.3節(jié)處理和分析樣品,計算回收率,結果見表2?？梢钥闯?低、中、高水平下的回收率為92.9%～105.0%,相對標準偏差(RSD)小于5.96%,有較好的準確度和精密度。

同時考察了低中高加標濃度下的各組分的日內、日間精密度,各組分的RSD均小于8%之內(其中高水平加標濃度下的RSD值)見表2,說明方法的精密度較好。

表 3 新方法和已發(fā)表方法的比較

表 2 尿樣中5種PAEs代謝物在3個加標水平下的回收率及RSDs(n=6)

圖5a為尿液樣品添加中濃度(20 μg/L)PAEs代謝物的典型色譜圖,圖5b為實際尿液樣品的色譜圖。在每次樣品分析前,均進行質量控制(使用空白溶劑及添加中濃度的尿液樣品),樣品的測定值均在真實值的±20%以內,本方法符合方法學構建的各項指標,能夠滿足痕量檢測的分析要求。

圖 5 (a)加標尿液樣品和(b)實際尿液樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of a spiked urine sample and a real urine samplea. a blank urine sample spiked with 20 μg/L of five PAE metabolites; b. a real urine sample.

2.2.3與其他方法的比較

將所建立的方法與其他已發(fā)表的方法進行比較,由表3可以看出,本文所建方法在萃取時間和操作簡便程度方面與SPE/GC-MS和SPE/LC-MS等前處理方法相比具有明顯優(yōu)勢,且檢出限低。新方法只使用了IL即可完成萃取過程,環(huán)境友好,不需要昂貴的分析儀器。

2.3 實際樣品的分析

實際樣品檢測結果(見表4)表明,5種PAEs代謝物均有不同程度的檢出。MEP僅有一份檢出,檢出量為6.05 μg/L; MIBP檢出量為18.0～51.6 μg/L; MBP檢出量為49.2～79.6 μg/L; MBZP檢出量為22.1～29.1 μg/L; MEHP檢出量為11.8～47.0 μg/L。表5為計算后的各物質和尿液肌酐含量比值以及HMDB數據庫(The human metabolome database. http:/ /www.hmdb.ca, 2013)中正常人群尿樣中PAEs代謝物的參考值。

表 4 糖尿病患者尿樣中PAEs代謝物的含量

表 5 糖尿病患者尿樣中5種物質的檢測水平及HMDB數據庫中正常人群參考范圍

3 結論

本研究將多功能離子液體與分散液液微萃取技術相結合,建立了測定尿液中5種鄰苯二甲酸酯類物質代謝產物的高靈敏度新方法。本方法在萃取過程中未使用有機有毒試劑,綠色環(huán)保、簡便快速,回收率較高,線性范圍較寬,定量限較低,重復性較好,能夠滿足痕量PAEs檢測分析要求。通過本研究,初步了解環(huán)境激素鄰苯二甲酸酯類在人體內的代謝情況及對人體產生的危害,加強了對環(huán)境保護重要性的認識。本研究的初步結果表明,中國糖尿病患者主要暴露于MBP、MIBP和MEHP。該方法準確度和精密度均較好,后期需進一步結合毒理學和流行病學來探討PAEs暴露水平對中國人群健康造成的影響,為預防PAEs危害提供科學依據。