固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水中18種酚類化合物

李 楊, 張書芬, 邢家溧*, 應(yīng) 璐, 承 海, 鄭睿行, 毛玲燕, 李和生

(1. 寧波大學食品與藥學學院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波市食品檢驗檢測研究院, 浙江 寧波 315048)

隨著焦化、煉油、冶金、煤氣等工業(yè)的高速發(fā)展,各種含酚類化合物的廢水的排放量也相應(yīng)增加。近年來,各種酚類化合物污染引起的食用安全事故也頻頻發(fā)生,例如,湖北省梁子湖“五氯酚鈉中毒”事件、江蘇省“苯酚污染水源”事件,大眾對酚類化合物已不再陌生[1]。此外,酚類化合物以其高毒性、長期蓄積性、持久性、潛在致癌性等特點受到越來越多學者的廣泛關(guān)注[2-4]。目前,在各種酚類化合物污染事件中,水體中的酚類化合物污染最為嚴重,不僅危害大,污染范圍也極廣?；诜宇惢衔锞哂袕姸拘院统志眯缘奶攸c,美國環(huán)境保護署將其列為優(yōu)先控制污染物。歐盟也規(guī)定飲用水中總酚含量不能超過0.5 μg/L和單個酚含量不能超過0.1 μg/L,同時,我國GB 8979-1996《污水綜合排放標準》規(guī)定,揮發(fā)酚最高允許排放量為1.0 mg/L; GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定揮發(fā)酚的含量不得超過0.002 mg/L;其中GB 3838-2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》中指出，五氯酚(PCP)、2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)等酚類化合物標準限值不能超過0.009、0.093和0.2 mg/L。為了保障人類免受酚類污染物對健康的危害,必須對環(huán)境中酚類化合物進行監(jiān)測和控制[5]。目前,我國水中酚類化合物測定采用HJ 744-2015《水質(zhì)酚類化合物的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》,該標準方法采用五氟芐基溴衍生,測定2-氯苯酚(2-CP)、4-氯苯酚(4-CP)、PCP、2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)、2,6-二氯苯酚(2,6-DCP)、2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)、2,4,5-三氯苯酚(2,4,5-TCP)、2,3,4,6-四氯苯酚(2,3,4,6-TeCP)、4-硝基酚(AR)、2-甲酚(2-methylphenol)、3-甲酚(2-methylphenol)、4-甲酚(4-methylphenol)、2,4-二甲酚(2,4-dimethylphenol)等14種酚類化合物,該方法的檢出限為0.1～0.2 g/L,定量限為0.4～0.8 g/L。鑒于當前對于水中所含酚類化合物的種類不清、危害不明,多種酚類化合物同時檢測的方法還不成熟,對進一步提升檢測分析效能提出了更高要求[6],因此建立水中多種酚類化合物同時高效的檢測方法,為我國水中酚類化合物殘留水平的控制、檢測標準的制定和管理措施的采取,都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

目前,水中酚類化合物的研究大多集中于單一種類(如烷基酚類、溴酚類、硝基酚類等)或多種類少量酚類化合物的檢測,如景陽等[7]利用高效液相色譜法檢測水中4種常見的酚類化合物;李曉晴[8]建立了同時檢測水中6種酚類化合物的新方法;Joaquin等[9]利用高效液相色譜法檢測廢水中5種合成的酚類抗氧化劑,Luo等[10]利用高效液相色譜法結(jié)合熒光法檢測水中12種酚類化合物,這些方法雖然前處理簡單,檢出限低,靈敏度高,但只能同時檢測少數(shù)酚類化合物。穆肅[11]建立了同時測定水質(zhì)中12種硝基酚類的分析方法,但該方法只能檢測水體中的硝基酚類化合物。而且當前酚類化合物的檢測方法大都需要衍生[12,13],但衍生操作較復(fù)雜,反應(yīng)條件苛刻,反應(yīng)的副產(chǎn)物和過量的衍生化試劑可能會干擾目標化合物的分離與檢測等?；诖?本研究擬開發(fā)一種不需要衍生,且能同時、準確檢測多種酚類化合物的分析方法。

1 實驗方法

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ 8000 Evo氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); Vortex 3自動漩渦混合器(德國IKA公司);多功能全自動氮吹濃縮儀(瑞典Biotage AB公司); Oasis PRiMEHLB 3cc固相萃取小柱、固相萃取儀(美國Waters公司); pH酸度計(瑞士Mettler Toledo公司);超純水儀(美國Millipore公司)。

酚類化合物標準品:辛基酚(OP)、雙酚A(BPA)、2-溴苯酚(2-BP)、4-溴苯酚(4-BP)、2,4-二溴苯酚(2,4-DBP)、2,6-二溴苯酚(2,4-DBP)、2,4,6-三溴苯酚(2,4,6-TBP)、2-硝基酚(2-nitrophenol)、3-硝基酚(3-nitrophenol)、4-硝基酚、4-甲基-2-硝基酚(4-methyl-2-nitrophenol)、3-甲基-4-硝基酚(3-methyl-4-nitrophenol)、6-硝基間甲酚(5-methyl-2-nitrophenol)、2-硝基-3-甲基苯酚(3-methyl-2-nitrophenol)、2,6-二甲基-4-硝基酚(2,6-dimethyl-4-nitrophenol)購自浙江寧波航景生物科技有限公司;壬基酚(NP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)和4,6-二硝基鄰甲苯酚(2-methyl-4,6-dinitrophenol)購自上海安譜實驗科技股份有限公司,以上標準品純度均大于99%;甲醇、乙酸乙酯均為色譜純,購自德國Merck公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

酚類化合物具有不同的化學性質(zhì),所以儀器對不同酚類化合物的靈敏度也不同,為了方便后續(xù)研究,特將酚類化合物分為第一類酚類物質(zhì)和第二類酚類物質(zhì)。第一類酚類物質(zhì)包括壬基酚、雙酚A、2-溴苯酚、4-溴苯酚、2,4-二溴苯酚、2,6-二溴苯酚、2,4,6-三溴苯酚、2-硝基酚、3-硝基酚、4-甲基-2-硝基酚、6-硝基間甲酚、2-硝基-3-甲基苯酚和2,6-二甲基-4-硝基酚;第二類酚類物質(zhì)包括辛基酚、4-硝基酚、2,4-二硝基苯酚、3-甲基-4-硝基酚和4,6-二硝基鄰甲苯酚。

1.2 標準溶液的配制

以甲醇為溶劑,將18種酚類化合物標準品配制成1 g/L的標準儲備液,然后用甲醇將1 g/L標準儲備液稀釋成100 mg/L的標準中間液,于-10 ℃條件下保存,備用。

按1∶10的體積比吸取標準中間液,用甲醇稀釋配制成第一類酚類物質(zhì)、第二類酚類物質(zhì)的混合標準溶液,質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/L和10 mg/L;用甲醇逐級稀釋,得第一類酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度為0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/L,第二類酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度為5.00、10.00、50.00、100.00、200.00 μg/L的混合標準使用液。

1.3 水樣的制備

取100 mL超純水,在水中加入酚類混合標準溶液,攪拌均勻后加入適量1 mol/L鹽酸,使水樣的pH值至3左右,攪拌均勻后,待用。

1.4 酚類化合物的富集

先用6 mL甲醇和6 mL超純水活化固相萃取小柱,然后將1.3節(jié)制備的待測水樣加入小柱中,調(diào)整固相萃取儀,確保水樣以1 mL/min的速度流過柱子,在富集過程中要始終保持柱床上至少有1 cm水樣,上樣結(jié)束后繼續(xù)負壓抽濾15 min左右,最后加入10 mL乙酸乙酯,浸泡2 min后,依靠重力洗脫,收集洗脫液至試管中,氮吹至0.8 mL左右,用乙酸乙酯定容至1 mL,過有機膜,待測。

1.5 分析條件

色譜柱:TG-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Thermo Fisher Scientific公司);不分流進樣,進樣口溫度:260 ℃;載氣:高純氦(純度≥99%);流速1.2 mL/min。程序升溫條件:初始柱溫70 ℃,維持1 min,然后以8 ℃/min升至160 ℃,再以3 ℃/min升至200 ℃,最后以40 ℃/min升至300 ℃,保持3 min,進樣量1 μL。

離子源:電子轟擊(EI)離子源;離子源溫度:240 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;電子能量:70 eV;溶劑延遲:10 min;選擇離子監(jiān)測(SIM)模式。18種酚類化合物的監(jiān)測離子詳見表1。

表 1 18種酚類化合物的保留時間、定量離子、定性離子及其pKa值

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

酚類化合物是芳烴含羥基衍生物,是指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代所生成的化合物,其會在水里發(fā)生一定程度的電離,致使溶液呈弱酸性,與此同時,酚類化合物的水溶液在水中易形成氫鍵,且其極性相對較弱[14]。因此,實驗選擇了分析中性或弱酸性化合物的TG-5MS弱極性毛細管柱。除此之外,為減少酚類化合物與柱子上活性點位的接觸,提高儀器靈敏度,實驗使用超高惰性襯管。結(jié)果顯示,各種酚類化合物分離效果明顯,峰形較好(見圖1)。

圖 1 18種酚類化合物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 18 phenolic compounds 1. 2-BP; 2. 2-nitrophenol; 3. 3-methyl-2-nitrophenol; 4. 4-methyl-2-nitrophenol; 5. 5-methyl-2-nitrophenol; 6. 4-BP; 7. 2,4-DBP; 8. 2,6-DBP; 9. 3-nitrophenol; 10. DNP; 11. AR; 12. OP; 13. 3-methyl-4-nitrophenol; 14. 2-methyl-4,6-dinitrophenol; 15. 2,6-dimethyl-4-nitrophenol; 16. 2,4,6-TBP; 17. NP; 18. BPA.

圖 2 不同洗脫液對18種酚類化合物回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of different eluents on the recoveries of the 18 phenolic compounds (n=3)

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗對18種酚類化合物進行全掃描,通過譜庫對比，大致確定酚類化合物的保留時間,并通過掃描各個酚類化合物的標準溶液,確定其精確的保留時間,隨后找出響應(yīng)最高的離子,確定其為定量離子,響應(yīng)較大的2～3個為定性離子,最后建立SIM模式檢測方法。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1水樣初始pH值的選擇

水溶液的pH值會決定酚類化合物的存在狀態(tài),當pHpKa時,酚類化合物以離子狀態(tài)存在,因此,當溶液的pH調(diào)節(jié)至酚類化合物的pKa(見表1)附近,固相萃取效果最佳[15]。由于酚類化合物含有羥基,其溶液在水中會發(fā)生不同程度的解離,導(dǎo)致水溶液帶有一定的酸性[16]。實驗采用10 mL乙酸乙酯洗脫,控制速率為1 mL/min,探究不同初始pH值對酚類化合物的萃取效果。結(jié)果顯示,當溶液pH值控制在中性或堿性條件下,酚類化合物的平均最高回收率僅為53.3%,當pH值為3時,酚類化合物平均回收率可達93.6%,由此可見,水樣的初始pH控制在3左右時,萃取效果最佳。

2.2.2洗脫液種類的選擇

當前,已報道的酚類化合物洗脫溶劑有二氯甲烷[11,17,18]、正己烷[19,20]、甲醇[21,22]、乙酸乙酯[23,24]等,由于此實驗涉及酚類化合物種類較多,為保證化合物完全被洗脫下來,分別選取10 mL二氯甲烷、正己烷、甲醇和乙酸乙酯作為洗脫液,對載樣后的柱子進行洗脫,控制洗脫速率1 mL/min,以考察不同洗脫液對酚類化合物回收率的影響,(見圖2)。結(jié)果表明,正己烷對酚類化合物洗脫效果最差,這可能是因為正己烷的介電常數(shù)最小[25],從而導(dǎo)致洗脫效果最差,回收率最低至26.9%;甲醇、二氯甲烷洗脫效果較好,回收率明顯提高,其中甲醇洗脫效果優(yōu)于二氯甲烷,這是因為酚類化合物具有強極性基團,故極性較大的甲醇溶劑對酚類化合物具有較強的溶解性[26]。乙酸乙酯相較于其他3種洗脫液洗脫效果最好,回收率最高可達116.3%,這與余穎[27]的研究結(jié)果一致。

2.2.3洗脫液體積的選擇

在乙酸乙酯為洗脫液、洗脫速率1 mL/min、初始pH值為3的條件下,實驗分別考察了不同體積(7、8、9、10、11、12 mL)的洗脫液對酚類化合物萃取效果的影響。結(jié)果顯示,隨著洗脫體積的增加,酚類化合物的回收率逐漸升高。當體積大于10 mL時酚類化合物的回收率無明顯變化。由此可見,10 mL的洗脫液足以將固相萃取柱上的酚類化合物洗脫下來。洗脫液體積大于10 mL,不僅會造成試劑的浪費,同時也會增加氮吹的時間,從而影響萃取效果。因此,洗脫試劑的體積最終確定為10 mL。

2.3 方法學評價

2.3.1線性范圍與方法檢出限

以甲醇為溶劑,配制18種酚類化合物系列混合標準溶液,直接進樣分析。以酚類化合物的濃度為橫坐標(x, μg/L)、峰面積為縱坐標(y),繪制校準曲線。結(jié)果表明,第一類酚類物質(zhì)的線性范圍為0.5～20 μg/L;第二類酚類物質(zhì)的線性范圍為5.0～200 μg/L。選取100 mL超純水為空白試樣進行加標,使得第一類和第二類酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為0.5 μg/L和5.0 μg/L,對水樣進行重復(fù)測定,以3倍信噪比結(jié)合濃度外推法確定方法檢出限,具體結(jié)果見表2。

2.3.2回收率和精密度

選用100 mL超純水為空白樣品,加入酚類標準品,使得水樣中第一類酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1、5、10和20 μg/L;第二類酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10、50、100和200 μg/L,然后按樣品操作方法進行測定,考察其回收率,每個水平平行測定6次。結(jié)果顯示,18種酚類化合物的回收率為51.7%～117.3%,相對標準偏差(RSD)為3.1%～7.4%,具體結(jié)果見表3。

表 2 18種酚類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和方法檢出限

表 3 18種酚類化合物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.3.3實際水樣的測定

應(yīng)用上述所建立的分析方法,分別檢測了本市河流湖泊水、生活用水(某市居民日常生活所需用水,包括飲用、洗滌、沖廁、洗澡等)、生產(chǎn)用水(某市果品公司和食品加工廠生產(chǎn)車間用水)3大類6種不同的水質(zhì)。

檢測結(jié)果顯示,除4-硝基酚、3-甲基-4-硝基酚、4,6-二硝基鄰甲苯酚外,其他酚類化合物均有不同程度的檢出,其中雙酚A、2,4,6-三溴苯酚、2-硝基-3-甲基苯酚含量均較高,含量最高可達49.4 μg/L(見表4)。河流湖泊水中酚類化合物所含種類最多,含量最高,生活用水酚類化合物含量低,符合國家標準GB 8537-2008《飲用天然礦泉水》中揮發(fā)酚的限量小于0.002 mg/L的要求。

表 4 實際水樣中18種酚類化合物的含量(n=3)

3 結(jié)論

本文采用了固相萃取技術(shù)富集水中多種酚類化合物,并結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,建立了一種高效且能同時檢測水中18種酚類化合物的檢測方法。實驗優(yōu)化了前處理方法,樣品不需要衍生等繁瑣的步驟,簡單、靈敏,除此之外,該方法的檢出限、線性關(guān)系、回收率和精密度等方法學指標均能滿足水中酚類化合物的測定,還滿足同時檢測多種類、多組分的酚類化合物。