柱前衍生-高效液相色譜法同時測定血清中氨基酸類及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

白 潔, 王 妲, 劉澤平, 張佳琪, 劉麗艷, 韓艷梅*

(1. 河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 河北 保定 071000; 2. 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)綜合實驗中心, 河北 保定 071000)

神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitter)是體內(nèi)負責(zé)在神經(jīng)元與其他細胞類型間傳遞或調(diào)控特定信號的化學(xué)分子[1]。神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織和體液中,參與了大部分機體內(nèi)重要的生理機能運轉(zhuǎn)[2],神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化與許多精神和生理疾病有關(guān),例如阿爾茨海默癥[3]、癲癇[4]、精神分裂癥[5]、缺血性腦損傷[6]等,因此其痕量測定對神經(jīng)生理學(xué)[7]、運動生理學(xué)[8]、病理學(xué)[9]、臨床醫(yī)學(xué)及疾病診斷[10]等具有重要意義。

在生物樣品中,神經(jīng)遞質(zhì)的含量較低,而且基質(zhì)復(fù)雜,內(nèi)源性成分干擾較大,因此對神經(jīng)遞質(zhì)的準(zhǔn)確分析檢測存在很大困難。目前,測定生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的方法主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18]、高效毛細管電泳法[19]、電化學(xué)分析法[20],拉曼光譜法[21]等。神經(jīng)遞質(zhì)種類眾多,包括氨基酸類、單胺類、膽堿類和肽類等。神經(jīng)遞質(zhì)在生物體內(nèi)發(fā)揮功能通常是多種神經(jīng)遞質(zhì)聯(lián)合作用的結(jié)果。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是調(diào)節(jié)神經(jīng)生理功能的重要物質(zhì),人們探討精神類疾病[22]、缺血性腦損傷[23]等多種疾病的發(fā)病機制,以及衡量藥物的治療效果時,常常需要同時測定這兩類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。由于這兩類神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異,理化性質(zhì)不同,因此現(xiàn)有的方法仍大多為單獨測定某一類神經(jīng)遞質(zhì),如單獨測定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)[24]或者單獨測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[12]。檢測氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的方法多為高效液相色譜法,由于氨基酸分子結(jié)構(gòu)較小,且大多沒有光學(xué)性質(zhì),因此一般先將其衍生化,再利用色譜進行定性定量分析。常用的衍生試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)、苯異硫氰酸酯(phenyl isothiocyanate, PITC)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)、芴甲氧羰酰氯(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC-Cl)、丹酰氯(dansyl chloride, Dansyl-Cl)等[25]。PITC衍生法衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定,在一定條件下可保存較長時間,但PITC含有較大毒性與揮發(fā)性,具有一定危險性;DNFB衍生法衍生物單一、穩(wěn)定,但在衍生過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物,干擾檢測結(jié)果;FMOC-Cl衍生法所得衍生產(chǎn)物穩(wěn)定,且色譜分離速度較快,分辨率較好,不被樣品基質(zhì)所影響,但試劑自身會水解,且水解產(chǎn)物有熒光性,檢測時易受到干擾;Dansyl-Cl衍生法衍生試劑與氨基酸反應(yīng)活性差,速度慢,重復(fù)性差,衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定,需衍生后立即分析;OPA衍生法樣品制備簡易,靈敏度高,便于實現(xiàn)自動化。目前同時測定氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法較少,主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17,26,27],此法靈敏度高,分離度好,定量準(zhǔn)確,但是需要昂貴的檢測儀器。

因此非常有必要建立一種簡單、快速,能同時測定氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法。OPA能與氨基發(fā)生衍生化反應(yīng),而氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)一般都含有氨基,因此讓氨基酸和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與OPA發(fā)生衍生化反應(yīng)后,再通過液相色譜進行梯度洗脫,在相同色譜條件下同時測定是可行的?；诖?本實驗利用OPA柱前衍生-高效液相色譜法,建立了一種同時測定氨基酸類和單胺類共5種神經(jīng)遞質(zhì)的快速定量方法。本方法操作簡單,靈敏度高,方法學(xué)指標(biāo)好,有望用于血清中氨基酸類及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的同時檢測。這可為相關(guān)疾病的診斷、致病機制的研究提供參考信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20 ATVP,配有SPD-20A檢測器)、十萬分之一電子天平(AUW120D)(島津公司,日本);酸度計(DELTA-320型,梅特勒-托利多,瑞士);離心機(TGL-16G,上海安亭科學(xué)儀器廠,中國);氮氣吹干儀(上海旌派儀器有限公司,中國);超純水系統(tǒng)(Milli-Q, Millipore公司,美國)。

?；撬?taurine, Tau)、谷氨酸(glutamic acid, Glu)、甘氨酸(glycine, Gly)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,γ-GABA)、鹽酸多巴胺(dopamine, DA)(純度>99.0%)和山羊血清(批號:E815FC0252)(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國); OPA(純度>98.0%,艾覽(上海)化工科技有限公司,中國);甲醇、乙腈(色譜純,天津市康科德科技有限公司,中國)。其余試劑均為分析純;實驗用水均為二次去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精確稱取5種神經(jīng)遞質(zhì),分別用水溶解,定容至10 mL容量瓶中,制成濃度為0.05 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?使用時移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水逐級稀釋至所需濃度。

衍生試劑:取0.013 4 g OPA,加入1 mL無水乙醇、20 μL 2-巰基乙醇、4 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉(取硼酸0.154 6 g硼酸，置于10 mL容量瓶中,加入0.5 mL 5 mol/L氫氧化鈉,用二次去離子水定容),密封后低溫避光保存。

1.3 樣品前處理

將血清樣品與乙醇以1∶2(v/v)的比例混勻,渦旋30 s,冰浴10 min,離心50 min(15 000 r/min, 4 ℃),取其上清液,氮吹至近干。前處理后的樣品與衍生試劑OPA進行柱前衍生,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,得到濾液后上機進樣。

1.4 色譜條件

色譜柱:Luna 5u C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:(A)檸檬酸-乙酸鈉緩沖溶液(包括50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L乙酸鈉和0.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉,pH 3.73)和(B)乙腈;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:338 nm。梯度洗脫程序見表1。

表 1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及衍生化條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖體系的種類

實驗分別考察了檸檬酸-乙酸鈉與磷酸二氫鉀-磷酸這兩種緩沖體系對分離效果的影響。結(jié)果表明,以磷酸二氫鉀-磷酸為緩沖體系時,目標(biāo)物峰形較差且未完全分離,無法滿足定性及定量需求;以檸檬酸-乙酸鈉為緩沖體系時目標(biāo)物峰形對稱、尖銳,分離效果更好,且5種神經(jīng)遞質(zhì)均達到基線分離。

2.1.2緩沖體系的pH值

實驗考察了緩沖體系pH值(3.00～5.00)對體系分離度及靈敏度的影響。結(jié)果表明,當(dāng)pH值為3.00時,樣品分離度較差,靈敏度較低,隨著pH的逐漸升高,靈敏度也逐漸增高;當(dāng)pH值升至3.73時,衍生產(chǎn)物的靈敏度較高且分離度較好;當(dāng)pH值大于3.73時,樣品中目標(biāo)物未完全分開,分離度較差。因此選擇3.73為緩沖體系最適pH值。

2.1.3緩沖溶液的用量

實驗考察了緩沖體系中檸檬酸和乙酸鈉的濃度(10～70 mmol/L)對混合神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品體系分離效果的影響。當(dāng)緩沖體系中檸檬酸和乙酸鈉的濃度較低,為10 mmol/L時,靈敏度較低;濃度較高時,由于鹽濃度增大,會導(dǎo)致柱壓升高;濃度為50 mmol/L時,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品體系靈敏度均最高,且分離度較好。因此緩沖溶液檸檬酸和乙酸鈉的最佳濃度為50 mmol/L。

為絡(luò)合水及動物組織中的微量金屬離子,在流動相中加入了少量乙二胺四乙酸二鈉(0.5 mmol/L)[12]。

2.1.4梯度洗脫程序的優(yōu)化

實驗首先進行了等度洗脫試驗,流動相A同1.4節(jié)，流動相B中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為40%。結(jié)果顯示,雖然各組分分離度較好,但保留時間較長,尤其是γ-GABA和DA,且色譜峰展寬嚴(yán)重,靈敏度較低。因此采用梯度洗脫程序優(yōu)化分離效果。

流動相條件同1.4節(jié)描述，優(yōu)化的梯度洗脫程序由3個子梯度程序組成:

(1)洗脫Tau、Glu和Gly 3種弱保留組分,時間為0～6.50 min。在此時間段,考察了流動相中有機相乙腈的體積分?jǐn)?shù)(20%、25%、30%、32%、35%、40%、45%、55%和60%)對3種弱保留組分分離效果的影響。結(jié)果顯示,有機相加入比例過小,柱壓升高且分離時間過長;有機相加入比例為32%時,3種組分分離效果最佳;有機相比例過大,樣品峰未完全分離。因此在0～6.50 min期間,有機相的體積分?jǐn)?shù)設(shè)為32%。

(2)γ-GABA和DA的分離時間為6.51～21.00 min。在此時間段,考察了流動相中有機相乙腈的體積分?jǐn)?shù)(40%、45%、55%、60%、65%、70%和75%)對γ-GABA和DA 2種組分分離效果的影響。結(jié)果顯示,有機相比例過小,柱壓升高且分離時間過長;有機相加入比例為65%時,2種組分分離效果最佳;有機相比例過大(70%和75%),與有機相為65%的體系無顯著性差異。因此在6.51～20.00 min期間,有機相的體積分?jǐn)?shù)設(shè)為65%。

(3)系統(tǒng)平衡程序(21.01～35.00 min)。待目標(biāo)物完全洗脫后,以初始洗脫條件對系統(tǒng)進行平衡。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種神經(jīng)遞質(zhì)在優(yōu)化的梯度洗脫條件下實現(xiàn)了分離,且γ-GABA和DA的保留時間縮短,峰形尖銳。

2.1.5神經(jīng)遞質(zhì)與衍生試劑比例的優(yōu)化

分別考察了混合神經(jīng)遞質(zhì)與衍生試劑OPA的物質(zhì)的量之比(10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果如圖1所示,當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與OPA的物質(zhì)的量之比過低時,神經(jīng)遞質(zhì)峰面積過低,可能是因為衍生試劑不足,與神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)不完全;隨著衍生試劑比例的增大,各目標(biāo)物的峰面積逐漸增大,當(dāng)兩者物質(zhì)的量之比為1∶10時,神經(jīng)遞質(zhì)達到基線分離,峰面積較高;繼續(xù)增大OPA的比例,雖然有些神經(jīng)遞質(zhì)峰面積稍有增長,但無顯著性增加,同時色譜圖基線也略有增高,且與單獨測定OPA衍生試劑時基本吻合,判斷為衍生試劑過量。因此選擇神經(jīng)遞質(zhì)與衍生試劑中OPA的物質(zhì)的量之比為1∶10。

圖 1 神經(jīng)遞質(zhì)與OPA物質(zhì)的量之比對神經(jīng)遞質(zhì)峰面積的影響(n=3)Fig. 1 Effect of the amount of substance ratio of neurotransmitters to o-phthalaldehyde (OPA) on the peak area of neurotransmitters (n=3)Tau: taurine; Glu: glutamic acid; Gly: glycine; γ-GABA: γ-aminobutyric acid; DA: dopamine.

圖 3 樣品與乙醇的體積比對神經(jīng)遞質(zhì)峰面積的影響(n=3)Fig. 3 Effect of volume ratio of the sample to ethanol on the peak area of neurotransmitters (n=3)

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1蛋白質(zhì)沉淀劑的選擇

本實驗分別考察了乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇對血清樣品中蛋白質(zhì)沉淀的效果。結(jié)果如圖2所示,以乙醇為蛋白質(zhì)沉淀劑時,各神經(jīng)遞質(zhì)的峰面積最高,而且分離效果較好;甲醇、乙腈、丙酮與乙醇相比各目標(biāo)物的峰面積稍低;以異丙醇為沉淀劑時,基線未完全分離且峰形雜亂。因此選取乙醇為蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.2.2蛋白質(zhì)沉淀劑的用量

本實驗考察樣品與乙醇的體積比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)對樣品蛋白質(zhì)沉淀效果的影響。結(jié)果如圖3所示,樣品與乙醇體積比為1∶1時,各目標(biāo)物的峰面積均較低;當(dāng)增大乙醇體積時,樣品中各目標(biāo)物的峰面積變化不大,表明樣品與乙醇體積對樣品沉淀影響不大,且各比例分離效果沒有太大差別。因后續(xù)實驗步驟涉及氮氣吹干,結(jié)合考慮經(jīng)濟與時間成本,故選擇樣品與乙醇體積比為1∶2。

表 2 5種神經(jīng)遞質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專屬性

精密量取一份5種神經(jīng)遞質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;再分別取2份相同體積的樣品,一份作為對照,另一份加入5種神經(jīng)遞質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別按1.3節(jié)方法處理后進行分析,色譜圖見圖4。由圖4a可以看出,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種目標(biāo)物分離度良好,與血清樣品(見圖4b)相比,加標(biāo)樣品(見圖4c)中各目標(biāo)物的色譜響應(yīng)均加強,并能與其他吸收峰相互分離,說明本實驗方法具有較好的專屬性。

圖 4 5種神經(jīng)遞質(zhì)衍生后的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the five neurotransmitters after derivatization a. standard solution; b. real sample; c. spiked sample.

平行取6份樣品,按照1.3節(jié)的方法處理后進行分析,各色譜峰的保留時間變動均小于0.02 min,峰面積的RSD為1.84%～5.26%。說明本方法的重復(fù)性較好。

2.3.2線性關(guān)系和檢出限

配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3節(jié)方法衍生后再按照1.4節(jié)方法進行色譜分析,以進樣濃度(X, μmol/L)對峰面積(Y)作圖,分別繪制5種神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)。各神經(jīng)遞質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)和LOD見表2。5種神經(jīng)遞質(zhì)在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.986 6～0.996 6,檢出限為0.10～0.40 μmol/L。

2.3.3回收率和精密度

分別取9份已知濃度的5種神經(jīng)遞質(zhì)樣品。每3份分別加入高、中、低3種濃度的神經(jīng)遞質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3節(jié)方法進行衍生,然后進行色譜分 析(見表3)。結(jié)果表明，實際樣品中5種神經(jīng)遞質(zhì)的加標(biāo)回收率為87.57%～115.31%, RSD為0.49%～7.80%。

表 3 (續(xù))

選取一份樣品,衍生過濾后,重復(fù)進樣6針,各色譜峰保留時間的波動均小于0.02 min,峰面積的RSD為1.00%～5.60%。

2.4 實際樣品的測定

本實驗所用實際樣品為市售山羊血清,采用已優(yōu)化的樣品處理方法對血清進行處理,并對其進行分析檢測。各神經(jīng)遞質(zhì)的含量分別為Tau 58.58 μmol/L、Glu 66.32 μmol/L、Gly 228.98 μmol/L、γ-GABA 3.42 μmol/L, DA未檢出。

3 結(jié)論

本實驗基于OPA柱前衍生-高效液相色譜法,建立了同時測定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Tau、Glu、Gly、γ-GABA以及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA含量的方法。該方法操作簡便,精密度、線性關(guān)系和回收率等方法學(xué)指標(biāo)好，可為相關(guān)疾病的監(jiān)測及科學(xué)研究提供參考。雖然本方法可以同時檢出5種神經(jīng)遞質(zhì),但由于DA在血清中含量較低,本實驗對于DA的檢出限未達到血清中DA檢測的要求,因此進一步提高方法的靈敏度將是下一步的研究重點。