古菌脂質(zhì)的前處理方法比較及超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析

王小雪, 何祉安, 李 欣, 宋慶浩, 鄒欣薇,4, 宋雪瑤,4, 馮 蕾*

(1. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240; 2. 上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心, 上海 200240; 3. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240; 4. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240)

古菌是一類兼具真菌及細(xì)菌細(xì)胞特征的單細(xì)胞微生物,大多生活在高鹽、極酸、極熱、厭氧等極端環(huán)境下[1]。有研究[2]表明,古菌的膜結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)代謝通路具有特異性,使其可在極端環(huán)境下進(jìn)行正常的代謝活動(dòng)。超嗜熱嗜壓古菌的單不飽和脂肪酸含量顯著高于其他微生物[2];細(xì)胞膜中的磷脂分子與脂肪酸鏈的鍵合方式并非酯鍵而是通過醚鍵相連[3],特殊的結(jié)構(gòu)可能與該類古菌細(xì)胞膜耐壓有關(guān)。此外,古菌中有甘油二烷基甘油四醚(GDGT)等特殊脂質(zhì),GDGT作為重要的分子化石,對(duì)生態(tài)學(xué)和海洋學(xué)的研究具有重要意義[4]。近年來,對(duì)古菌的脂質(zhì)研究大多集中在對(duì)這些特殊脂質(zhì)的分析上,而對(duì)古菌總脂質(zhì)的分析卻鮮有報(bào)道。作為古菌脂質(zhì)的重要組成部分,對(duì)古菌中的非特殊脂質(zhì)(常規(guī)脂質(zhì))含量及相關(guān)代謝通路進(jìn)行探索,不僅可以全面了解古菌脂質(zhì)成分,還可以深入地研究古菌非特殊脂質(zhì)及特殊脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系,并發(fā)現(xiàn)可能的轉(zhuǎn)化通路,從脂代謝的角度探究古菌適應(yīng)極端生長(zhǎng)環(huán)境的機(jī)理。因此,研究古菌脂質(zhì)的成分和含量對(duì)闡明古菌脂代謝和古菌特殊的生理特性具有重大的科學(xué)意義[5]。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因靈敏度高、樣品損耗小、前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)范圍廣,在非靶向脂質(zhì)組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用[6-8]。在分析過程中,樣本前處理是脂質(zhì)組學(xué)分析的第一步,對(duì)脂質(zhì)的檢測(cè)范圍、鑒定準(zhǔn)確性及重復(fù)性均有顯著影響[9,10]。近年來,有許多優(yōu)秀綜述對(duì)常見的脂質(zhì)提取方法進(jìn)行了詳細(xì)歸納和總結(jié)[11]。其中應(yīng)用最為廣泛的為液液提取法和固相提取法。液液提取法因經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用,其中最為常見的有Folch法、Bligh-Dyer加酸法和甲基叔丁基醚(methyltert-butyl ether, MTBE)法[12-14]。

Folch法是指用氯仿和甲醇作提取劑(體積比2∶1),并用水萃取除雜的脂質(zhì)提取法[15]。該方法可高效提取大部分脂質(zhì),在脂質(zhì)提取方法中被稱為脂質(zhì)提取的金標(biāo)準(zhǔn);然而該方法對(duì)強(qiáng)極性磷脂的提取效果較差[16,17]。

Bligh-Dyer加酸法在Folch法的基礎(chǔ)上,調(diào)整氯仿和甲醇的體積比為1∶2,并在水相中加入了鹽酸,提高了酸性磷脂等極性脂質(zhì)的提取效率,也是在古菌的脂質(zhì)提取中最廣泛采用的方法。然而該方法步驟復(fù)雜、提取時(shí)間較長(zhǎng),導(dǎo)致提取重復(fù)性較差[10]。

MTBE法使用甲基叔丁基醚(MTBE)為提取劑,由于MTBE密度小,脂質(zhì)提取層為上層,易于收集提取液,因此提高了方法的重復(fù)性。但該法對(duì)極性較大的磷脂的提取效果欠佳[18]。

最近,隨著固相萃取(solid phase extraction, SPE)法的不斷開發(fā),它也越來越多地應(yīng)用于提取脂質(zhì)。不同于液液提取法,SPE法可以通過選擇不同規(guī)格和性質(zhì)的填料,特異性地吸附目標(biāo)脂質(zhì),針對(duì)性強(qiáng),兼具富集和除雜的作用[19]。隨著96孔板式SPE分離材料的商品化,還可滿足高通量的需求,特別適用于組學(xué)及大樣本分析[20]。目前SPE處理細(xì)胞脂質(zhì)的應(yīng)用主要集中于對(duì)低豐度脂質(zhì)或特定脂質(zhì)的富集和除雜[21,22]。但隨著SPE技術(shù)的不斷發(fā)展,已有文獻(xiàn)[23]報(bào)道,利用沃特世商品化的96孔板式Ostro SPE去磷脂板提取血漿樣品的總脂。

表1總結(jié)了常見的微生物脂質(zhì)提取方法的應(yīng)用范圍。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)脂質(zhì)提取方法的研究大多專注于血漿樣本[24],尚未有報(bào)道詳細(xì)比較并評(píng)價(jià)每種方法在微生物全脂質(zhì)提取中的差異,而針對(duì)喜好極端環(huán)境的古菌脂質(zhì)提取方法的研究,更未有報(bào)道。因此,本文以嗜熱嗜壓古菌Pyrococcusyayanosii為模式生物,利用單因素方差分析、提取效率比較、重復(fù)性比較和提取歧視性分析等方法,對(duì)Bligh-Dyer加酸法、Folch法、MTBE法及SPE脂質(zhì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)技術(shù),為古菌和其他極端微生物的脂質(zhì)研究和檢測(cè)分析提供方法依據(jù)。

表 1 已報(bào)道的微生物脂質(zhì)提取方法

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

甲醇(LCMS級(jí))、乙腈(LCMS級(jí))、異丙醇(LCMS級(jí))試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;氯仿(色譜級(jí))、二氯甲烷(色譜純)、三氯乙酸(色譜級(jí))、甲基叔丁基醚(色譜級(jí))購(gòu)自德國(guó)CNW科技有限公司;Ostro SPE去磷脂板購(gòu)自美國(guó)沃特世科技有限公司。

Hermle Z383K型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hermle儀器科技有限公司); KQ-500B型超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司); JXFSTPRP-Ⅱ液氮冷凍研磨機(jī)(上海凈信科技有限公司); RVT4104-230離心濃縮儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司); Vanquish UHPLC-QE plus液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司); BEH C18色譜柱(30 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)沃特世科技有限公司)。

1.2 菌株培養(yǎng)與收集

根據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道,利用TRM培養(yǎng)基培養(yǎng)超嗜熱嗜壓古菌P.yayanosii,厭氧高溫(95 ℃)條件下培養(yǎng)12 h,古菌達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)終止培養(yǎng)。

將50 mL菌液倒入離心管并立即置于液氮中淬滅。淬滅后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min,棄上清,收獲菌體。加入3%的氯化鈉等滲溶液清洗殘留的培養(yǎng)基,反復(fù)3次。

1.3 脂質(zhì)提取

1.3.1Bligh-Dyer加酸法

加入Bligh-Dyer加酸法提取試劑(甲醇-二氯甲烷-5%三氯乙酸,2∶1∶1, v/v/v)2 mL后,再加入等體積的研磨珠,振蕩研磨2 min破碎菌體。室溫孵育30 min后加入二氯甲烷和5%三氯乙酸,使甲醇-二氯甲烷-5%三氯乙酸最終的體積比達(dá)1∶1∶0.8。渦旋后再次室溫孵育30 min,離心取下層有機(jī)相。上述提取過程重復(fù)3次并合并有機(jī)相。

向有機(jī)相中加入超純水2 mL,渦旋離心后取下層有機(jī)相,反復(fù)3次,除去殘留的鹽和酸,離心濃縮干后置于-80 ℃保存,待復(fù)溶上機(jī)。

1.3.2Folch法

向菌體中加入Folch法提取試劑(甲醇-氯仿,1∶2, v/v)10 mL后,加入與菌量相等的研磨珠,振蕩研磨2min后,室溫超聲孵育1 h。渦旋離心后取下層有機(jī)相,反復(fù)提取3次后合并有機(jī)相。

加入2 mL的超純水至提取液中,使提取液分層,渦旋離心后去下層有機(jī)相。反復(fù)萃取3次后,合并有機(jī)相。離心濃縮干后置于-80 ℃保存,待復(fù)溶上機(jī)。

1.3.3MTBE法

向菌體中加入MTBE法提取試劑(甲醇-MTBE, 3∶5, v/v)5 mL,加入研磨珠,振蕩研磨2 min,室溫孵育1 h后,加入超純水1.25 mL,溶液分層。渦旋離心后取上層有機(jī)相。反復(fù)提取3次后合并有機(jī)相,離心濃縮后置于-80 ℃保存,待復(fù)溶上機(jī)。

1.3.4固相萃取法

向菌體中加入2 mL乙醇溶液,加入研磨珠,振蕩研磨2 min后室溫孵育20 min,渦旋離心取上清。將Ostro SPE去磷脂板用300 μL甲醇活化后加入提取液,使用正壓裝置收集穿出液并棄去。加入SPE洗脫劑(氯仿-甲醇-三乙胺,4.5∶4.5∶1, v/v/v)2 mL洗脫SPE柱,并收集穿出液,離心濃縮后置于-80 ℃保存,待復(fù)溶上機(jī)。

1.4 UPLC-HRMS分析條件

使用復(fù)溶劑(異丙醇-甲醇,1∶1, v/v)100 μL復(fù)溶樣品,上機(jī)檢測(cè)。流動(dòng)相A為含10 mmol/L甲酸銨溶液和0.1%(v/v)甲酸的60%(v/v)乙腈溶液,流動(dòng)相B為含10 mmol/L甲酸銨溶液和0.1%(v/v)甲酸的10%(v/v)乙腈異丙醇溶液,流速為0.4 mL/min。采用線性梯度,設(shè)定如下:0 min, 95%A; 5.5 min, 57%A; 12.0 min, 48%A; 12.5 min, 47%A; 22.5 min, 25%A; 23.5 min, 10%A; 26.5 min, 0%A。

質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型掃描(data dependent acquisition, DDA)模式采集數(shù)據(jù)。全掃描模式分辨率設(shè)定為70 000,自動(dòng)增益控制(automatic gain control, AGC)為1×106,最大進(jìn)樣時(shí)間(maximum injection time, Maximum IT)設(shè)定為100 ms,掃描范圍為m/z135至2 000。MS/MS模式分辨率為17 500, AGC為5×105, Maximum IT為50 ms,最小分辨率為m/z1.5,歸一化碰撞能(normalized collision energy, NCE)為25、30、35。噴霧電壓為3.2 kV (正離子模式)、3.0 kV (負(fù)離子模式),毛細(xì)管溫度為320 ℃。

1.5 物質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)分析

使用LipidSearch 4.2軟件(賽默飛世爾科技有限公司/三井科技有限公司)對(duì)正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫及碎片匹配。相關(guān)參數(shù)設(shè)置見表2。峰對(duì)齊后,將所有鑒定到的代謝物原始峰面積導(dǎo)出到Microsoft Excel,并根據(jù)以下預(yù)定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選:保留CV(生物樣品3次重復(fù)進(jìn)樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均峰面積)低于0.3的物質(zhì);保留m-score(鑒定物質(zhì)的碎片匹配程度)大于2.0的物質(zhì)。

表 2 Lipidsearch數(shù)據(jù)庫物質(zhì)匹配參數(shù)設(shè)置

表 3 部分TG和DG的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果

本研究中使用的統(tǒng)計(jì)方法主要有單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)和熱圖分析(heatmap analysis)。其中,ANOVA通常用于檢驗(yàn)不同處理?xiàng)l件下多組之間是否存在顯著差異。通過檢驗(yàn)得到的P值可用于衡量代謝物在不同條件下的均值差異。熱圖分析是一種用顏色深淺程度表示代謝物含量的分析方法,該方法可對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行控制,并可以直觀展示研究對(duì)象的差異變化情況。

本研究中使用SPSS軟件(ver.19.0)進(jìn)行單因素方差分析,使用在線分析網(wǎng)站(https:/ /software.broadinstitute.org/morpheus/)進(jìn)行熱圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 幾類脂質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律

經(jīng)UPLC-MS/MS對(duì)脂質(zhì)組分進(jìn)行檢測(cè),所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Lipidsearch標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行匹配,并結(jié)合母離子及二級(jí)特征碎片離子進(jìn)行鑒定及結(jié)構(gòu)確證。

2.1.1甘油酯的二級(jí)質(zhì)譜解析

甘油三酯(TG)(18∶1/16∶0/16∶0)在ESI+模式下測(cè)得以下母離子:m/z850.785 6、855.755 8,判斷分別為[M+NH4]+、[M+Na]+的加合形式(M代表中性分子式),對(duì)應(yīng)的M為C53H100O6。

二級(jí)質(zhì)譜(見圖1)測(cè)得特征碎片離子m/z577.518 6、551.503 1,分別為[M-FA(16∶0)]+、[M-FA(18∶1)]+的碎片形式(FA指脂肪酸)。兩個(gè)碎片的豐度比2∶1,與該結(jié)構(gòu)中2個(gè)FA(16∶0)鏈和1個(gè)FA(18∶1)鏈相對(duì)應(yīng)。根據(jù)該質(zhì)譜裂解規(guī)律,共準(zhǔn)確鑒定了212種甘油三酯、43種甘油二酯(DG)。部分代表性結(jié)果見表3。

圖 1 TG(18∶1/16∶0/16∶0) [M+NH4]+離子的二級(jí) 質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig. 1 MS/MS spectrum of TG(18∶1/16∶0/16∶0) [M+NH4]+ion and fragmentation pathwayTG: triglyceride.

2.1.2鞘脂的二級(jí)質(zhì)譜解析

神經(jīng)酰胺(Cer)(d16∶0/23∶0)在ESI+模式下測(cè)得以下離子(見圖2):m/z610.623 7,判斷為[M+H]+的加合形式,中性分子式M為C39H79NO3。二級(jí)質(zhì)譜圖中測(cè)得特征碎片離子m/z592.602 4、256.263 1、238.252 6、226.252 8,分別為[M-H2O]+、[SPH(d16∶0)-H2O+H]+、[SPH(d16∶0)-2H2O+H]+、[SPH(d16∶0)-H2O-CH2O+H]+的碎片形式(SPH表示鞘氨醇)。根據(jù)該質(zhì)譜裂解規(guī)律,共準(zhǔn)確鑒定了118種鞘脂類物質(zhì),其中鞘氨醇?jí)A類26種、神經(jīng)酰胺類42種、鞘磷脂類30種、鞘糖脂類19種。部分代表性結(jié)果見表4。

圖 2 Cer(d16∶0/23∶0) [M+H]+離子的二級(jí) 質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig. 2 MS/MS spectrum of Cer(d16∶0/23∶0) [M+H]+ion and fragmentation pathwayCer: ceramide.

表 4 部分鞘脂類物質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果

2.1.3磷脂的二級(jí)質(zhì)譜解析

磷脂酰膽堿(PC)(16∶0/13∶0)在ESI+模式下測(cè)得以下離子(見圖3):m/z692.459 2,判斷為[M+H]+的加合形式,中性分子式M為C37H74NO8P。二級(jí)質(zhì)譜圖中測(cè)得以下特征碎片離子m/z282.279 0、254.247 2、184.073 3、86.096 2,分別為[C18H34O2]+、[C16H30O2]+、[C5H14NO4P+H]+、[C5H14N]+的碎片形式。根據(jù)該質(zhì)譜裂解規(guī)律,共準(zhǔn)確鑒定了112種磷脂類物質(zhì),其中甘油磷酰膽堿43種、甘油磷酰乙醇胺36種。部分代表性結(jié)果見表5。

2.2 比較不同提取方法的提取效率

圖4結(jié)果顯示,4種提取方法在檢測(cè)物質(zhì)總數(shù)上無顯著性差異,而Bligh-Dyer加酸法和SPE法中的高豐度物質(zhì)(高豐度物質(zhì)指對(duì)應(yīng)色譜峰面積大于500 000的物質(zhì),這類物質(zhì)易于獲得高質(zhì)量的MS/MS譜圖用于結(jié)構(gòu)解析)數(shù)目要顯著大于Folch法和MTBE法(P<0.05)。采用這4種方法提取的脂質(zhì)中高豐度脂質(zhì)物質(zhì)比例從大到小依次為SPE法>Bligh-Dyer加酸法>Folch法=MTBE法,顯然SPE法在提取效率方面更具優(yōu)勢(shì)。

圖 4 不同提取方法獲得的脂類物質(zhì)的數(shù)目Fig. 4 Numbers of lipids extracted by different methods BD: Bligh-Dyer acidic method. The vertical axis represents the number of identified substances in different peak response intervals. Black color represents the detected response interval above 500000. Dark gray represents the detected response interval from 10000 to 500000. Light gray represents the detected response interval less than 10000.

圖 5 不同提取方法的提取重復(fù)性分析Fig. 5 The relative standard deviation of lipid metabolites by different pretreatments The vertical axis represents the number of identified substances in different intervals. Black color represents coefficient of variation (CV, n=3) is less than 10% among this group. Light gray color represents CV (n=3) between 10% and 20%. Dark gray color represents CV (n=3) between 20% and 30%. * indicates a significant difference (P<0.05).

2.3 比較不同提取方法的重復(fù)性

圖5表明不同提取方法的重復(fù)性有顯著差異。其中,SPE法和MTBE法重復(fù)性最好,二者無顯著差別,有超過1 000種物質(zhì)的重復(fù)性小于30%,符合代謝組學(xué)規(guī)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差要求[31]。Folch法、Bligh-Dyer加酸法重復(fù)性較差。這兩種方法在總數(shù)上雖無顯著差異,但Bligh-Dyer加酸法的重復(fù)性不及Folch法。

圖 6 不同提取方法提取(a)脂肪酸、(b)甘油酯、(c)甘油磷脂、(d)鞘脂的熱圖Fig. 6 Heatmap of (a) fatty acids, (b) glycerollipids, (c) phosphoglycerollipids, (d) sphingolipids with different extraction methods

SPE法利用商業(yè)化固相萃取小柱,整個(gè)過程為半自動(dòng)化提取,人工操作步驟少,結(jié)果最穩(wěn)定。MTBE法提取脂質(zhì)時(shí),有機(jī)相位于上層,與有機(jī)相位于下層的Bligh-Dyer加酸法和Folch法相比,有機(jī)相液層更方便取出,提取重復(fù)性更好。Bligh-Dyer加酸法由于操作步驟最多,重復(fù)性最差。

2.4 比較不同提取方法對(duì)各種脂質(zhì)組分的提取效果

對(duì)不同方法提取鑒定到的各類脂質(zhì)進(jìn)行了單因素方差分析。結(jié)果表明,有顯著性差異的物質(zhì)(P<0.05)共54個(gè),其中脂肪酸類有14個(gè)、甘油酯類12個(gè)、甘油磷脂類7個(gè)、鞘脂類13個(gè)、其他組分8個(gè),說明不同提取方法在這些脂質(zhì)的提取中有比較大的歧視性。

如圖6a所示,在飽和脂肪酸提取中,Bligh-Dyer加酸法和SPE法效果優(yōu)于其他方法;在不飽和脂肪酸提取中,MTBE法的提取效果最好,Folch法和Bligh-Dyer加酸法次之。如圖6b所示,在甘油三酯和甘油二酯的提取中,SPE法效果最好,Bligh-Dyer加酸法次之,其次為MTBE法,Folch法最差。如圖6c所示,在甘油磷脂類提取中,Bligh-Dyer加酸法和SPE法優(yōu)于其他方法。

圖 6 (續(xù))Fig. 6 (Continued)

如圖6d所示,在神經(jīng)酰胺類和鞘氨醇類提取中,MTBE法最優(yōu),其次為Folch法,Bligh-Dyer加酸法和SPE法。在鞘磷脂中,SPE法與MTBE法優(yōu)于Folch法和Bligh-Dyer加酸法。在二氫鞘氨醇中,SPE法最優(yōu),Bligh-Dyer加酸法次之,其次為Folch法和MTBE法。

綜上,4種不同的提取方法均采用了極性和非極性混合溶劑處理,在脂質(zhì)種類總數(shù)上無明顯差異;在提取重復(fù)性方面,MTBE法和SPE法的提取重復(fù)性最好。Folch法中溶劑使用體積最大,而Bligh-Dyer加酸法步驟最多,提取得到的低濃度物質(zhì)更多,一定程度上會(huì)降低鑒定和相對(duì)定量的準(zhǔn)確性。

4種提取方法對(duì)各種脂質(zhì)的提取結(jié)果表明,SPE法和MTBE法提取覆蓋的脂質(zhì)種類最多,更具有普適性。

因此,SPE法和MTBE法對(duì)總脂提取效果優(yōu)于其余兩種方法。由于SPE法需要大量使用商業(yè)化萃取柱,增加提取成本。因此可根據(jù)實(shí)際情況采用不同的方法。

2.5 P. yayanosii古菌樣品脂質(zhì)的提取與檢測(cè)

采用SPE提取法,UPLC-HRMS技術(shù)檢測(cè)P.yayanosii樣品中的脂質(zhì)成分,總離子流基峰色譜圖見圖7。

圖 7 P. yayanosii古菌樣品中脂質(zhì)成分的UPLC-HRMS總離子流基峰色譜圖Fig. 7 UPLC-HRMS base peak ion chromatogram of lipid substances extracted from P. yayanosii by SPE UPLC-HRMS: ultra-performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry.

圖 8 P. yayanosii脂質(zhì)物質(zhì)的組成Fig. 8 Lipid components of P. yayanosii Percentage equals current type of identified substances divided by the total number of identified substances.

結(jié)果表明,提取到的脂質(zhì)種類豐富。利用該方法,在古菌P.yayanosii中共鑒定到1 402個(gè)常規(guī)脂類物質(zhì),鑒定到的各類常規(guī)脂質(zhì)數(shù)目占所有鑒定數(shù)目的比例見圖8。其中,鑒定到的脂肪酸的數(shù)目最多,占總數(shù)的27.35%;脂肪酸是甘油酯、甘油磷脂、鞘脂等其他類脂質(zhì)的重要前體物質(zhì)。鑒定到的甘油酯(18.69%)和甘油磷脂(17.05%)的數(shù)目其次;據(jù)報(bào)道,甘油磷脂與古菌耐壓特性密切相關(guān)[32]。而鞘脂類和固醇類物質(zhì)雖然鑒定到的數(shù)目較少,但作為重要的代謝通路參與者[33]也有重要意義?？梢?本文使用的SPE全脂質(zhì)提取方法可以覆蓋到多種與脂質(zhì)合成、耐壓特性和脂質(zhì)代謝相關(guān)的脂類物質(zhì),為古菌脂質(zhì)代謝和特殊生理活性的研究提供重要的分析方法,具有重要意義。

3 結(jié)論

本文比較了Bligh-Dyer加酸法、Folch法、MTBE法和SPE法4種脂質(zhì)提取方法對(duì)古菌脂質(zhì)提取的效果,包括提取脂質(zhì)總數(shù)、類別差異和提取重復(fù)性。雖然鑒定總數(shù)上4種方法無明顯差異,但SPE法和MTBE法的重復(fù)性顯著優(yōu)于其他方法。SPE法和MTBE法對(duì)不同種類的脂質(zhì)歧視性小,適用于古菌總脂質(zhì)提取。通過SPE前處理法結(jié)合UPLC-HRMS的分析,最終在古菌P.yayanosii中測(cè)到1 402個(gè)常規(guī)脂類物質(zhì),以脂肪酸、甘油酯和甘油磷酯為主。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅可以作為超嗜熱嗜壓古菌脂質(zhì)提取的參考,同時(shí)也對(duì)其他極端微生物的脂質(zhì)提取和UPLC-HRMS分有指導(dǎo)意義。