液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜法快速篩查測定藥物中芬太尼類物質(zhì)

鄧慧芬, 張建瑩*, 卞學(xué)海, 羅 耀, 趙祥龍

(1. 深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 深圳 518045; 2. AB SCIEX亞太應(yīng)用中心, 上海 201206)

芬太尼,是一種強效的麻醉性阿片類鎮(zhèn)痛藥,于1960年由比利時藥理學(xué)家和藥劑師保羅·楊森研制出[1],并作為靜脈麻醉劑廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉中,其主要機制與嗎啡相似。由于芬太尼的特殊藥理性質(zhì),以及靈活的通過靜脈、皮膚和黏膜給藥方式,芬太尼已成為治療疼痛最重要的阿片類藥物之一。隨著對芬太尼藥物研究的不斷深入,以其為先導(dǎo)化合物,通過結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系的評價,設(shè)計、合成、篩選到了一系列藥效更強的芬太尼類衍生物,它們大多通過以下一個或多個方式得到(見圖1): 1.使用其他?；娣姨岬谋；?如乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、奧芬太尼); 2.使用其他任意基團(tuán)(氫原子除外)替代苯乙基部分(如β-羥基硫代芬太尼); 3.哌啶環(huán)上存在烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羥基、鹵素、鹵代烷基、氨基及硝基等取代基;4.使用任何取代或未取代的單環(huán)芳香基團(tuán)替代與氮原子直接相連的苯基。

圖 1 芬太尼及芬太尼類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of fentanyl and fentanyl and its analogues

作為藥品研制出來的芬太尼卻在一些國家被一些人作為毒品使用。芬太尼類物質(zhì)藥效較強,如芬太尼衍生物卡芬太尼,其藥效和毒性是海洛因的5 000倍,約2 mg劑量就足以使一個成年人死亡[1]。美國疾病預(yù)防控制中心稱,2016年美國超過2萬起死亡由芬太尼類物質(zhì)吸食過量導(dǎo)致。對此,2019年5月1日起,我國將芬太尼類物質(zhì)全面列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》,開發(fā)該類藥物的檢測方法已成為監(jiān)管部門迫切需要。

目前,國內(nèi)芬太尼類物質(zhì)的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、高效液相色譜(HPLC)法[2-4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[5-12],主要針對芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等單一藥物進(jìn)行分析,方法涉及的基質(zhì)包括血液、乳汁、尿液、唾液等生物基質(zhì)。我國司法鑒定技術(shù)規(guī)范(SF/Z JD0107005-2016)[10]采用LC-MS/MS法測定血液、尿液中芬太尼和舒芬太尼的含量。聯(lián)合國毒品與犯罪問題辦公室推薦方法[1]中,GC-MS方法只涉及4種芬太尼類物質(zhì)的檢測,液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)高分辨方法中也只涉及10多種芬太尼類物質(zhì)的篩查檢測。Craig等[13]采用LC-MS/MS法測定干血中11種芬太尼類物質(zhì),定量限均為0.10 ng/mL。Melissa等[14]采用LC-MS/MS法測定了血液中18種芬太尼類物質(zhì)。但較少有針對廣泛的藥物和毒品疑似物中芬太尼類物質(zhì)的高通量篩查檢測和確證方法報道,這也導(dǎo)致了處方芬太尼類藥物的過量流行和非法芬太尼類藥物的出現(xiàn)。單級質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜的低分辨率、分析速度和掃描模式?jīng)Q定了它們無法滿足痕量藥物的高通量篩查檢測的要求。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,近年來Q-TOF/MS和Orbitrap MS憑借其在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性和數(shù)據(jù)庫檢索等方面的優(yōu)勢,以及質(zhì)譜內(nèi)部件的極大改進(jìn)(如飛行時間質(zhì)譜的飛行管由原來的V型設(shè)計成N型),能很好地彌補先前定量不足的缺陷,已廣泛應(yīng)用于藥物篩查檢測領(lǐng)域[6-13]。本方法通過75%(v/v,下同)乙腈水溶液提取固體和液體藥物中的芬太尼類物質(zhì),采用HLB固相萃取柱凈化,QTOF的信息依賴性采集(Information dependent acquisition, IDA)掃描模式獲取所有化合物的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜信息,建立一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級質(zhì)譜圖庫,結(jié)合色譜保留時間信息,建立了液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)篩查檢測藥物中27種芬太尼類物質(zhì)(包括芬太尼及26種類似物或代謝物)的方法。本方法的建立將有助于在監(jiān)管范圍、檢測技術(shù)和時效性等多方面提升芬太尼類藥物的安全監(jiān)管水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀(SCIEX X500R QTOF,美國AB SCIEX公司);均質(zhì)儀(美國Omni公司);渦旋振蕩儀(Rax top,德國Heidolph公司);高速冷凍離心機(3K18,德國Sigma公司);高純水發(fā)生器(Milli-Q Integral 10+,美國Millipore公司); HLB固相萃取柱(60 mg, 3 mL, Waters公司); 0.22 μm有機濾膜(上海安譜公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純(德國Merck公司),其他試劑均為分析純,水為Milli-Q超純水。27種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(各化合物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L,美國Cerilliant公司)。使用乙腈稀釋為1.00 mg/L和100 μg/L兩種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(-18 ℃避光存放)。采用空白樣品(根據(jù)待測樣品的性質(zhì)選擇維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑樣品為空白樣品)基質(zhì)液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制成質(zhì)量濃度為5.00、10.0、25.0、50.0和100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品前處理

固體、粉末樣品取適量研細(xì)成粉末,攪拌均勻。液體樣品稱取前要搖晃均勻。透皮貼劑樣品揭去防粘層,剪碎。

稱取試樣1.00 g,加入5 mL 75%乙腈水溶液,渦旋溶解,再加入5 mL乙腈,渦旋30 s,超聲提取15 min,渦旋混合1 min, 9 500 r/min離心5 min,吸取全部上清液于40 ℃水浴中氮吹至低于3 mL。吸取濃縮液于HLB固相萃取小柱(使用前用5 mL乙腈活化)中,待上清液全部流出小柱,再加入4 mL乙腈洗脫。收集所有流出液,于40 ℃水浴中氮吹至低于0.5 mL,加入0.5 mL水,再用乙腈定容為1.00 mL,渦旋振蕩30 s, 9 500 r/min離心5 min。取上清液,過0.22 μm有機濾膜,LC-QTOF-MS測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm, 美國Agilent公司)。流動相A: 0.1%(v/v,下同)甲酸水;流動相B: 乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸,v/v,下同)。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 5%B; 2.0～5.0 min, 5%B～50%B; 5.0～16.0 min, 50%B; 16.0～16.1 min, 50%B～5%B; 16.1～20.0 min, 5%B。流速:0.3 mL/min。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源和氣體參數(shù):加熱電噴霧離子(HESI)源;噴霧電壓5 500 V;毛細(xì)管溫度325 ℃;加熱器溫度550 ℃;霧化氣3.79 Pa;輔助氣4.14 Pa;氣簾氣35 u;碰撞氣7 u;掃描模式:IDA;正離子采集模式。TOF-MS參數(shù):采集范圍為m/z200～450,去簇電壓(DP) 80 V,碰撞能(CE) 10 V,累積時間0.16 s。TOF-MS/MS參數(shù):采集范圍為m/z80～450,累積時間0.06 s,電荷數(shù)1;質(zhì)譜掃描參數(shù)見表1。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

1.5.1分辨率

高分辨質(zhì)譜在合適的分辨率下可以將目標(biāo)化合物與基質(zhì)中的同質(zhì)異位素干擾物實現(xiàn)基線分離,從而得到更為準(zhǔn)確的定性結(jié)果?；赬500R QTOF-MS可采集到未知物的高分辨率質(zhì)譜一級(≥35 000)和二級數(shù)據(jù),且質(zhì)譜精確度≤5×10-6(5 ppm),具有實現(xiàn)目標(biāo)物與干擾物質(zhì)完全基線分離、有效地去除基質(zhì)干擾、提取離子色譜圖清晰完整、可準(zhǔn)確定性和定量等優(yōu)點,本實驗一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜均采用≥35 000的分辨率,得到的譜圖既有母離子的精確質(zhì)量數(shù),又有二級質(zhì)譜全掃描信息,完全滿足定性和定量要求。圖2為采用IDA掃描方式得到的芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液的全掃描色譜圖和TOF-MS、TOF-MS/MS質(zhì)譜圖。

1.5.2一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫

在優(yōu)化的LC-MS條件下進(jìn)樣,對27種化合物先進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描,獲得目標(biāo)物的高分辨質(zhì)譜信息?；衔锏拿Q、保留時間、分子式、一級質(zhì)譜理論質(zhì)量數(shù)、一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量數(shù)偏差、2個二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)等信息見表1。

表 1 27種化合物的質(zhì)譜信息和保留時間

1.5.3MS/MS二級譜庫

聊了一陣子，話頭轉(zhuǎn)到西瓜上來了，她說：“你種的西瓜真好，甜得很。”剖了瓜，自己拿一瓣，還拿一瓣給我。我咬了兩口，見上面有瓜籽，就用小指把它摳出來，瓜籽摳出來了，沾在我的指尖，我的臉也像瓜瓤子，通紅通紅的。

根據(jù)歐盟《食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認(rèn)的指導(dǎo)文件》(SANTE/11813/2017)[15]中規(guī)定的高分辨質(zhì)譜定性最低要求,必須一個高分辨母離子加一個高分辨子離子,且質(zhì)量偏差<5 ppm。將目標(biāo)物精確質(zhì)量母離子在不同碰撞能量下(20、35和50 eV)進(jìn)行測定,采集并疊加二級譜圖庫所有的子離子信息,建立化合物的二級信息譜庫。

圖 2 芬太尼的(a)全掃描色譜圖、(b)一級質(zhì)譜圖和(c)二級質(zhì)譜圖Fig. 2 (a) Total ion chromatogram, (b) TOF-MS spectra and (c) TOF-MS/MS spectra of fentanyl

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱

由于芬太尼類物質(zhì)具有苯基、烷基和酰胺等基團(tuán),化學(xué)性質(zhì)差異較大,同時有部分同分異構(gòu)體,因此本方法優(yōu)先考慮使用苯基-己基(Phenyl-Hexyl)色譜柱;當(dāng)使用含甲醇流動相時,其對極性/胺類化合物和芳香族化合物有顯著的選擇性。結(jié)果表明,在使用0.1%甲酸水-乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸)為流動相時,27種芬太尼類物質(zhì)在苯基-己基色譜柱中均得到較好的分離和保留,其中包括兩類4種同分異構(gòu)體(4-氟異丁酰芬太尼和4-氟丁酰芬太尼,丁酰芬太尼和對氟芬太尼)。

2.1.2流動相

考察了乙腈-水、甲醇-水和乙腈/甲醇(1∶1)-水(水相和有機相中均分別添加0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨(含0.01%甲酸,pH約為4.5)和5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸,pH約為3.2))流動相條件下的色譜分離效果。在不同流動相條件下目標(biāo)化合物的分離度存在差異,且質(zhì)譜響應(yīng)強弱不同。在甲醇-水流動相體系中,大多數(shù)化合物響應(yīng)較強,分離度相對較好,但個別化合物峰形稍差。在乙腈-水流動相條件下,較多化合物峰形較好,但4種同分異構(gòu)體的色譜峰分離度較差。乙腈/甲醇(1∶1)混合溶液-水流動相的優(yōu)點是同分異構(gòu)體分離更好,能同時兼顧峰形和分離度,這可能是由乙腈和甲醇的洗脫能力以及黏度差異導(dǎo)致的。在流動相中加入少量甲酸(0.1%)有利于提高分析物的離子化效率并改善色譜峰峰形,提高質(zhì)譜響應(yīng)強度。結(jié)果表明,以0.1%甲酸水-乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸)為流動相比添加乙酸銨的流動相體系獲得更優(yōu)的色譜峰形及質(zhì)譜響應(yīng)。在優(yōu)化的色譜條件下,27種芬太尼類物質(zhì)的保留時間見表1,提取離子色譜圖見圖3。

圖 3 27種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatogram of the 27 compound standard solution (10.0 μg/L)

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑

根據(jù)溶劑性質(zhì)、目標(biāo)化合物性質(zhì)、樣品基質(zhì)特點和檢測靈敏度的要求及有機溶劑含量高更有利于樣液濃縮的需要,選取乙腈-水溶液作為提取溶劑。同時考察了50%乙腈水溶液、75%乙腈水溶液、100%乙腈對固體、液體藥物樣品中27種目標(biāo)化合物的提取效果。結(jié)果表明,加入適量水,可增加固體藥物的溶解,提高目標(biāo)化合物的提取效率;但加入過多的水分又不利于樣液的濃縮。綜合考慮,選取5 mL的75%乙腈水溶液+5 mL乙腈為提取溶劑。

2.2.2凈化柱

2.2.3洗脫液用量

分別比較了HLB固相萃取柱洗脫液使用2、3、4、5 mL乙腈對27種目標(biāo)化合物的回收率的影響。結(jié)果表明,乙腈洗脫量為4 mL時,27種目標(biāo)化合物的總體回收率較好,其回收率為73.3%～83.3%(見圖4)。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

實驗考察了止咳水、維生素C壓片、透皮貼劑和頭痛粉樣品的基質(zhì)效應(yīng),用純?nèi)軇┖突|(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液,得到目標(biāo)物的溶劑和樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程,根據(jù)ME=Ka/Kb(其中Ka是指樣品基質(zhì)的校準(zhǔn)曲線斜率,而Kb是指溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)計算,并繪制基質(zhì)效應(yīng)圖。由圖5可知,這4種樣品的ME值在98.0%～130%之間,說明基質(zhì)效應(yīng)較低。這4種基質(zhì)干擾較小,樣品可直接采用50%乙腈水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,但因其他復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)未考察,因此在方法考察中統(tǒng)一使用基質(zhì)匹配曲線。

圖 4 洗脫液體積對化合物回收率的影響Fig. 4 Effects of eluent volume on recoveries

圖 5 27種芬太尼類物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 5 Matrix effects (ME) of 27 fentanyl analogs and metabolites

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1定性方法的準(zhǔn)確度和精密度

在維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑空白樣品中添加27種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(50.0 μg/kg)作為樣品進(jìn)行測定。由表1可知,27種化合物的精確質(zhì)量數(shù)的偏差在3.0×10-7～2.1×10-6之間,二級全掃描質(zhì)譜圖的匹配度在90%以上。

2.4.2方法的線性方程和定量限

本方法在快速篩查的基礎(chǔ)上通過提取一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定量從而實現(xiàn)同步定量分析,每個化合物采集點數(shù)均可在20個以上,保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測組分的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。27種芬太尼類物質(zhì)在5.00～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。

方法的定量限是基于回收率和精密度滿足歐盟SANTE/11813/2017要求而進(jìn)行驗證的最低濃度水平。試驗結(jié)果顯示,27種物質(zhì)的定量限均為10.0 μg/kg。芬太尼類物質(zhì)為列管物質(zhì),違禁試樣主要為郵寄、運輸、旅客攜帶的未知物、非法及處方藥物,這些違禁物中芬太尼類物質(zhì)的含量一般都較高,10.0 μg/kg的定量限已足夠檢測和監(jiān)管需要。

2.4.3加標(biāo)回收率和精密度

分別采用空白維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑樣品作為驗證基體。各化合物的添加水平為10.0、20.0及50.0 μg/kg,每個水平做6個平行樣。按本方法中測定步驟操作,外標(biāo)法定量,計算每種驗證基體的回收率范圍和精密度。在維生素C壓片中3個添加水平下的平均回收率分別為84.8%～106%、 83.7%～96.3%和82.9%～96.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.38%～7.15%之間(n=6,見表2);在頭痛粉中3個添加水平下的平均回收率分別為84.8%～106%、 87.6%～100%和85.5%～100%,RSD在0.86%～8.49%之間(n=6);在止咳水中3個添加水平下的平均回收率分別為93.0%～109%、 88.7%～97.3%和86.9%～96.9%,RSD在1.12%～7.81%之間(n=6);在透皮貼劑中3個添加水平下的平均回收率分別為83.1%～106%、 89.0%～101%和87.5%～98.1%,RSD在0.69%～8.71%之間(n=6)。

3 結(jié)論

本實驗利用高效液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜對固體壓片、粉末、液體、透皮貼劑中27種芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行篩查測定,20 min內(nèi)可完成27種芬太尼類物質(zhì)的高通量篩選和確認(rèn)。高分辨質(zhì)譜在樣品分析中消除了基質(zhì)干擾,結(jié)合固相萃取前處理方法,極大提高了方法的定性準(zhǔn)確性和定量靈敏度。以精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜圖和相對保留時間為基礎(chǔ),構(gòu)建了27種芬太尼類物質(zhì)篩查數(shù)據(jù)庫,建立了27種芬太尼類物質(zhì)的快速篩查和確證方法。該方法作為一種國內(nèi)外高度關(guān)注的新型毒品芬太尼類物質(zhì)的快速篩選和確證檢測技術(shù),必將在公安緝毒、刑偵及相關(guān)檢測部門對芬太尼類物質(zhì)監(jiān)控篩查和確認(rèn)中得到廣泛應(yīng)用,具有應(yīng)用價值。