超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定血清中12種抗癲癇藥物

代 靜, 高樂虹, 彭方達, 于麗佳, 王朝東, 王玉平, 丁春光*

(1. 國家衛(wèi)生健康委職業(yè)安全衛(wèi)生研究中心, 北京 102308; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院, 北京 100053)

癲癇是一種常見的、復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是神經(jīng)元高度同步化放電所致反復(fù)癇性發(fā)作的慢性疾病[1]。臨床上癲癇通常采用單一用藥或聯(lián)合用藥的方式進行治療,抗癲癇藥物如苯妥英鈉(phenytoin sodium)、卡馬西平(carbamazepine)、丙戊酸鈉(sodium valproate),治療范圍狹窄,毒性較強,易發(fā)生不良反應(yīng),需要定期監(jiān)測血藥濃度。隨著醫(yī)藥水平的提高,出現(xiàn)了很多新型抗癲癇藥物如拉莫三嗪(lamotrigine)、奧卡西平(oxcarbazepine)、托吡酯(topiramate)、左乙拉西坦(levetiracetam)等[2],相較于傳統(tǒng)抗癲癇藥物,它們的治療效果更好,毒副反應(yīng)低,但需長期服藥?；颊咴诜每拱d癇藥物后存在較大的個體差異,即便是經(jīng)同一途徑使用相同劑量藥物,也會出現(xiàn)各不相同的治療反應(yīng)。為了確?；颊哂盟幍陌踩院陀行?在臨床治療中需要開展及時、準(zhǔn)確的治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring, TDM),定期檢測患者體內(nèi)的藥物濃度,制定最佳的個體化給藥方案[3,4]。

目前對于抗癲癇藥物的檢測有色譜分析法[5-12]、光譜分析法[13]、免疫分析法[14-15]、電化學(xué)分析法[16]等,其中,色譜分析法應(yīng)用較為廣泛。實驗室中通常采用高效液相色譜法(HPLC)或高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)進行血藥濃度的分析。高效液相色譜法選擇性強,重現(xiàn)性高,但容易受到內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,同時分析多種物質(zhì)難度較大。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有優(yōu)越的定性與定量功能,專屬性強,靈敏度高,受內(nèi)源性雜質(zhì)干擾小,能夠同時進行高量物質(zhì)分析的特點[17]。當(dāng)前文獻報道的檢測方法多針對傳統(tǒng)抗癲癇藥物,且方法同時檢測種類較少,不能滿足臨床抗癲癇藥物不斷增加的需求。基于此,本研究建立了同時測定血清中12種抗癲癇藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),方法前處理簡便、快速,專屬性強,靈敏度高,大大提高了檢測效率,為臨床上抗癲癇藥物血藥濃度的監(jiān)測、個體化給藥方案的制訂、藥物代謝動力學(xué)的研究提供了方法技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ-S Micro超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司); E3116R型臺式高速冷凍離心機(廣東安勝儀器有限公司);十萬分之一天平(德國Sartorius公司); VORTEX-5型渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司); Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解、定容,將丙戊酸鈉配制成5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,其余物質(zhì)配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別移取12種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇稀釋,制得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,其中氯硝西泮質(zhì)量濃度為5 μg/mL,丙戊酸鈉質(zhì)量濃度為250 μg/mL,其余10種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為50 μg/mL,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前用甲醇稀釋至所需濃度?/p>

分別精密稱取非那西丁、氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解、定容,配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝眉状枷♂?配制得10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.2血清樣品的處理

量取血清樣品200 μL,加入內(nèi)標(biāo)工作液(氯唑沙宗10 μL、非那西丁20 μL),渦旋混勻,加入800 μL乙腈,渦旋振蕩60 s,靜置5 min,于4 ℃以12 000 r/min離心10 min,取上清液上機檢測。

1.2.3色譜條件

經(jīng)過多年發(fā)展，中國已陸續(xù)建成了西氣東輸、陜京管道系統(tǒng)、川氣東送、甬滬寧、蘭鄭長等一批長距離、大輸量主干管道，2017年底中國境內(nèi)在役油氣管道總里程累計約13.31萬千米[1]，形成了“北油南運”“西油東運”“西氣東輸”“海氣登陸”的供應(yīng)格局。

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:50 ℃;流動相:A為水(含10 mmol/L甲酸銨), B為甲醇(含10 mmol/L甲酸銨);流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 98%A; 0.5～5.5 min, 98%A～30%A; 5.5～5.7 min, 30%A; 5.7～7.0 min, 30%A～10%A; 7.0～9.0 min, 10%A～98%A。進樣量:2 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源;電噴霧電離源;離子源溫度:150 ℃;去溶劑化溫度:350 ℃;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,正、負(fù)離子同時掃描;液氮氣體流速:650 L/h；毛細(xì)管電壓:3.5 kV。12種抗癲癇藥物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本方法采用梯度洗脫使12種待測化合物得到較好的分離,減少了血清中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。實驗分別考察了甲醇-水、乙腈-水體系作為流動相對色譜分離的影響。甲醇-水體系作為流動相時,洗脫能力更強,出峰時間適宜,因此選擇甲醇-水作為流動相。

但部分待測化合物的離子化效率較低,故考慮在流動相中加入改性劑以調(diào)節(jié)流動相的離子強度,提高化合物的響應(yīng)值。實驗分別在水相和有機相中添加了0.1%甲酸、10 mmol/L甲酸銨、10 mmol/L乙酸銨。結(jié)果表明,當(dāng)流動相中添加10 mmol/L甲酸銨時,質(zhì)譜響應(yīng)最好,檢測靈敏度高。

同時實驗還考察了不同濃度(5、10和20 mmol/L)甲酸銨溶液對色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。當(dāng)甲酸銨濃度較低或較高時,對負(fù)離子電離均有抑制,當(dāng)甲酸銨溶液濃度為10 mmol/L時,結(jié)果較為理想。

因而實驗最終選擇10 mmol/L甲酸銨水溶液和含10 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用電噴霧電離源,分別對12種待測化合物和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行一級質(zhì)譜全掃描,確定各化合物的準(zhǔn)分子離子。在正離子模式下,普瑞巴林、左乙拉西坦、加巴噴丁、卡馬西平、拉考沙胺、奧卡西平、拉莫三嗪、氯硝西泮及非那西丁均出現(xiàn)[M+H]+峰;在負(fù)離子模式下,苯巴比妥、托吡酯、氯唑沙宗均出現(xiàn)[M-H]-峰。此外,由于苯妥英鈉和丙戊酸鈉分子結(jié)構(gòu)為鈉鹽,在水中會水解形成苯妥英和丙戊酸,故其準(zhǔn)分子離子峰分別為苯妥英的[M+H]+峰及丙戊酸的[M-H]-峰。將掃描得到的準(zhǔn)分子離子作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描,優(yōu)化碰撞能量和錐孔電壓,優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專屬性

取6個不同來源的空白血清,混合均勻,移取200 μL,不加內(nèi)標(biāo),加入800 μL乙腈,按1.2.2節(jié)描述處理并上機進樣測定。同時配制加入12種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品溶液,并加入非那西丁和氯唑沙宗內(nèi)標(biāo)溶液后同法測定,考察12種抗癲癇藥物及2種內(nèi)標(biāo)化合物的專屬性。結(jié)果表明,基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測化合物的測定,12種抗癲癇藥物和2種內(nèi)標(biāo)化合物的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 12種抗癲癇藥物和2種內(nèi)標(biāo)化合物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 12 antiepileptic drugs and two internal standards 1. pregabalin; 2. gabapentin; 3. levetiracetam; 4. lacosamide; 5. lamotrigine; 6. phenobarbital; 7. phenacetin (IS); 8. topiramate; 9. oxcarbazepine; 10. chlorzoxazone (IS); 11. phenytoin sodium; 12. carbamazepine; 13. clonazepam; 14. sodium valproic.

2.3.2基質(zhì)效應(yīng)

在體內(nèi)藥物分析中,基質(zhì)常常對分析物的分析產(chǎn)生干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,因而需要考察基質(zhì)效應(yīng)。分析物和內(nèi)標(biāo)的絕對基質(zhì)效應(yīng)可以用基質(zhì)因子(MF)表示:MF=As/An,其中,As為空白基質(zhì)溶液中待測物或內(nèi)標(biāo)的峰面積;An為空白溶劑中待測物或內(nèi)標(biāo)的峰面積。當(dāng)MF=1,表明基質(zhì)效應(yīng)不存在;當(dāng)MF>1,可能存在離子增強效應(yīng);當(dāng)MF<1:可能存在離子抑制效應(yīng)。進一步將分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子,得到經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。

本實驗使用6批來源不同的空白血清樣品,提取后分別加入12種待測化合物,制備低、中、高3個水平(0.05、0.25、1.25 mg/L)的質(zhì)控樣品,進樣并計算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果顯示,12種抗癲癇藥物在血清中經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為95.60%～108.0%, RSD值≤10.6%,能夠滿足測定需求。

2.3.3線性關(guān)系和定量限

取950 μL空白血清樣品,分別加入已配制好的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各50 μL,渦旋混勻,配制成系列質(zhì)量濃度的血清樣品溶液。取200 μL制備好的血清樣品,按1.2.2節(jié)描述進行前處理,然后上機測定,以待測物質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),待測物和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析,并用最小二乘法(權(quán)重系數(shù)1/X)計算得到回歸方程。12種抗癲癇藥物在各自線性范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992,能夠滿足檢測要求;以信噪比(S/N)為10時待測物的質(zhì)量濃度為定量限,12種抗癲癇藥物的定量限范圍為0.140～103 μg/L,滿足定量測定需求。12種抗癲癇藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。

2.3.4準(zhǔn)確度和精密度

取空白血清樣品,分別配制12種抗癲癇藥物低、中、高3個水平的加標(biāo)樣品,由于實際樣品一般要稀釋10倍或20倍后測定,所選的低、中、高水平基本覆蓋了稀釋后各藥物有效血藥濃度范圍。低、中、高每個水平制備6個樣品進樣測定,考察加標(biāo)回收率和批內(nèi)精密度,通過測定3個分析批,考察批間精密度。實驗結(jié)果見表3, 12種抗癲癇藥物的加標(biāo)回收率為90.80%～114.0%,批內(nèi)RSD值≤13.2%,批間RSD值≤14.8%。表明方法的準(zhǔn)確度和精密度均良好,能夠滿足樣品的定量分析要求。

2.3.5穩(wěn)定性

日內(nèi)穩(wěn)定性:采用低和高水平(0.05 mg/L和1.25 mg/L)質(zhì)控樣品,預(yù)處理后置于自動進樣盤(10 ℃)中,分別于0、2、4、8、12和24 h進樣測定。結(jié)果表明,12種待測物含量的RSD值≤9.14%,日內(nèi)穩(wěn)定性良好。

短期穩(wěn)定性:采用低和高水平(0.05 mg/L和1.25 mg/L)質(zhì)控樣品,置于-20 ℃冰箱中冷凍保存,分別于第1、7、15 d解凍后進樣測定。結(jié)果表明,12種抗癲癇藥物含量的RSD值≤13.6%,說明在15 d內(nèi)樣品能夠保持穩(wěn)定。

表 2 12種抗癲癇藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

表 3 12種抗癲癇藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

凍融穩(wěn)定性:采用低和高水平(0.05 mg/L和1.25 mg/L)質(zhì)控樣品,置于-20 ℃冰箱中冷凍保存,反復(fù)凍融3次,前處理后進樣測定。結(jié)果表明,12種抗癲癇藥物測得濃度的RSD值≤14.5%,在凍融3次下均能夠保持穩(wěn)定。

2.4 實際樣品檢測

應(yīng)用建立的檢測方法對10例服用抗癲癇藥物的患者進行血藥濃度分析。根據(jù)文獻[4]提到的抗癲癇藥物有效血藥濃度范圍,多數(shù)患者體內(nèi)抗癲癇藥物未達到有效濃度,有1位患者體內(nèi)丙戊酸鈉含量超出有效濃度范圍(見表4)。

表 4 實際樣品中12種抗癲癇藥物的測定結(jié)果

這些檢測結(jié)果可以幫助醫(yī)生準(zhǔn)確掌握患者體內(nèi)的藥物類型和血藥濃度,從而為給患者進行精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。在檢測過程中還發(fā)現(xiàn),醫(yī)生為某位患者開具了左乙拉西坦、丙戊酸鈉、拉莫三嗪3種藥物的處方,但這位患者體內(nèi)除這3種藥物外,還檢出了較高含量的氯硝西泮。在治療過程中,醫(yī)生往往不能完全掌握患者曾經(jīng)的用藥情況,開藥時可能發(fā)生用藥種類重復(fù)、用藥劑量過大、聯(lián)合用藥產(chǎn)生不良反應(yīng)等問題，而本方法能夠同時篩查12種抗癲癇藥物,便于了解患者之前的用藥史,從而幫助醫(yī)生根據(jù)患者之前的用藥情況更有針對性地進行治療。

3 結(jié)論

本文建立了同時測定血清中12種抗癲癇藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,通過梯度洗脫使12種抗癲癇藥物得到較好分離;通過調(diào)整流動相,優(yōu)化質(zhì)譜條件,提高了檢測靈敏度。采用乙腈沉淀蛋白質(zhì)進行樣品前處理,方法學(xué)考察回收率、精密度均滿足測定需求。該方法簡便、快速,能夠排除內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,準(zhǔn)確定性和定量,便于同時篩查體內(nèi)多種抗癲癇藥物,適用于臨床上抗癲癇藥物血藥濃度的監(jiān)測。