4-巰基苯硼酸修飾二維二硫化鉬納米復合材料的制備及其用于N-糖肽特異性富集

張漢卿, 秦偉捷, 張養(yǎng)軍*

(1. 安徽醫(yī)科大學研究生院, 安徽 合肥 230032; 2. 軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室, 北京 102206)

蛋白質(zhì)的糖基化作為細胞調(diào)節(jié)機制的關鍵途徑之一,在多種生物過程中扮演著至關重要的角色,如細胞免疫、信號傳導、細胞生長與分化、蛋白質(zhì)降解以及炎癥產(chǎn)生等[1-4]。目前針對N-糖基化蛋白的研究策略主要是先將蛋白酶切成肽段后再進行質(zhì)譜鑒定,在這一過程中,由于生物樣品中存在高豐度非糖肽的抑制,使N-糖基化肽段的質(zhì)譜分析變得尤為困難。因此,發(fā)展從復雜生物樣本中選擇性富集N-糖肽對糖蛋白質(zhì)組的研究至關重要。

近年來,已發(fā)展出多種不同原理的方法用于N-糖基化肽段的富集分離,包括凝集素親和層析法、酰肼化學法、親水作用色譜法和硼酸化學法等。凝集素親和層析法是目前使用較為廣泛的糖基化肽段富集方法,然而凝集素只針對特殊的聚糖發(fā)生特異性反應,阻礙了糖基化肽段的整體鑒定分析[5]。酰肼化學法是利用酰肼基團和糖肽之間形成的特異性共價鍵，以達到對糖肽的準確識別，但該方法程序頗為復雜且耗時,并遺失了聚糖的部分結構信息[6]。親水作用色譜法優(yōu)點在于提供完整碳水化合物基團信息,但由于相互作用弱,限制了在復雜生物樣本中的選擇性和靈敏度[7]。硼酸化學法優(yōu)點在于可以提供完整碳水化合物基團信息,因其操作簡便、適應性廣和兼容性好等優(yōu)點,在糖基化肽段的富集方面受到越來越多的關注[8-10]。但是現(xiàn)有的富集工具常常存在選擇性差、空間位阻大等問題,經(jīng)常導致其在復雜生物樣本應用中靈敏度差,負載量低等。因此,開發(fā)一種性質(zhì)穩(wěn)定、富集效率高的糖基化肽段富集材料具有十分重要的意義。

得益于功能材料的快速發(fā)展,越來越多的納米材料被成功應用于蛋白質(zhì)組學的領域當中,如二氧化硅、石墨烯和金屬有機框架(MOFs)等[11-14]。二硫化鉬(MoS2)作為一種重要的類石墨烯的二維層狀納米材料,由于其特有的物理化學性質(zhì),在析氫反應、復合材料和疾病治療診斷等不同領域受到越來越多的關注[15-18]。相比于二氧化硅等材料的三維立體結構,類石墨烯的二硫化鉬呈現(xiàn)出納米尺度的二維層狀形態(tài),其末端裸露的活性硫原子提供了大量的可修飾位點。在此基礎上,本研究利用快速便捷的兩步“金-硫”(Au-S)反應在二硫化鉬表面上負載4-巰基苯硼酸(4-MPB)制備出新型功能納米復合材料MoS2/Au/4-MPB。超薄二維層狀納米結構的二硫化鉬具有較小的分子間阻力,能有效減少材料間的非特異性吸附與傳質(zhì)阻力。此外,4-巰基苯硼酸對糖基化肽段的高度選擇能力使得復合材料在實際生物樣本檢測中展現(xiàn)出高效的N-糖基化肽段選擇性,為糖基化蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi 4800發(fā)射掃描電子顯微鏡(日立,日本), FEI Tecnai G20透射電子顯微鏡(FEI,美國), Bruker D8 Advance衍射儀、Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(Bruker,德國), SDTQ600熱分析儀(TA,美國), Nano Drop 2000C超微量分光光度計、Easy NLC-1000 LC-MS/MS納升級液相色譜-串聯(lián)Q Exactive Plus質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國), Zeta View PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀(Particle Metrix,德國), Concentrator plus真空離心濃縮儀(Eppendorf,德國)。

1.2 MoS2/Au/4-MPB復合納米材料的制備

1.2.1MoS2納米材料的制備

依據(jù)文獻方法[19,20],經(jīng)過對溶劑熱法進行適當修改制備超薄二硫化鉬納米材料。將1.21 g Na2MoO4·2H2O、1.52 g (NH2)2CS、和30 mg PEG-20000加入30 mL超純水中,機械攪拌30 min,超聲渦旋獲得均一透明的溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移至50 mL不銹鋼高壓反應釜中密封,于220 ℃下加熱反應24 h后,冷卻至室溫。將反應產(chǎn)物在1 500 g條件下離心15 min,移取沉淀,依次使用30 mL超純水、30 mL乙醇洗滌沉淀兩次,30 mL去離子水洗滌沉淀3次,每次洗滌在1 500 g條件下離心15 min,移取沉淀。最后將所得黑色粉末在60 ℃真空條件下干燥6 h,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MoS2/Au/4-MPB納米復合材料的制備

依據(jù)文獻報道[21,22]的制備方法適當修改，用于新型功能納米復合材料的制備。將20 mg MoS2黑色粉末、3 mg三水合四氯化金(Ⅲ)、100 μL油胺和150 μL三異丙基硅烷混合于3 mL正己烷中,室溫靜置4 h,分別使用正己烷和乙醇清洗,向所得沉淀中加入4 mL含20 mg 4-巰基苯硼酸的乙醇溶液,在室溫條件下振蕩混合12 h。使用離心方法將所得沉淀依次使用5 mL去離子水、乙醇洗滌兩次,將沉淀在60 ℃真空條件下干燥4 h，得到黑色粉末,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 標準蛋白與尿液外泌體蛋白的制備

1.3.1標準蛋白酶切

稱取1 mg IgG和1 mg BSA，分別溶解在1 mL 50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)中,使其質(zhì)量濃度為1 μg/μL,加入100 mmol/L的DTT 111 μL(終濃度為10 mmol/L),于60 ℃下加熱還原1 h,隨后降至室溫;加入500 mmol/L的IAA 111 μL(終濃度為50 mmol/L),于室溫、暗處烷基化反應30 min。以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃下恒溫孵育過夜。孵育結束后使用C18脫鹽柱進行脫鹽分裝,于45 ℃真空離心濃縮,于-20 ℃冰箱中儲存，備用。

1.3.2尿液外泌體蛋白的提取及酶切

尿液采集:采集3名20～25歲健康成年男性志愿者晨起首次排尿尿液50 mL,然后立即處理,無需保存。

尿液外泌體蛋白提取:使用Thery等[23,24]的方法,以300 g離心10 min、2 000 g離心10 min和10 000 g離心30 min分別去除全細胞、死細胞和細胞碎片;將上清液以110 000 g離心70 min,得到的沉淀為外泌體的粗提取物;將獲得的外泌體粗提取物使用1×PBS洗滌2次(110 000 g, 70 min),去除污染蛋白質(zhì),得到外泌體。提取的尿液外泌體使用8 mol/L尿素復溶,使用超聲波細胞破碎儀200 W破碎30 min提取蛋白質(zhì),將提取的蛋白質(zhì)于-80 ℃冰箱中儲存，備用。

尿液外泌體蛋白酶切:使用超濾管酶切(FASP)[25],將提取的外泌蛋白溶液加入30 kDa超濾管,使用8 mol/L尿素以14 000 g離心洗滌12 min,重復1次,之后加入終濃度10 mmol/L DTT,于37 ℃還原4 h;繼續(xù)使用8 mol/L尿素以14 000 g離心12 min洗滌2次,去除DTT;隨后向超濾管中加入終濃度為50 mmol/L的IAA,于室溫暗處烷基化反應30 min。分別使用8 mol/L尿素、50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)以14 000 g、12 min離心清洗3次。使用Nano Drop檢測樣本濃度,以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶,于37 ℃恒溫孵育12 h;將恒溫孵育后的樣本以14 000 g離心12 min獲得濾液,之后加入100 μL超純水再次離心,留超濾液測量肽段濃度,于45 ℃真空離心濃縮后，于-20 ℃冰箱中儲存，備用。

1.4 標準樣品中糖肽的富集

參考之前的文獻[26]方法并進行適當優(yōu)化。將含有2 μg IgG酶解肽段的100 μL富集緩沖液(50 mmol/L碳酸氫銨,pH=8.4)與50 μg MoS2/Au/4-MPB混合,振蕩30 min進行N-糖肽的富集;使用100 μL富集緩沖液離心洗滌3次,去除未吸附樣本,再加入50 μL洗脫緩沖液(ACN-H2O-TFA, 30∶69∶1, v/v/v)振蕩1 min,洗脫吸附的N-糖肽,通過C8膜將洗脫液與材料分離,洗脫液于45 ℃真空離心濃縮后于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PNGase F酶去糖基化

1.6 分析條件

MALDI-TOF MS:脈沖激光波長設置為337 nm,加速電壓20 kV采集質(zhì)譜圖。使用ACN-H2O-H3PO4(70∶29∶1, v/v/v)配制DHB溶液(25 mg/mL)作為基質(zhì)溶液。將樣品(0.5 μL)和基質(zhì)溶液(0.5 μL)混合點在靶板上,于室溫下干燥，然后用MALDI-TOF MS分析。

LC-MS/MS:將酶切后的肽段復溶于0.1%(v/v)FA水溶液中,通過LC-MS/MS分析。流動相A為0.1%(v/v)FA水溶液;流動相B為含0.1%(v/v)FA的乙腈溶液。在C18反相分析柱(1.9 μm)上以600 nL/min的流速進行梯度洗脫。洗脫梯度:0～16 min, 5%B～12%B; 16～51 min, 12%B～24%B; 51～66 min, 24%B～32%B; 66～67 min, 32%B～95%B; 75 min, 95%B。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集在數(shù)據(jù)依賴模式下(data-dependent acquisition, DDA)模式下進行,設置一級質(zhì)譜全掃描范圍為300～1 400 Da,掃描分辨率為120 000,選擇一級質(zhì)譜中豐度最高的20個母離子經(jīng)高能碰撞誘導解離模式(higher-energy collisional dissociation, HCD)后進行二級質(zhì)譜分析,分辨率為15 000,離子注入時間為35 ms,高能誘導解離能量為35%。

1.7 數(shù)據(jù)檢索

使用MaxQuant軟件(版本1.6.4.3)對LC-MS/MS數(shù)據(jù)進行檢索,數(shù)據(jù)庫為UniProt人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(July 2015, 20207)。檢索條件:選擇胰蛋白酶作為蛋白水解酶,最大允許兩個漏切位點;半胱氨酸氨基脲甲基化(carbamidomethyl, C)設置為固定修飾;甲硫氨酸氧化(oxidation, M)、蛋白質(zhì)N-末端乙?；?acetyl, proteinN-term)和脫酰胺基(deamidated,18O)設置為可變修飾;母離子和碎片離子的最大質(zhì)量容差分別設置為1.5×10-5mg/L和0.5 Da,蛋白質(zhì)的假陽性率(FDR)水平為1%。在搜索結果中,只有包含N#XSer/Thr/Cys(N#表示糖基化位點，X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)固定氨基酸序列和脫酰胺基18O(N)的肽段才被確定為N-糖肽。

2 結果與討論

2.1 MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料的表征

MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料的制備過程見圖1。首先在MoS2二維層狀表面通過“Au-S”反應固定納米金線,然后再次通過“Au-S”反應使納米金線與4-MPB進行特異性結合,將4-MPB負載在MoS2表面,得到MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料。

圖 1 MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料的制備流程圖Fig. 1 Functional nanocomposite preparation workflow of molybdenum disulfide/gold/4-mercaptophenylboronic acid (MoS2/Au/4-MPB)

圖 2 (a)MoS2掃描電鏡圖、(b)透射電鏡圖以及(c)MoS2/Au透射電鏡圖Fig. 2 (a) Scanning electron microscope (SEM) image of the MoS2, (b) transmission electron microscope (TEM) image of the (b) MoS2 and (c) MoS2/Au

使用掃描電鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)對合成材料的形態(tài)結構進行表征。如圖2所示,合成的二硫化鉬呈現(xiàn)半透明“萬花筒”狀結構,可以為后續(xù)反應提供大量的可修飾位點。如圖2a和圖2b所示,二硫化鉬直徑分布約為70～300 nm,符合納米材料的尺寸特征(1～100 nm)。由圖2c可以看出,在固定金納米顆粒后大量納米金線(直徑約為10 nm)均勻分布于超薄二維二硫化鉬納米材料表面,增加了二維二硫化鉬納米材料的表面活性位點,有利于修飾大量的活性基團4-巰基苯硼酸。

圖 3 (a) 4-MPB、MoS2/Au/4-MPB的紅外光譜圖、(b) MoS2、MoS2/Au/4-MPB的X射線衍射圖譜和(c) MoS2/Au、MoS2/Au/4-MPB的熱重曲線圖Fig. 3 (a) FT-IR spectra of 4-MPB and MoS2/Au/4-MPB, (b) X-ray diffraction patterns of MoS2 and MoS2/Au/4-MPB and (c) thermogravimetric analyzer (TGA) curves of MoS2/Au and MoS2/Au/4-MPB

此外,實驗還使用不同表征方法進行表征，以確定MoS2/Au/4-MPB納米復合材料的組成和性能。首先,對制備的材料進行了紅外光譜(IR)分析,如圖3a所示,合成后MoS2/Au/4-MPB在500～1 500 cm-1出現(xiàn)與4-MPB相似的指紋峰,表明4-MPB已成功連接到MoS2/Au復合材料上。對制備的材料進行X射線衍分析,結果如圖3b所示,可以看出,在14°(002)、33°(101)、40°(222)、59°(110)處的衍射峰,與2H-MoS2的標準圖譜所對應的特征峰位匹配(JCPDS 37-1492),說明該方法可以制備均一穩(wěn)定的二維二硫化鉬納米材料。在負載納米金線后,在64.5°(221)、77.6° (311)處出現(xiàn)Au的特征峰(JCPDS 79-0418)。這些特征峰表明金納米顆粒成功固定在二硫化鉬納米材料表面。

進一步通過熱重分析(TGA)評價4-MPB的負載量,如圖3c所示,在400～800 ℃后,新型功能復合材料的熱重損失達到16.8%,這是由于復合材料中4-巰基苯硼酸的熱分解而形成,表明大量的4-巰基苯硼酸成功修飾在納米金線上，并負載在二硫化鉬納米材料表面。

圖 4 IgG胰蛋白酶消化物(1 μg)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) spectra of immunoglobulin G (IgG) tryptic digest (1 μg)a. direct analysis; b. after enrichment by MoS2/Au/4-MPB; c. after enrichment by MoS2/Au/4-MPB and deglycosylation by PNGase F.

2.2 MoS2/Au/4-MPB納米復合材料用于富集標準蛋白酶切的糖肽

為了考察MoS2/Au/4-MPB納米復合材料對糖肽的富集性能,實驗采用IgG的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物(1 μg)作為標準樣品，并選擇50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)作為富集緩沖液[12,26]。如圖4a所示,在富集前,IgG酶切產(chǎn)物質(zhì)譜圖中被大量的高豐度非糖肽峰占據(jù),當使用MoS2/Au/4-MPB納米復合材料富集后,非糖基化肽段在質(zhì)譜圖上幾乎消失,同時富集到32條歸屬于IgG蛋白的N-糖肽(見圖4b和附表S1,詳見www-chrom-China.com)。

為了進一步驗證MoS2/Au/4-MPB富集所得的糖基化肽段的準確性,將富集所獲得的產(chǎn)物經(jīng)PNGase F酶處理,去除N-糖鏈后再進行MALDI-TOF MS分析,如圖4c所示,去糖基化后可以鑒定到2條肽段的質(zhì)譜峰(m/z=1 158和1 190),與文獻[27]相符合,同時原有的糖基化肽段質(zhì)譜峰消失,進一步說明富集產(chǎn)物質(zhì)譜圖中的各個質(zhì)譜峰均歸屬于IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物中的N-糖基化肽。上述結果表明,4-巰基苯基硼酸中獨特的硼酸基團對N-糖肽具有高度的選擇性,MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料對N-糖基化肽段具有優(yōu)異的富集性能。

圖 5 MoS2/Au/4-MPB富集IgG胰蛋白酶消化物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of IgG tryptic digest enriched by MoS2/Au/4-MPBa. 1 pmol; b. 100 fmol; c. 5 fmol.

為了考察MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料對N-糖基化肽段的富集靈敏度,實驗制備了系列不同濃度的IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物,對富集材料的富集靈敏度進行了考察。如圖5所示,當IgG的用量為1 pmol(見圖5a)和100 fmol(見圖5b)時,通過MoS2/Au/4-MPB分別富集到18條和12條N-糖肽;當IgG的用量低至5 fmol(見圖5c)時,仍有2個N-糖基化肽段可以被精確檢測到,表明了MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料對低豐度糖肽的具有高的富集能力。與之前報道的有關富集材料TCNBA[9]、GO/Fe3O4/Au/PEG[13]相比,MoS2/Au/4-MPB的檢測靈敏度要高2～50倍。表明MoS2/Au/4-MPB在分析微量N-糖肽樣本中有巨大優(yōu)勢。

圖 6 MoS2/Au/4-MPB富集IgG和BSA胰蛋白酶消化物混合物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 6 MALDI-TOF-MS spectra of N-glycopeptides enriched from the mixture of tryptic digested IgG and bovine serum albumin (BSA) by MoS2/Au/4-MPBa. before enrichment; b and c. after enrichment (amount of substance ratios of IgG to BSA were 1∶100 and 1∶1000).

為了進一步驗證MoS2/Au/4-MPB功能納米復合材料的選擇性以及適用性,實驗以物質(zhì)的量之比1∶100和1∶1 000(IgG∶BSA)的混合酶解液作為樣本,對MoS2/Au/4-MPB納米復合材料進行考察。因為非糖肽的高豐度抑制,在富集前均不能檢測到糖肽(見圖6a);當使用MoS2/Au/4-MPB功能納米材料富集后,非糖基化肽段消失,由圖6b和6c可以看出,當物質(zhì)的量之比為1∶100和1∶1 000時,分別鑒定出11個和3個N-糖肽,且無其他非糖肽峰出現(xiàn)。與之前報道的材料TCNBA[9]、AAPBA-硅膠雜化親和整體柱[27]相比,MoS2/Au/4-MPB在標準蛋白(IgG)胰蛋白酶酶切產(chǎn)物中具有更高的選擇性(100倍)。

MoS2/Au/4-MPB對于糖基化肽段的負載能力也是功能化納米復合材料的重要特性之一。實驗分別將不同質(zhì)量的新型功能化納米材料與2 μg IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物混合,富集洗脫后通過質(zhì)譜分析。在5次的重復試驗中,選擇富集肽段中6條質(zhì)譜信號值強的肽段作為檢測指標,當新型功能化納米材料的使用量為20 μg時選擇肽段質(zhì)譜峰信號強度達到最大值(見圖7)。此時經(jīng)過計算MoS2/Au/4-MPB對IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物最大負載量約為100 μg/mg。負載量實驗結果表明新型功能納米復合材料表面存在著大量的4-巰基苯硼酸活性基團,有利于對生物樣品中N-糖基化肽段的選擇性富集。

圖 8 尿液外泌體的(a)透射電鏡圖和(b)粒徑分布圖Fig. 8 (a) TEM image and (b) particle size distribution of urine exosomes

圖 7 MoS2/Au/4-MPB的質(zhì)量對IgG胰蛋白酶 消化物富集效果的影響(n=5)Fig. 7 Effect of quality of MoS2/Au/4-MPB on the enrichment effects of IgG trypsin digest (n=5)

2.3 MoS2/Au/4-MPB納米復合材料用于富集尿液外泌體蛋白酶切產(chǎn)物中的N-糖肽

外泌體是細胞分泌的具有雙層生物膜的囊泡,大小為30～150 nm[29],能運載細胞內(nèi)的多種生物大分子,如脂類、microRNA、蛋白質(zhì)等[18,30,31]。越來越多的研究[32-35]證實外泌體可以作為許多疾病的潛在生物標志物。但是目前有關尿液外泌體糖蛋白質(zhì)組的研究較少,為了進一步考察納米復合材料在復雜生物樣本中對糖基化肽段的富集性能,實驗選取了健康人尿液外泌體蛋白作為研究對象。與此同時為了驗證使用超速離心所獲樣本為外泌體,將所獲樣本進行了納米顆粒粒徑分析以及透射電鏡表征(見圖8),證明所獲樣本為尿液外泌體。

將1 mg新型功能納米材料與50 μg尿液外泌體蛋白質(zhì)提取物的胰蛋白酶酶切產(chǎn)物進行混合富集,將富集所得的肽段樣本使用LC-MS/MS進行質(zhì)譜鑒定。在3次重復實驗中分別從279、270、279個蛋白質(zhì)中鑒定到536、515、487個N-糖基化肽段,任意兩次至少鑒定出85%的N-糖基化肽段,將3次數(shù)據(jù)進行綜合后,一共鑒定到768個N-糖肽歸屬于377個N-糖蛋白。表明制備的新型功能化材料對生物樣本有很好的富集選擇性。上述結果表明,基于4-MPB的新型功能納米材料在糖基化蛋白組研究中有著巨大的應用潛力。

3 結論

利用超薄二維二硫化鉬納米材料作為固相基質(zhì)結合4-巰基苯硼酸發(fā)展了一種用于N-糖基化肽段富集的新型功能納米復合材料MoS2/Au/4-MPB。新型功能納米復合材料制備條件溫和,操作簡單。實驗結果表明，新型功能納米材料對于低豐度N-糖基化肽段的分離與鑒定具有普適性。此外,將這種新型功能化納米材料應用于尿液外泌體蛋白酶解產(chǎn)物中N-糖基化肽段的選擇性富集和質(zhì)譜分析,鑒定到了768種N-糖基化肽段，歸屬于377個N-糖蛋白,說明本工作發(fā)展的新型功能化納米材料在復雜生物樣品的糖基化蛋白質(zhì)組研究中具有很大應用潛力。