BRAF V600E和TERT啟動子突變與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系*

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的病理類型，占全部甲狀腺癌的80%以上[1]。近年來，國內(nèi)外甲狀腺癌的患病率不斷攀升，絕大部分甲狀腺癌惡性程度較低，進展緩慢，經(jīng)規(guī)范化治療后患者預(yù)后良好，但約10%的甲狀腺癌具有高侵襲性的生物學(xué)行為[2]，早期即可侵犯喉返神經(jīng)、氣管和食管，并出現(xiàn)側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及死亡率高。對PTC患者進行個體化治療，在早期及時干預(yù)以降低復(fù)發(fā)、死亡的風險和謹慎手術(shù)以避免術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn)之間找到平衡，是目前臨床醫(yī)師關(guān)注的重點。了解甲狀腺癌的分子發(fā)病機制，篩選提示預(yù)后的分子標志物，對疾病進行風險分層可有效鑒別出預(yù)后較差的PTC患者，為選擇精準的治療方式提供依據(jù)。

BRAF基因突變發(fā)生于約29%～83%的甲狀腺癌，是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的突變類型[3]。BRAF V600E突變激活RAS/RAF/促分裂原活化蛋白激酶途徑從而引起細胞的惡性增殖，有研究認為攜帶BRAF V600E突變的PTC具有更高的侵襲性，提示腫瘤不良預(yù)后[4]。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的催化亞基，通過激活端粒酶來保持端粒的完整，使腫瘤細胞獲得無限增殖的能力[5]。TERT啟動子突變是腫瘤特異性的體細胞突變，在正常組織中未發(fā)現(xiàn)表達。TERT啟動子區(qū)域最常見的突變位點位于5號染色體1295228C＞T（C228T）和1295250C＞T（C250T）。有研究報道其與腫瘤侵襲性密切相關(guān)，在惡性黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌中均有表達[6]。在甲狀腺癌中，TERT啟動子突變更常見于未分化癌、間變癌以及BRAF V600E突變型PTC中。提示BRAF V600E突變和TERT啟動子突變可能具有某種協(xié)同作用，形成獨特的遺傳背景，PTC具有更強的侵襲性?；诖?，本研究回顧性分析728例PTC患者的BRAF V600E和TERT啟動子突變情況，及其與臨床病理特征的關(guān)系，以期了解甲狀腺癌的分子發(fā)病機制，篩選提示預(yù)后的分子標志物，對疾病進行風險分層，為患者選擇精準的治療方式提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2014年12月至2016年12月共2 396例患者因甲狀腺癌于山西省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療。共728例PTC患者納入本研究。納入標準：1）初次行甲狀腺癌手術(shù)；2）術(shù)后病理證實為甲狀腺癌；3）可獲取完整的臨床病理學(xué)資料。排除標準：1）甲狀腺轉(zhuǎn)移癌；2）合并其他類型的甲狀腺癌，如髓樣癌、未分化癌等。

所有患者均接受甲狀腺腺葉+峽部切除或全甲狀腺切除，均行預(yù)防性或治療性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，側(cè)頸淋巴結(jié)僅行治療性清掃。初次治療后，728例患者均獲得隨訪，截至2019年11月，隨訪時間為8～44個月。腫瘤直徑、癌灶數(shù)量、腺外侵犯、中央?yún)^(qū)及側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理亞型均由2位病理科醫(yī)師獨立報告，結(jié)果不一致時由第3位病理醫(yī)師討論并診斷。腺外侵犯定義為術(shù)中肉眼可見腫瘤侵犯帶狀肌、喉、氣管、食管、喉返神經(jīng)等和（或）鏡下。腫瘤直徑在多灶甲狀腺癌中定義為最大癌灶的直徑。腫瘤復(fù)發(fā)定義為組織學(xué)/細胞學(xué)/放射性碘顯像證實的復(fù)發(fā)或腫瘤持續(xù)存在。隨訪時間的計算為從術(shù)后至發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的時間間隔，無復(fù)發(fā)時從術(shù)后至最后一次隨訪的時間間隔。TNM分期的依據(jù)為美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第8版甲狀腺癌分期。

1.2 DNA提取和突變分析

采用QIAGEN公司（德國）DNA FFPE Tissue Kit（QIAGEN）試劑盒提取新鮮PTC腫瘤組織DNA，嚴格按照說明書進行操作。采用紫外分光光度計測量DNA的濃度、純度和波長在260 nm和280 nm的光密度（OD），經(jīng)檢驗所有DNA樣本的純度均達到要求。

BRAF基因使用艾德生物（廈門）人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒檢測突變，TERT基因使用艾德生物TERT突變檢測試劑盒檢測突變。使用熒光定量PCR儀（型號：ABI 7000）進行PCR擴增。反應(yīng)條件：第1階段95℃5 min，1個循環(huán)；第2階段95℃25 s，64℃20 s，72℃20 s，15個循環(huán)；第3階段93℃25 s，60℃35 s，72℃20 s，31個循環(huán)。第3階段60℃時進行信號收集。樣本Ct值≥28，樣本為陰性；Ct值＜28，則樣本為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗及Fisher 確切概率法進行單因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC患者中BRAF V600E、TERT C228T 及TERT C250T突變情況

本研究共納入PTC研究對象728例，其中男性141例（19.4%），女性587例（80.6%）。年齡13～82歲，平均年齡（43.6±8.6）歲，其中年齡＜55歲567例（77.9%），≥55歲161例（22.1%）。平均腫瘤直徑（1.58±0.25）cm，其中腫瘤直徑≤2 cm 459例（63.1%），＞4 cm 36例（4.9%）。在所有PTC患者中，經(jīng)典型617例（84.7%），濾泡亞型72例（9.9%），高柱狀型21例（2.9%），彌漫硬化型18例（2.5%）。發(fā)生腺外侵犯204例（28.0%），其中侵犯頸前帶狀肌42例（5.8%），侵犯喉返神經(jīng)22例（3.0%），侵犯食管/氣管19例（2.6%）。多灶性甲狀腺乳頭狀癌256例（35.2%），PTC合并橋本甲狀腺炎276例（37.9%），中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移240例（33.0%），側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例（11.8%）。隨訪或就診時發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移37例（5.1%），隨訪期間發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)39例（5.4%），出現(xiàn)殘余甲狀腺腺葉復(fù)發(fā)22例（3.0%）。側(cè)頸及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)復(fù)發(fā)27例（3.7%），其中患側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例（2.6%），對側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例（0.4%），雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例（0.7%），僅發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例（1.6%）。隨訪期間1例患者死于乳腺癌伴多臟器轉(zhuǎn)移，1例死于重癥肺炎，2例死于心力衰竭，無患者死于PTC。

本研究728例患者中，BRAF V600E突變型308例（42.3%）。TERT C228T突變型78例（10.7%），TERT C250T突變型4例（0.5%），兩種突變相互排斥，不共存。TERT啟動子突變82例（11.2%），其中59例合并BRAF V600E突變。BRAF V600E突變組中，TERT啟動子突變率為19.2%；在BRAF V600E 野生型中，TERT啟動子突變率為5.5%（P＜0.001，圖1）。

圖1 BRAF V600E及TERT啟動子突變占比

2.2 TERT啟動子突變和BRAF V600E突變與PTC患者臨床病理因素之間的關(guān)系

如表1所示，TERT啟動子突變與患者發(fā)病年齡（P=0.034）、腺外侵犯（P=0.026）、腫瘤直徑（P=0.028）、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.012）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.001）、TNM分期（P＜0.001）、病理亞型（P=0.003）以及腫瘤復(fù)發(fā)（P=0.002）顯著相關(guān)。而與患者性別、多灶性、伴橋本甲狀腺炎、側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

BRAF V600E突變與PTC患者的腺外侵犯（P=0.001）、腫瘤直徑（P＜0.001）、橋本甲狀腺炎（P＜0.001）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.010）、TNM分期（P=0.009）和腫瘤復(fù)發(fā)（P=0.001）顯著相關(guān)。與患者年齡、性別、多灶性、中央?yún)^(qū)及側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理亞型間的關(guān)系差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.3 僅TERT啟動子突變、僅BRAF V600E突變和TERT與BRAF V600E突變共存與PTC患者臨床病理因素之間的關(guān)系

與無TERT啟動子突變且無BRAF V600E突變組相比，僅攜帶TERT啟動子突變與腺外侵犯（P=0.008）、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移（P=0.003）、更高的TNM分期（P＜0.001）及腫瘤復(fù)發(fā)（P=0.005）顯著相關(guān)。與無突變組相比，僅攜帶BRAF V600E突變與腺外侵犯（P＜0.001）、多灶性（P=0.041）、合并橋本甲狀腺炎（P＜0.001）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.003）、更高分期（P=0.011）及腫瘤復(fù)發(fā)（P＜0.001）顯著相關(guān)。同時伴有BRAF V600E和TERT啟動子突變與發(fā)病年齡（P=0.024）、腺外侵犯（P=0.022）、合并橋本甲狀腺炎（P=0.005）、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.018）及更高臨床分期（P=0.002）顯著相關(guān)（表3）。

表1 TERT啟動子突變與臨床病理因素之間的關(guān)系例（%）

表2 BRAF V600E突變與臨床病理因素之間的關(guān)系例（%）

表3 僅TERT啟動子突變、僅BRAF V600E突變和TERT與BRAF V600E突變共存與PTC患者臨床病理因素之間的關(guān)系例（%）

表3 僅TERT啟動子突變、僅BRAF V600E突變和TERT與BRAF V600E突變共存與PTC患者臨床病理因素之間的關(guān)系例（%）（續(xù)表3）

3 討論

本研究為目前國內(nèi)對PTC 中TERT啟動子突變較大樣本量的研究，證實TERT啟動子突變對高侵襲性PTC 腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。目前國內(nèi)外研究報道PTC患者中TERT啟動子突變率約7.3%～25.5%[5，7-10]，本研究中TERT啟動子突變率為11.2%，較文獻報道較低，可能因為TERT啟動子突變更常發(fā)生在腫瘤晚期，而本研究中臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的患者僅占9.2%，但其突變率高達49.3%，說明TERT啟動子突變對中晚期甲狀腺癌具有深遠的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在PTC 不同的病理亞型中，高柱狀細胞亞型TERT啟動子突變率最高（33.3%）。高柱狀亞型是一種相對罕見，但惡性程度較經(jīng)典型和濾泡亞型均更高的病理亞型，表明TERT基因在高侵襲的病理亞型中可能扮演重要的角色，也再次說明TERT啟動子突變對PTC 的進展與侵襲發(fā)揮重要的作用。目前BRAF V600E突變對高侵襲性甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系尚存爭議[11-12]，本研究證實BRAF V600E 與PTC高侵襲性的特征顯著相關(guān)，為之前的研究提供了有力的支持。

有多項報道PTC中BRAF V600E突變與TERT啟動子突變之間的關(guān)聯(lián)。有研究表明，BRAF V600E與TERT啟動子突變存在協(xié)同作用，與PTC的不良預(yù)后密切相關(guān)[5，13]。然而也有研究認為BRAF V600E和TERT啟動子突變無明顯關(guān)聯(lián)。但這些研究的樣本量較少，其中TERT與BRAF突變的病例更少，以至于缺乏統(tǒng)計學(xué)效力。因此，此爭議的解決依賴于大樣本的研究。本研究發(fā)現(xiàn)BRAF V600E和TERT啟動子突變之間的存在顯著關(guān)聯(lián)。

BRAF V600E與TERT啟動子突變的協(xié)同作用可在分子水平得到解釋。TERT通過添加端粒維持染色體的長度，促進細胞增殖減少細胞凋亡，使細胞獲得永生性[8，14]。TERT啟動子C228T和C250T突變通過產(chǎn)生E-twenty-six（ETS）轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點促進TERT基因的表達[5-6]，一些ETS因子同時也是MAPK信號通路上的靶點。而BRAF V600E突變引起的MAPK信號通路異常激活在PTC發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，因此TERT啟動子突變可能與PTC發(fā)展中涉及MAPK信號傳導(dǎo)的機制相關(guān)。TERT啟動子突變產(chǎn)生ETS轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，在被BRAF V600E促進MAPK信號傳導(dǎo)激活后啟動或增強表達[13，15]。TERT啟動子和BRAF V600E突變之間的這種關(guān)聯(lián)為TERT表達的擴增創(chuàng)造有利環(huán)境。本研究結(jié)果與上述假設(shè)一致，BRAF V600E突變組中TERT啟動子突變率更高，反之亦然。

本研究中，僅發(fā)生TERT啟動子突變和僅發(fā)生BRAF V600E突變的PTC 與腫瘤復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但同時伴有TERT和BRAF V600E突變與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析其原因可能為本研究隨訪中位時間2年，隨訪時間較短，可能嚴重低估了TERT和BRAF 對患者復(fù)發(fā)的影響，需要更長時間的隨訪，對資料進行生存分析，以進一步證實TERT和BRAF基因?qū)颊哳A(yù)后的影響。

本研究證實BRAF V600E和TERT啟動子突變與高侵襲性的臨床病理因素相關(guān)，BRAF V600E和TERT 存在協(xié)同作用，對于指導(dǎo)治療和評估預(yù)后具有積極作用。