睡眠缺乏和高脂飲食對大鼠喉組織的影響△

宋徽 蔣興旺# 李麗娜 張延平 黎立 陳浩 陳援凱 李和運 王振華

隨著社會的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，熬夜、失眠、高脂飲食等不良生活習慣和飲食習慣越來越常見， 慢性咽喉炎、咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease, LPRD)的發(fā)病率也明顯增加，Altman等[1]發(fā)現(xiàn)在1990年至2001年期間因LPRD就診于耳鼻喉科的人次數(shù)增加了約500%，提示慢性咽喉炎和LPRD的發(fā)病與人們的生活方式和飲食習慣存在一定的相關性。高脂飲食被認為是胃食管反流性疾病發(fā)生的主要危險因素，睡眠紊亂是LPRD發(fā)病的危險因素，但上述兩種不良習慣對大鼠咽喉部的影響尚未見報道，本研究擬通過建立睡眠剝奪和高脂飲食大鼠動物模型，觀察睡眠剝奪及高脂飲食對大鼠咽喉組織結構的影響，為進一步探討慢性咽喉炎和LPRD的發(fā)病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選擇成年雄性SD大鼠32只(購自維通利華動物有限公司，北京)，體重250～350克，隨機分為睡眠剝奪組、高脂飲食組、睡眠剝奪加高脂飲食組和正常對照組各8只。所有動物飼養(yǎng)于自動控制明暗環(huán)境中，恒溫恒濕，自由獲食和飲水，適應環(huán)境3天后開始實驗。所有實驗動物的處理經(jīng)解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心動物倫理委員會批準，并與國家實驗動物使用指南一致。

1.2睡眠剝奪動物模型的建立 本實驗采用改良多平臺水平環(huán)境法建立大鼠慢性睡眠剝奪動物模型[2]。方法：制作127 cm×45 cm×45 cm玻璃箱，在其中部均勻設置4個高8.0 cm，直徑6.3 cm圓形平臺，平臺周圍的水平面低于平臺約1.0 cm，水溫保持在20 ℃，大鼠可以在平臺上自由生活，獲取食物和水，不睡眠，如果睡眠則肌肉松弛落入平臺周圍水中，大鼠受水刺激后會迅速返回平臺，保持清醒狀態(tài)，以此形成睡眠剝奪。大鼠先在鼠箱適應3天后開始實驗，每日上午9點至下午5點將大鼠置于鼠箱內(nèi)，完成8小時睡眠剝奪后將實驗動物取出放回常規(guī)鼠籠中喂養(yǎng)，并對鼠箱清理換水。造模持續(xù)時間為3個月，實驗期間采用智能網(wǎng)絡攝像頭監(jiān)控大鼠睡眠剝奪情況，對于無法配合實驗的動物及時剔除。

1.3高脂飲食動物模型的建立 高脂飲食組及正常對照組的大鼠置于普通鼠籠喂養(yǎng)，其中高脂飲食組給予60%供能比的高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)，主要成分為酪蛋白、糊精、蔗糖、纖維素、豆油、豬油、多種礦物質、多種維生素、膽堿等，其中含蛋白26%、碳水化合物26%、脂肪35%。正常對照組及睡眠剝奪組均給予普通大鼠飼料喂養(yǎng)(北京華阜康生物科技股份有限公司)，主要成分為大豆粕、魚粉、植物油、麩皮、玉米、次粉、多種維生素和礦物質，其中粗蛋白≥18%、粗纖維≤5%、脂肪≥4%，各組持續(xù)喂養(yǎng)3個月。

1.4睡眠剝奪加高脂飲食組動物模型建立 睡眠剝奪組加高脂飲食組動物按照上述建立睡眠剝奪動物模型的方法將大鼠置于睡眠剝奪箱內(nèi)剝奪白天8小時睡眠，同時喂養(yǎng)上述含35%脂肪的高脂飼料，持續(xù)3個月。

1.5組織病理學檢查 持續(xù)建模3個月后，觀察并記錄各組大鼠一般情況變化，然后以1%戊巴比妥鈉腹腔注射，處死各組實驗動物，分別取大鼠舌、牙齦、軟腭、咽、喉、食管組織粘膜，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，厚4 μm，并行HE染色，光鏡下觀察組織病理學變化情況，比較四組之間的差異。

2 結果

2.1大鼠一般情況的變化 睡眠剝奪組動物體重較實驗前明顯減輕(P<0.05)，高脂飲食組大鼠體重明顯增加(P<0.05)，其余兩組動物體重均較實驗前增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。睡眠剝奪組及睡眠剝奪加高脂飲食組大鼠毛發(fā)干枯，警覺性及反應性下降，暴躁易怒，喜爭斗，進食及飲水量少，尤以睡眠剝奪組表現(xiàn)明顯；高脂飲食組與正常對照組大鼠行為表現(xiàn)正常，情緒穩(wěn)定。

2.2組織病理學變化 與對照組比較，其他三組大鼠的聲門上區(qū)、聲門區(qū)、咽、舌、齒齦、軟腭、食管粘膜未見明顯的形態(tài)學改變。對照組聲門下粘膜薄而均勻，固有層和粘膜下層疏松，細胞數(shù)量不多，腺體主要由粘液腺或混合腺組成，腺體邊界清晰，部分腺體管腔明顯擴張。而在其他三組動物聲門下粘膜明顯變厚，粘膜上皮和粘膜下層出現(xiàn)不同程度的病理變化(圖1)。

2.2.1上皮細胞組織病理改變 睡眠剝奪組大鼠喉粘膜上皮假復層纖毛柱狀上皮纖毛減少或消失，大部分假復層纖毛柱狀上皮被單層扁平上皮替代，部分動物聲門下粘膜上皮被瘢痕組織覆蓋；高脂飲食組和睡眠剝奪加高脂飲食組上皮病變輕微，僅部分上皮纖毛缺失或部分被單層上皮取代，細胞形態(tài)變?yōu)榘鶢?，細胞缺失不?guī)則，出現(xiàn)更多的杯狀細胞(圖2)。

2.2.2粘膜下腺體和腺管組織病理改變 睡眠剝奪、高脂飲食及睡眠剝奪加高脂飲食三組大鼠聲門下粘膜下層可見瘤樣增生腺體，邊界清晰，周圍被炎性細胞擠壓，有些擴張的管腔可見大量的分泌物或炎性細胞和脫落的腺細胞，以睡眠剝奪組大鼠粘膜下腺體的病理變化程度最為嚴重，部分大鼠甚至可見粘膜下腺體結構完全破壞，余兩組粘膜下腺體受損嚴重程度較睡眠剝奪組輕，且兩組間無明顯差異(圖3、4)。

圖1 四組大鼠喉聲門下粘膜光鏡觀察(HE×40) a.睡眠剝奪組,可見粘膜明顯增厚,大量炎性細胞浸潤,粘膜上皮部分脫落; b.高脂飲食組; c.睡眠剝奪加高脂飲食組; d.對照組

圖3 四組大鼠喉聲門下黏膜下腺體光鏡觀察 a.睡眠剝奪組(HE×400); b.高脂飲食組(HE×400); c.睡眠剝奪加高脂飲食組(HE×400); d.對照組(HE×200)

圖4 睡眠剝奪組大鼠喉聲門下粘膜上皮組織病理 a.正常上皮消失,取而代之的是無纖毛的細胞,粘膜下層可見腺體增生伴炎性細胞浸潤; b.粘膜損傷更嚴重; c.大部分細胞、腺體消失,只剩下纖維支架

圖5 四組大鼠喉聲門下黏膜下層炎性反應光鏡觀察(HE×200) a.睡眠剝奪組,粘膜假復層纖毛柱狀上皮被無纖毛的上皮所取代,粘膜下層可見炎癥細胞浸潤; b.高脂飲食組; c.睡眠剝奪加高脂飲食組,可見上皮下淋巴細胞浸潤,毛細血管豐富; d.對照組

2.2.3聲門下粘膜炎性反應 三個實驗組大鼠喉部聲門下粘膜上皮下的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤明顯多于對照組，提示喉部發(fā)生了急性和慢性炎癥，炎性細胞浸潤固有層和粘膜下層，在某些區(qū)域增殖成團，可見上皮下水腫伴出血、充血和淋巴管擴張，大量毛細血管出現(xiàn)，觸發(fā)了慢性修復反應(圖5)，且睡眠剝奪、高脂飲食及睡眠剝奪加高脂飲食三組聲門下粘膜炎性反應基本相同。

3 討論

慢性咽喉炎和LPRD的發(fā)生與多種因素相關，其中生活方式和飲食習慣與其關系一直備受關注，我國2015年LPRD專家共識意見也指出改變不良生活方式和飲食習慣是治療LPRD的首要原則[3]，但是睡眠缺乏、高脂飲食究竟會引起咽喉部何種病理改變，目前還未見相關報告。睡眠剝奪可以造成人體的應激反應，使人處于一種興奮狀態(tài)，但是隨著應激時間的延長、興奮狀態(tài)的持續(xù)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)以及內(nèi)環(huán)境都將發(fā)生變化，造成機體的生理和病理改變，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等都會產(chǎn)生影響。從本研究結果看，經(jīng)睡眠剝奪處理3個月后，大鼠行為表現(xiàn)和性情發(fā)生變化，喉聲門下黏膜出現(xiàn)嚴重的組織病理改變，粘膜增厚、細胞破壞、腺體增生，炎癥細胞浸潤可能與以下機制有關：首先，睡眠缺乏可引起機體能耗增加，產(chǎn)生過量的自由基誘發(fā)組織細胞凋亡，造成組織病變[4]；其次，睡眠缺乏引起睡眠結構紊亂，干擾松果體分泌褪黑素，可能導致食管粘膜對酸反流損害的易感性增高[5]、食管下括約肌一過性松弛發(fā)生率上升[6]、機體抗氧化能力降低[7]；第三，睡眠缺乏可干擾胃腸動力，引起胃排空速率明顯降低[8]、直腸順應性增加[9]，使機體容易發(fā)生胃排空失調和便秘，為反流發(fā)生提供了便利條件[10]；第四，動物實驗表明，睡眠剝奪可以改變動物腸道菌群，導致革蘭氏陰性桿菌數(shù)量增多，其細胞壁脂多糖成分相應增加，并通過激活炎癥信號通路、誘發(fā)自主神經(jīng)功能異常、造成胃動力紊亂[11]，促使反流發(fā)生。

飲食成分與胃食管反流病(GERD)有關。據(jù)報道，在西方人中，脂肪消耗量的增加與GERD癥狀呈劑量依賴關系，攝入高纖維食物(如蔬菜和谷物)可降低GERD風險[12]。我國的流行病學調查也表明，中國GERD發(fā)病率的增加可能與肉類、食用油、鹽和鈣的消費量增加以及蔬菜、水果和谷物的攝入量減少有關[13]；食管中的酸堿度與攝入的膳食脂肪量密切相關，其原因可能是高脂飲食導致胃排空延緩，使食管下括約肌張力降低，增加其一過性松弛的發(fā)生率，使胃內(nèi)容物更容易反流至食管，因此高脂飲食可能通過增加胃內(nèi)容物反流導致咽或喉部組織出現(xiàn)炎性反應。從本研究結果看，高脂飲食及睡眠剝奪加高脂飲食組大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)三個月后，大鼠喉聲門下出現(xiàn)了粘膜上皮結構輕度破壞，粘膜下腺體增生、炎性細胞浸潤明顯增加，這與Hu等[14]通過手術制作胃食管反流動物模型咽喉部的組織病理改變相似，推測上述病變的發(fā)生與高脂飲食引起的胃內(nèi)容物反流至咽喉部導致局部粘膜組織發(fā)生了病理改變相關。

很多LPRD患者有多種不良生活習慣，其中睡眠缺乏和高脂飲食最常見，我們前期研究使用改良多平臺水面法部分剝奪大鼠睡眠，同時給予大鼠35%的高脂飲食，2個月后監(jiān)測發(fā)現(xiàn)動物咽喉部反流指數(shù)、最長反流時間和24小時總反流次數(shù)較對照組明顯增多，提示大鼠發(fā)生了LPRD[15]。本研究將大鼠同時給予部分睡眠剝奪和高脂飲食制成睡眠剝奪加高脂飲食動物模型，3個月后可見大鼠喉部出現(xiàn)明顯的炎癥反應，與文獻報道咽喉反流動物模型的結果類似[16,17]，但病變程度較單純睡眠剝奪組動物輕。有研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪大鼠的病變以營養(yǎng)不良較為突出[18]，主要繼發(fā)于能量消耗增加，給予大鼠高脂肪或高蛋白飲食，發(fā)現(xiàn)高脂肪飲食的大鼠比高蛋白飲食的大鼠多存活10天，代謝率明顯升高，提示睡眠剝奪造成了大鼠能量消耗增加，而高脂飲食可以在一定程度上為動物補充部分能量，從而減少體力消耗，使體內(nèi)自由基產(chǎn)生減少，從而使局部炎癥反應減輕。

本研究結果顯示，睡眠缺乏和高脂飲食對大鼠喉組織的影響主要表現(xiàn)在大鼠喉聲門下粘膜炎性反應，病變程度以睡眠剝奪組最為嚴重，提示睡眠缺乏和高脂飲食可能是導致LPRD和慢性咽喉炎的因素之一。然而，具體發(fā)病機制有待進一步研究探討。