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    干酪乳桿菌16發(fā)酵豆乳工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

    2020-07-26 08:58:34侯凱榮妥彥峰牟光慶
    食品與機(jī)械 2020年6期
    關(guān)鍵詞:豆乳總酚冷藏

    侯凱榮 妥彥峰 牟光慶

    (大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 大連 116034)

    豆乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),如大豆蛋白及不飽和脂肪酸等,對人體健康有益[1]。利用乳酸菌發(fā)酵豆乳,可將大豆中的異黃酮、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)生物轉(zhuǎn)化,更利于人體吸收,具有增加免疫力、抗氧化等作用[2-3]。

    唐宇等[4]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌16發(fā)酵豆乳具有一定的抗氧化功能,主要是由于糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)變?yōu)檐赵痛蠖巩慄S酮導(dǎo)致其抗氧化能力發(fā)生改變。徐寅等[5]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后豆乳的抗氧化能力較發(fā)酵前增強(qiáng)。Dajanta等[6]對發(fā)酵豆類進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),總酚含量與其抗氧化能力相關(guān)。孫曉琦等[7]發(fā)現(xiàn)乳桿菌發(fā)酵黃漿水可顯著提高其抗氧化能力,且與總酚含量呈正相關(guān)。李彤等[8]采用植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)合豆乳時,其游離氨基酸含量上升,且總抗氧化能力較發(fā)酵前有所增加。

    在前期研究基礎(chǔ)上,試驗(yàn)擬以總酚、游離氨基酸含量為指標(biāo),對L.casei16發(fā)酵豆乳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并測定優(yōu)化后發(fā)酵豆乳的總還原力和羥自由基清除能力,旨在為深入開發(fā)具有良好抗氧化功能特性的發(fā)酵豆乳提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 原料與試劑

    大豆:市售;

    沒食子酸、鄰苯二甲醛、鄰二氮菲:分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;

    MRS培養(yǎng)基:生物試劑,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;

    硫酸亞鐵、三氯化鐵:分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

    β-巰基乙醇、三氯乙酸、四硼酸鈉、丙酮、過氧化氫、鐵氰化鉀:分析純,天津市大茂化學(xué)廠;

    福林酚:分子生物學(xué)級,大連美侖生物有限公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    物性儀:TA-XT plus型,英國超技公司;

    全自動家用豆?jié){機(jī):DJ11B型,九陽股份有限公司;

    生化培養(yǎng)箱:FQC型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

    超凈工作臺:SWCJ1D2D型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;

    酶標(biāo)儀:1510型,美國Thermo Fisher Scientific 公司;

    精密pH計(jì):S210型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

    離心機(jī):5804型,德國艾本德有限公司。

    1.1.3 試驗(yàn)菌株

    L.casei16:保藏號CCTCC M2018557,大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院大連益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 工藝流程

    大豆→浸泡→磨漿→冷卻→接菌→發(fā)酵→冷藏→取樣→測定

    1.2.2 操作要點(diǎn)

    (1) 室溫下,按干豆與水重量比為1∶2泡發(fā)黃豆12 h,按干豆與水重量比為1∶4進(jìn)行制漿,采用雙層濾布對豆?jié){進(jìn)行過濾,于高壓蒸汽滅菌鍋中105 ℃滅菌15 min。

    (2) 菌種活化采用MRS液體培養(yǎng)基,以2%接種量將L.casei16連續(xù)活化3代(37 ℃,18 h)用于豆?jié){發(fā)酵。

    1.2.3 單因素試驗(yàn)

    (1) 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響:豆乳滅菌處理后冷卻至室溫,以2%接種量接種L.casei16,37 ℃培養(yǎng)箱中分別發(fā)酵6,12,24 h,4 ℃條件下冷藏6 h。

    (2) 冷藏時間對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響:豆乳滅菌處理后冷卻至室溫,以2%接種量接種L.casei16,37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h,4 ℃條件下分別冷藏6,12,24 h。

    (3) 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響:豆乳滅菌處理后冷卻至室溫,以2%接種量接種L.casei16,分別于37,40,43 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h,4 ℃ 條件下冷藏6 h。

    1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、冷藏時間為試驗(yàn)因素,以總酚和游離氨基酸含量為評價標(biāo)準(zhǔn),采用L9(33)正交試驗(yàn)進(jìn)行L.casei16發(fā)酵豆乳工藝條件優(yōu)化。

    1.2.5 物性指標(biāo)檢測 參照華曉曼等[9]的方法略作修改,利用物性儀進(jìn)行硬度、稠度、內(nèi)聚性、黏度指數(shù)測定。探頭A/BE、測試速度1.00 mm/s、返回高度30.00 mm、測試距離15.00 mm、觸發(fā)力5.00 g。

    1.2.6 pH測定 采用pH計(jì)法。

    1.2.7 總酚含量測定 參照王振帥等[10]的方法略作修改,取10 g發(fā)酵豆乳,加入10 mL 50% 丙酮,40 ℃振蕩4 h,調(diào)節(jié)pH至4.5,1 500 r/min離心10 min,取上清液100 μL稀釋至1 mL,分別加入福林酚0.5 mL,搖勻,加入12% Na2CO3溶液1 mL,用水稀釋至12.5 mL,搖勻,避光反應(yīng)2 h,測定765 nm處吸光值,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為y=5.105 1x+0.009 7,R2=0.996 9。

    1.2.8 游離氨基酸測定 參照Xing等[11]的方法略作修改,取10 g發(fā)酵豆乳于50 mL離心管中,調(diào)節(jié)pH至4.5,靜置20 min,4 ℃、3 000 r/min離心30 min。取50 μL上清液加入1 mL鄰苯二甲醛試劑,室溫反應(yīng)2 min,測定340 nm處吸光度,以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為y=1.294 7x+0.007 7,R2=0.996 8。

    1.2.9 抗氧化活性測定

    (1) 總還原能力:參照文獻(xiàn)[12]。

    (2) 羥自由基清除能力:參照文獻(xiàn)[13]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有試驗(yàn)均為3次重復(fù),采用SPSS 2.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并采用Orgin 9.0軟件繪圖,字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表1可知,物性指標(biāo)均隨發(fā)酵時間的延長而升高;pH值隨發(fā)酵時間的延長而顯著下降(P<0.05)。pH值的降低會導(dǎo)致發(fā)酵豆乳中的大豆球蛋白聚集凝結(jié)[2],使分子間作用力不斷加強(qiáng),黏度、硬度增加[14]。隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量均發(fā)生顯著變化(P<0.05),當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時,發(fā)酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量達(dá)最大值,分別為15.56 mg/100 mL 和1.41 mg/mL。這是由于隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)被L.casei16產(chǎn)生的酶逐漸水解,因此游離氨基酸含量較發(fā)酵前升高[15]。而且L.casei16將豆乳中復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子酚類物質(zhì),釋放出更多的酚羥基,故總酚含量較發(fā)酵前有所增加,與張琪等[16]的結(jié)果一致。

    表1 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵豆乳的性能指標(biāo)

    2.1.2 冷藏時間對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表2可知,發(fā)酵豆乳冷藏12 h與冷藏24 h的硬度無顯著性差異;當(dāng)冷藏時間為24 h時,發(fā)酵豆乳的稠度、內(nèi)聚性和黏度指數(shù)均顯著高于(P<0.05)其他冷藏條件下的。發(fā)酵豆乳的pH值隨冷藏時間的延長無顯著性變化,這是由于低溫條件下,發(fā)酵豆乳中L.casei16生長速度降低,乳酸生成速度降低,發(fā)酵豆乳pH值呈相對穩(wěn)定的狀態(tài)[2]。當(dāng)冷藏時間為12 h時,發(fā)酵豆乳中總酚含量最高,為14.53 mg/100 mL,與耿彪等[17]的結(jié)論一致。后期發(fā)酵豆乳中總酚含量下降可能是由于發(fā)酵豆乳中總酚發(fā)生氧化所致[18]。發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量隨冷藏時間的延長先降低后升高,可能是冷藏12 h后,發(fā)酵豆乳中發(fā)生了其他化學(xué)變化,從而使游離氨基酸含量升高[19]。

    表2 不同冷藏時間下發(fā)酵豆乳的性能指標(biāo)

    表3 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵豆乳的性能指標(biāo)

    2.1.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆乳質(zhì)構(gòu)、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表3可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時,發(fā)酵豆乳硬度、稠度、黏度指數(shù)均達(dá)最高值。當(dāng)發(fā)酵溫度為30,37 ℃ 時,發(fā)酵豆乳pH值較低,發(fā)酵豆乳中的大豆球蛋白不斷聚集凝結(jié),進(jìn)而導(dǎo)致硬度、稠度、內(nèi)聚性、黏度指數(shù)發(fā)生變化,可能是此時發(fā)酵豆乳中L.casei16生長狀態(tài)良好[2],產(chǎn)酸能力較強(qiáng),導(dǎo)致pH值較低。當(dāng)發(fā)酵溫度為43 ℃時,發(fā)酵豆乳中L.casei16的生長、產(chǎn)酸能力下降,體系中pH偏高。

    由表3還可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為43 ℃時,發(fā)酵豆乳中總酚含量顯著增高(P<0.05),可能是由于發(fā)酵溫度的升高導(dǎo)致發(fā)酵豆乳中分子滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快,并且高溫條件可以弱化或破壞細(xì)胞壁的完整性,使酚類物質(zhì)更容易從發(fā)酵豆乳中轉(zhuǎn)移至溶劑中,二者共同作用下導(dǎo)致了發(fā)酵豆乳中總酚含量的增加[20];發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量隨發(fā)酵溫度的升高而顯著升高。發(fā)酵過程中,Lactobacillus主要是由胞內(nèi)肽酶(乳內(nèi)肽酶、氨基肽酶等)降解寡肽從而產(chǎn)生游離氨基酸[21]。當(dāng)發(fā)酵溫度為43 ℃ 時,發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量最高,為1.04 mg/mL。劉璐[22]研究發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌1.0386的胞壁蛋白酶、氨肽酶的最適溫度分別為40,45 ℃。推測發(fā)酵溫度為43 ℃下游離氨基酸含量升高的原因可能是L.casei16發(fā)酵所產(chǎn)生的酶在43 ℃時保持良好活性。

    2.2 正交試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以總酚、游離氨基酸含量為考察指標(biāo),對發(fā)酵時間、冷藏時間、發(fā)酵溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。試驗(yàn)因素水平見表4,結(jié)果與分析見表5。

    表4 因素水平表

    由表5可知,總酚含量的最優(yōu)方案為A3B1C2,即發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時間24 h,冷藏時間6 h。游離氨基酸含量的最優(yōu)方案為A3B3C2,即發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵24 h,冷藏24 h。由表6可知,各因素對總酚、游離氨基酸含量的影響不顯著(P>0.05)。

    綜合考慮上述兩個正交試驗(yàn)結(jié)果的差異,如表7所示,方案A3B3C2的總酚含量高于方案A3B1C2,但差異不顯著(P>0.05),結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需求,確定最佳的發(fā)酵條件為A3B1C2,即發(fā)酵時間24 h,冷藏時間6 h,發(fā)酵溫度37 ℃,此條件下發(fā)酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL,游離氨基酸含量為1.33 mg/mL。陳佩等[2]發(fā)現(xiàn),經(jīng)24 h發(fā)酵后,L.caseiCCFM0412發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量上升,但低于試驗(yàn)結(jié)果,說明通過試驗(yàn)條件優(yōu)化后,提高了發(fā)酵豆乳中游離氨基酸含量。

    表5 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

    表6 正交試驗(yàn)方差分析

    表7 發(fā)酵豆乳優(yōu)化方案驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    2.3 抗氧化能力比較

    由表8可知,與未發(fā)酵豆乳相比,采用L.casei16發(fā)酵的未優(yōu)化組和優(yōu)化組豆乳總還原力分別為0.28,0.31,羥自由基清除能力分別為72.35%,79.43%,顯著高于未發(fā)酵豆乳的(P<0.05);優(yōu)化后的發(fā)酵豆乳總還原能力和羥自由基清除能力得到顯著提高(P<0.05)。Suo等[23]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌Zhao發(fā)酵豆乳的羥自由基清除能力為55.1%,保加利亞乳桿菌發(fā)酵豆乳羥自由基清除能力為31.7%,均低于試驗(yàn)結(jié)果。

    表8 抗氧化能力比較

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)表明,發(fā)酵豆乳的最優(yōu)工藝條件為L.casei16以2%接種量接種于豆乳,37 ℃發(fā)酵24 h,4 ℃冷藏6 h;該條件下發(fā)酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL,游離氨基酸含量為1.33 mg/mL;優(yōu)化條件下發(fā)酵豆乳的總還原能力為0.31,羥自由基清除能力為79.43%。后續(xù)將對L.casei16發(fā)酵豆乳的抗氧化機(jī)制進(jìn)行研究。

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