應(yīng)用D-異抗壞血酸鈉分光光度法快速檢測(cè)血清百草枯含量在臨床的意義＊

胡卡利 ，陳曉兵 ，李小民 △，王 麗 ，劉 華 ，沙 鷗

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港222000；3.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，江蘇連云港222000；4.江蘇龍燈化學(xué)有限公司，江蘇 連云港222000；5.江蘇海洋大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港222000）

百草枯中毒是我國(guó)農(nóng)藥中毒死亡率較高的疾病之一，百草枯中毒死亡率與中毒劑量、洗胃時(shí)間長(zhǎng)短等多種綜合因素有關(guān)[1]，目前臨床檢測(cè)百草枯的方法沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各級(jí)醫(yī)院檢測(cè)方法各不相同，百草枯中毒又多發(fā)生在農(nóng)村等基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，如何快速有效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的臨床預(yù)判，一直是基層醫(yī)院所面臨的一大難題，前期，我們建立以一種新的檢測(cè)方法，檢測(cè)尿中百草枯的濃度[2]，由于受患者排尿的影響，測(cè)定尿中百草枯濃度有一定時(shí)間延遲性，為方便快速的檢測(cè)血中百草枯濃度，為此，我們建立了一種快速簡(jiǎn)潔的測(cè)定方法，并應(yīng)用于臨床，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象均來自南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科2014年1月至2017年12月收治的40例百草枯中毒患者，均為主訴口服百草枯，女性 30 例，年齡 36.0（22.4～49.3）歲，男 性 10 例，年齡30.0（21.0～52.6）歲；所有患者均為口服百草枯30min以后來院就診?；颊呷朐汉蟪Ｒ?guī)徹底洗胃、導(dǎo)泄等基本處理，依據(jù)《百草枯中毒診斷與治療“泰山共識(shí)”》[3]，均予以目標(biāo)導(dǎo)向性血液灌流等標(biāo)準(zhǔn)治療[4]，依據(jù)患者存活情況，分為死亡組25例、存活組15例。納入患者：口服、就診時(shí)間＜24h者。排除患者：①既往有嚴(yán)重心、肝、腎、呼吸系統(tǒng)等疾病病史者；②就診時(shí)間＞24h者；3.48h內(nèi)死亡者。

1.2 儀器及試劑

TU-1901型分光儀（北京普析），百草枯（中國(guó)藥品生物制品檢測(cè)所，含量為99.0%），百草枯儲(chǔ)備液（濃度1g/L，臨用時(shí)逐級(jí)稀釋），6mol/L的NaOH溶液；D-異抗壞血酸鈉（含量98%）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

量取0.1～1.0 mL濃度100 μg/L百草枯標(biāo)準(zhǔn)品液于5mL的比色管中，依次加入0.2mL、6.0mol/L NaOH溶液，0.5mL、24.84g/LD-異抗壞血酸鈉溶液，用雙蒸水稀釋至刻度線，搖勻。以試劑空白做參比，采用TU-1901雙光束紫外分光光度儀，測(cè)定604nm處的吸光度，方法同前期檢測(cè)尿中百草枯的濃度[2]。

1.4 標(biāo)本采集及保存

本研究中血清均由南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科提供，包括健康人體血清與百草枯中毒患者血清，健康人體血清樣本中加入標(biāo)準(zhǔn)百草枯溶液，作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 波長(zhǎng)的選擇

在（300～800）nm 波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)百草枯、D-異抗壞血酸鈉，以及百草枯+D-異抗壞血酸鈉+NaOH進(jìn)行光譜測(cè)定如圖1所示，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)表明，在往待測(cè)定的百草枯溶液中加入D-異抗壞血酸鈉和NaOH后，呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，并在395和604nm波長(zhǎng)處有兩處吸收峰，在395nm波長(zhǎng)處有最大峰值，但在該波長(zhǎng)下，其他物質(zhì)干擾大、吸光度不穩(wěn)定；604nm處又一吸收峰，該峰值穩(wěn)定、無干擾。本實(shí)驗(yàn)選擇604nm作為波長(zhǎng)選擇。

圖1 吸收曲線

2.2 NaOH用量選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伴隨NaOH用量的增加，吸光度亦隨之增加，當(dāng)6mol/LNaOH用量在0.15～0.5mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大，且穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)選擇0.2mL，質(zhì)量濃度為6mol/L的NaOH溶液。

2.3 反應(yīng)時(shí)間選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸光度在4min后穩(wěn)定，20min內(nèi)保持不變；20min后逐步降低。因此，選擇反應(yīng)后4min進(jìn)行測(cè)定，20min內(nèi)測(cè)完。

2.4 回歸方程的制定

配比不同質(zhì)量濃度的百草枯溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)表明，百草枯濃度在0.5～20.0mg/L范圍內(nèi)，與吸光度A有良好的正相關(guān)線性，線性回歸方程 A=0.03897C+0.02408（mg/L）；線性相關(guān)系數(shù)R=0.997；表觀摩爾吸光系數(shù)ε=1.01×104L/(mol·cm)。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)控制誤差在（±5%），百草枯濃度固定為5mg/L，測(cè)定常規(guī)正負(fù)離子對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：在 500 倍的（K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Sn2+、SO42-、Br-、NO3-）；250 倍的（Pb2+）；20 倍的（Ca2+、Ni2+）及 5 倍的（Fe3+、Cu2+）等離子均不影響測(cè)定結(jié)果。

2.6 中毒患者血清百草枯濃度

我們所測(cè)定的40例患者中，有3例測(cè)定濃度小于最低測(cè)定濃度0.3ug/mL，40例中毒患者，其中存活組15例、死亡組25例，檢測(cè)其血清百草枯濃度（表1），測(cè)定結(jié)果表明，存活組濃度明顯較死亡組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著測(cè)定濃度的增加，死亡率也逐漸增加，兩者呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)rp=0.842。

表1 百草枯中毒患者血清濃度

3 討論

D-異抗壞血酸鈉有較強(qiáng)的還原性，本研究利用其在堿性條件下百草枯能與D-異抗壞血酸鈉生成藍(lán)色自由基的化學(xué)反應(yīng)特性，采用比色法來檢測(cè)血中百草枯濃度，系統(tǒng)的摸索出了D-異抗壞血酸鈉、氫氧化鈉用量以及顯色時(shí)間等因素影響關(guān)系[2]，在最佳條件下，對(duì)血清百草枯的濃度進(jìn)行了檢測(cè)，并將實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)用于臨床，我們發(fā)現(xiàn)此方法與傳統(tǒng)的連二亞硫酸鈉法測(cè)定方法進(jìn)行對(duì)比，該方法能消除血漿本身顏色因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，測(cè)定結(jié)果的靈敏度高，檢測(cè)極限可達(dá)0.1μg/mL。

雖然國(guó)家對(duì)百草枯禁售的施行，但一些新型摻售原始的百草枯的農(nóng)藥依舊不絕，這給臨床工作初期帶來困惑，在輕、中度中毒患者中，初期臨床癥狀不十分明顯，在不十分肯定是否為百草枯中毒時(shí)，利用本方法可以測(cè)定出低劑量的百草枯含量，為臨床工作帶來理論依據(jù)。我們?cè)趯?shí)際40例的臨床檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，存活組血清濃度明顯較死亡組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著測(cè)定濃度的增加，死亡率也逐漸增加，血清濃度與死亡率呈正相關(guān)性。這也為重度中毒患者提供了重要臨床決策方案。

目前，百草枯的分析檢測(cè)方法主要有色譜法、分光光度測(cè)定法、氣相色譜法、液相色譜法及毛細(xì)管電泳法和質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-9]。氣相色譜法操作比較復(fù)雜；質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)儀器、設(shè)備昂貴，技術(shù)難度高，難推廣應(yīng)用；毛細(xì)管電泳技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)[10]。這幾類檢測(cè)方法均不適合基層醫(yī)院。D-異抗壞血酸鈉測(cè)定法所需設(shè)備簡(jiǎn)單、原材料來源廣泛、測(cè)定程序少、方法簡(jiǎn)便、結(jié)果靈敏可靠、穩(wěn)定。同時(shí)還可以測(cè)定尿中百草枯中毒含量[2]，值得在基層醫(yī)院推廣。