季銨型改性殼聚糖的制備及其在兔毛織物抗菌整理中的應(yīng)用

張毅，姜迎雪，張昊

（天津工業(yè)大學紡織科學與工程學院，天津300387）

兔毛織物柔軟舒適，與羊毛織物相比不遑多讓，近年在市場逐步推廣。兔毛織物產(chǎn)品加工幾乎沒有前處理，使得兔毛本身攜帶微生物及少量油脂；并且兔毛纖維鱗片層的排列與其本身為蛋白質(zhì)纖維，為微生物的生長提供了有利條件，微生物生長繁殖使織物遭到損壞甚至危害人體健康，因此對兔毛織物進行抗菌整理具有重要意義。

殼聚糖是自然界中唯一帶有氨基的生物高分子，殼聚糖溶解后的溶液中的氨基一般容易帶上正電荷，通過與細菌細胞膜表面的負電子結(jié)合，改變細菌細胞膜的通透性可以起到抑制細菌生長的作用。這種天然生物高分子由于所具有的生物官能團性和相容性、安全性、微生物降解等優(yōu)良性能，目前已被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，尤其在紡織領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-8]。殼聚糖上裸露的氨基和羥基使殼聚糖具有活潑的化學性質(zhì)，如果不對氨基加以保護就會導致氨基被取代。Wan 等[9]用苯甲醛與殼聚糖的活性氨基反應(yīng)，將殼聚糖的氨基進行保護，制備得到N-苯亞甲基殼聚糖，再將其與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)得到中間體，然后進行水解，最終得到O-取代季銨化殼聚糖，但用醛類交聯(lián)劑往往具有毒性，在使用過程中對環(huán)境有一定的污染，且脫保護的過程一般采用酸，可能導致殼聚糖分子量下降，影響抑菌性[10-11]。基于此本文采用甲殼素上的羥基與季銨化的化合物反應(yīng)，再通過脫乙酰將活性氨基暴露，對反應(yīng)位置有選擇地進行改性，既在羥基上引入季銨基團，又保留C2上的氨基，最大程度上提高抑菌性能。季銨鹽類抗菌高分子均屬于陽離子型抗菌高分子，Kawabata等[12]研究認為陽離子殺菌劑的機理為：殺菌劑依靠靜電作用，吸附到細菌帶負電性的細胞膜，并且小分子的陽離子殺菌劑甚至通過細胞膜細胞壁進入細菌細胞內(nèi)部，與細胞質(zhì)相結(jié)合使其破裂，造成細菌釋放出細胞的內(nèi)容物，從而達到抑菌的目的。

值得一提的是，在現(xiàn)有的研究中大多采用三甲胺基季銨鹽作為抑菌劑[13-14]，而三乙基季銨鹽應(yīng)用于織物抑菌整理的研究較少，三乙基由于推電子效應(yīng)使N原子上的正電荷更加穩(wěn)定，理論上較三甲胺基季銨鹽有更強的陽離子性和抑菌性。基于此以三乙胺和環(huán)氧氯丙烷為原料，經(jīng)化學反應(yīng)合成3-氯-2-羥丙基三乙基氯化銨（CHPTAC-乙基）對甲殼素進行改性，然后經(jīng)脫乙酰得到季銨化O-取代改性殼聚糖。本文研究了季銨型陽離子改性殼聚糖（CCTS）的抗菌活性，并將其應(yīng)用于兔毛織物的抗菌整理。測試了整理前后兔毛織物的抗菌活性，探討CCTS 在兔毛織物抗菌整理中的可行性和前景，為兔毛織物功能開發(fā)提供理論依據(jù)，對兔毛織物的推廣有重要意義。

1 實驗材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：甲殼素，上海麥克林生化科技有限公司；三乙胺、鹽酸、無水乙醇，天津風船化學試劑科技有限公司；環(huán)氧氯丙烷、四氯化碳、氫氧化鈉、次磷酸鈉、檸檬酸，天津科密歐化學試劑有限公司。用于研究的所有化學試劑，均為分析級。

儀器：IS50 型紅外光譜儀，美國Nicolet 儀器公司；Varian Infinityplus 300 MHz 核磁頻譜儀，美國Varian公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 季銨型陽離子改性殼聚糖（CCTS）的合成

醚化劑的合成：在裝有電動攪拌、滴液漏斗和溫度計的三口燒瓶中加入30mL 濃鹽酸（36.5%），稱取等摩爾質(zhì)量的三乙基胺于滴液漏斗中，緩慢滴加。燒瓶置于30℃水浴，待反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)pH=8，水浴溫度設(shè)為35℃，緩慢滴加環(huán)氧氯丙烷（環(huán)氧氯丙烷∶三乙胺=0.9mol∶1mol）反應(yīng)4h。用四氯化碳萃取兩次，加水旋蒸得到黏稠狀液體CHPTAC-乙基。

季銨型甲殼素（CCT）的制備：在三口燒瓶中放入一定量的甲殼素、蒸餾水、NaOH，并不斷攪拌，使pH=13，水浴溫度控制在45℃，緩慢滴加CHPTAC-乙基（甲殼素∶CHPTAC-乙基=1mol∶0.6mol），反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后用25%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=8，將三口燒瓶中的產(chǎn)物倒入燒杯中冷卻至室溫，向燒杯中加入等體積的無水乙醇并不斷攪拌，靜置沉淀。待產(chǎn)物完全沉淀后進行抽濾，用50%乙醇溶液進行洗滌，8000r/min 下離心10min,重復(fù)洗滌3次，然后置于真空干燥箱中進行干燥得到白色固體CCT。

CCTS 的制備：將一定量的蒸餾水倒入三口燒瓶中，加入適量的固體氫氧化鈉和季銨型甲殼素，堿濃度50%，液固比15∶1，油浴140℃加熱，磁力攪拌，密封，回流，脫乙?；磻?yīng)8h。停止加熱和攪拌，抽濾。重復(fù)以上步驟，最后水洗至中性，置于50℃真空干燥箱中干燥得到較高脫乙酰度的CCTS。

1.2.2 兔毛織物的整理

將2g 整理劑、3g 檸檬酸和3g 次磷酸鈉溶解于200mL 蒸餾水中，加入3g 兔毛織物，于50℃浸泡15min 后取出，壓出多余液體，壓液率控制在70%，重復(fù)進行兩次。于80℃預(yù)烘5min，120℃焙烘2min，50℃水洗后再冷水洗滌，于50℃下烘干，得到經(jīng)抗菌整理的織物。

1.3 季銨型殼聚糖的表征與測試

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

采用KBr 粉末壓片法分析測試，使用Nicolet IS50 型紅外光譜儀對樣品進行FTIR 分析。稱取10mg 試樣與120mg 干燥的KBr 研磨均勻，用壓片機制成樣品壓片，進行測試[15]。

1.3.2 核磁共振碳譜（13C NMR）

采用美國Varian 公司的Varian Infinityplus 300 MHz 核磁頻譜儀對甲殼素、CCT、CCTS 進行13C NMR 譜分析。使用2.5mm 探針，掃描寬度250kHz，預(yù)掃描和馳豫延遲時間分別為10μs 和0.5s，自旋速率8.00kHz，掃描5h。

1.3.3 溶解性能的測定

以不同濃度檸檬酸溶液作溶劑配制1%的樣品溶液，用紫外分光光度計在波長600nm下測定樣品溶液的透射比[16-18]。

1.3.4 黏均分子量的測定

用乙酸作溶劑，采用黏度法對CCTS 分子量、殼聚糖分子量進行測定[19]。

1.3.5 最低抑菌濃度的測定

以0.5%醋酸溶液為溶劑配制0.5%的CCTS 溶液，將適量培養(yǎng)基與適量樣品溶液混合制得濃度分別 為0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L 的混合培養(yǎng)基，凝固后取1～2mL大腸桿菌菌懸液滴于平板中。

將接種好的平板放入培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24h。觀察細菌的生長情況。完全抑制菌落生長的試液濃度為本樣品對被試菌的最低有效抑菌濃度（MIC）值[20]。

稱取0.2g樣品溶解溶于40mL體積分數(shù)為0.5%的滅菌醋酸溶液中，同時將體積分數(shù)0.5%的滅菌醋酸溶液作為對照組。將19.2mL 培養(yǎng)基和0.8mL樣品溶液（濃度為0.2g/L）同時加入平皿中，立即前后作用均勻搖晃平皿，使得樣品液和培養(yǎng)基在培養(yǎng)基凝固前充分混合均勻，制得平皿，濃度為0.2g/L。凝固后取1～2mL大腸桿菌菌懸液(菌量約為106cfu/mL)滴于平板中。將接種好的平板放入培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24h，觀察細菌的生長情況。

1.4 兔毛織物抗菌活性測定

試驗采用GB/T 20944.3—2008對兔毛織物抗菌性能進行評價。

將0.75g±0.05g 織物與經(jīng)過抗菌整理的織物分別裝入盛有試驗菌液的三角瓶中，在150r/min、37℃下接觸震蕩12h。取出，稀釋到合適濃度，涂平板，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，分別觀察空白組、對照組及試驗組菌落生長情況。根據(jù)重復(fù)試驗結(jié)果確定抗菌效果。細菌抑菌率按式(1)計算。

式中，R為細菌抑菌率，%；B、A為搖瓶前后活菌細胞數(shù)[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR分析

圖1 所示為CCTS 的制備原理，首先三乙胺與環(huán)氧氯丙烷發(fā)生親核取代反應(yīng)生成醚化劑，環(huán)氧基有較高的反應(yīng)活性，與氨基葡萄糖環(huán)上的羥基發(fā)生反應(yīng)生成醚鍵，將季銨基團引入到甲殼素分子上，得到CCT，再經(jīng)脫乙酰得到CCTS。

圖2 顯示了醚化劑、甲殼素、CCT 和CCTS 的FTIR光譜。由圖2(a)可知，在3400cm-1附近是與伸縮振動吸收峰的重疊，2970cm-1和2940cm-1處出現(xiàn)的是烷基中C H 鍵伸縮振動吸收峰，1470cm-1附近是CH2中C H 剪式振動吸收峰,1640cm-1附近出現(xiàn)的強峰是季銨鹽的特征吸收峰，由此證明所得化合物應(yīng)為目標產(chǎn)物CHPTAC-乙基。

由圖2(b)可見，在1060cm-1附近的吸收峰對應(yīng)甲殼素中的伯醇的伸縮振動，對應(yīng)于1030cm-1處二烷基醚的吸收峰的增強[圖2(c)]，可能是由于醚化劑與季銨型甲殼素分子形成醚鍵。圖2(c)中1560cm-1和1630cm-1處的兩個峰對應(yīng)于季銨型甲殼素仲酰胺中NH 面內(nèi)彎曲振動，1670cm-1處的峰對應(yīng)于仲酰胺羰基的伸縮振動，其變?yōu)榧句@型殼聚糖中的伯胺基團N H 鍵的面內(nèi)彎曲振動，對應(yīng)于圖2(d)中1590cm-1和1620cm-1處的兩個峰。因此，季銨基團通過與C6上的羥基形成醚鍵引入到甲殼素分子中，再經(jīng)脫乙酰將C2上的乙酰胺基變?yōu)椴坊玫紺CTS。

2.2 13C NMR分析

圖1 季銨型殼聚糖的制備

圖3為甲殼素、季銨型甲殼素和季銨型殼聚糖的13C NMR 譜圖。由圖可見，在化學位移δ=104.5處的信號歸屬于甲殼素骨架的C1原子的特征峰，在δ=55～85 處的共振峰應(yīng)歸屬為甲殼素C 圓環(huán)上C2～C6共振特征峰[22-24]，δ=174、23分別對應(yīng)于甲殼素乙?；械膕p2雜化碳原子即羰基碳原子的振動峰C7和最高場甲基中的飽和碳原子峰C8。

圖3 甲殼素、季銨型甲殼素、季銨型殼聚糖的13C NMR譜圖

經(jīng)改性后甲殼素發(fā)生了顯著變化，出現(xiàn)引入C鏈上的C9、C10、C11新特征峰，陽離子基團主鏈上的碳原子峰對應(yīng)在δ=73.5 處出現(xiàn)的C9特征峰與C5比較接近，發(fā)生一定程度的重合，峰強度增強，同時出現(xiàn)了在季銨基團中與N原子連接兩個烷基C原子的信號，在季銨基中隨著N原子上烷基取代數(shù)量增多會使α 碳原子向低場移動至δ=54.5 處出現(xiàn)C12特征峰，它與C2、C11特征峰有一定程度的重合，信號增強，同時使與N原子相連的的β碳原子向高場移動至δ=9.5處出現(xiàn)C13特征峰，證實了甲殼素中引入季銨基團得到了CCT。

CCT 脫乙酰后低場sp2雜化C7峰與高場飽和甲基峰C8基本消失，乙?；久摮?，同時對季銨基團特征峰基本保留，強度未降低，說明脫乙酰過程對陽離子基團沒有造成影響，證明最終得到CCTS。

2.3 溶解性能分析

由于殼聚糖是非熱塑性材料，在受熱熔化之前已經(jīng)分解，因此殼聚糖產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用首先需要將其溶解制成溶液。然而殼聚糖大分子內(nèi)存在較強的分子內(nèi)和分子間氫鍵作用力，使得其在水和常見的有機溶劑中很難溶解，限制了殼聚糖的加工應(yīng)用。因此改善殼聚糖的溶解性能，對于擴大和加強殼聚糖的應(yīng)用具有十分重要的意義。

圖4 不同檸檬酸濃度下季銨型殼聚糖與殼聚糖的透射比

試驗通過對殼聚糖溶液的透光率分析來進行其溶解性能測試，溶解性能越好，透光率越大；反之，透光率越小。圖4 顯示了CCTS 與殼聚糖在隨著檸檬酸溶液濃度的增大透射比也隨之增強，在檸檬酸濃度為0.05mol/L 和0.1mol/L 時，CCTS 與殼聚糖的透射比基本無差別；而檸檬酸濃度在0.2mol/L時，由于大量羧基與氨基的結(jié)合，溶解性能增強，兩者透射比顯著增大，而CCTS 在殼聚糖分子鏈上引入陽離子季銨基團，離子基團同電子間相互排斥，由于空間位阻效應(yīng)大分子間距提高，破壞了不同分子鏈基團間氫鍵作用，降低結(jié)晶度促進溶解，親水基團數(shù)量增加，溶解性能顯著提高；檸檬酸濃度增大到0.40mol/L，兩者的透射比無顯著提高。由此說明CCTS 在弱酸中的的溶解性優(yōu)于殼聚糖，推測溶解性能的提高可能是CCTS 抑菌性能提高的因素。

2.4 黏度法測定分子量

圖5為CCTS、殼聚糖黏度η與濃度C關(guān)系線性擬合曲線。使用外推法進行分子量計算，C 0 處即是特性黏度[η]，由[η]= KMα，即可推出樣品的分子量。其中K 取1.81×10-3mL/g，α 取0.93[25]，計算可得樣品的黏均分子量。

圖5 季銨型殼聚糖、殼聚糖黏度與濃度關(guān)系線性擬合曲線（插圖為黏均分子量）

由此得出CCTS 成功接枝上陽離子季銨基團，分子量增大。一方面CCTS 相當于殼聚糖上引入大分子量季銨基團；另一方面，溶解性能提高，有利于大分子充分擴散，導致相互糾纏，流動受阻，摩擦力增強，黏滯阻力增大，特性黏度增大導致分子量增大，同時有利于與纖維大分子和交聯(lián)劑分子接觸從而提高抑菌性和耐洗性。

2.5 CCTS的最低有效抑菌濃度

圖6 中可以明顯看出樣品對大腸桿菌的促進、抑制以及細菌死亡的結(jié)果。甲殼素對大腸桿菌的生長無抑制作用，而季銨型甲殼素的MIC值為0.4g/L。經(jīng)醚化劑改性后的甲殼素由于季銨基團提高了其溶解性能且堿性增強，對大腸桿菌的生長有一定的抑制作用。

圖6 樣品對大腸桿菌的抑菌率及菌落生長情況

殼聚糖、CCTS的MIC值分別為0.3g/L、0.2g/L。殼聚糖上的氨基具有一定的抑菌效果，帶正電的自由氨基能與細胞壁上的負電荷結(jié)合，在細菌表面形成一層高分子保護膜阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細菌內(nèi)運輸，而CCTS 含有的季銨基團比氨基堿性更強，抑菌性增強；且溶解性增強，分子量增大，所形成的保護膜更加致密，更能阻止細菌對外界營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時導致細胞壁形成孔洞而造成胞內(nèi)成分外漏，從而導致細菌死亡。因此季銨基團的引入進一步增強了CCTS的抑菌性能。

2.6 兔毛織物的抗菌活性

兔毛纖維是一種蛋白質(zhì)纖維，能夠促進細菌生長，細菌的生長繁殖不僅會使織物遭到損壞甚至危害人體健康，因此對兔毛織物進行抗菌整理具有重要意義。

圖7 不同整理劑對大腸桿菌的抑菌率

通過不同整理劑整理的兔毛織物對大腸桿菌抑菌效果的比較如圖7所示，結(jié)果與上節(jié)抑菌率大致吻合，經(jīng)脫乙酰后得到的CCTS 抑菌率達到99.9%以上。甲殼素溶解性差，整理過程中大部分沉積在兔毛纖維表面，抑菌性和耐洗性均不佳；甲殼素分子接枝上陽離子季銨基團，提高了親水性能，但由于季銨型甲殼素上的活性基團較少，水溶性較差，與交聯(lián)劑反應(yīng)程度較小，大部分會涂覆在織物表面，在洗滌過程中會損失掉，抑菌性能表現(xiàn)不明顯；而殼聚糖溶于弱酸，同時自身氨基具有一定的抑菌性能，殼聚糖分子上的氨基、羥基與檸檬酸上的羧基反應(yīng)生成酰胺鍵和酯鍵從而交聯(lián)到兔毛纖維上，具有較好的耐洗性；CCTS 溶解性能提高且含有更強的抑菌基團，更容易發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，因此耐洗性和抑菌性能最佳。

在此基礎(chǔ)上，針對CCTS 整理的兔毛織物進行抗菌試驗結(jié)果如圖8所示。經(jīng)過多次洗滌后兔毛織物抑菌效果依舊保持穩(wěn)定，這表明CCTS 是一種長效優(yōu)異的毛織物抗菌整理劑。

圖8 織物洗滌次數(shù)對大腸桿菌的抑菌率影響

3 結(jié)論

（1）甲殼素和CHPTAC-乙基通過醚化反應(yīng)制備了CCT。再經(jīng)脫乙酰合成了CCTS。通過紅外光譜、核磁共振碳譜分析得到季銨基團已被引入到甲殼素分子中，并經(jīng)脫乙酰得到CCTS。通過黏均分子量、透射比的測定得到CCTS 與殼聚糖相比分子量增大，溶解性能增強。

（2）采用最小抑菌法測定樣品抗菌活性，得到CCTS 對大腸桿菌的MIC 值為0.2g/L，此值優(yōu)于天然殼聚糖的MIC值，因此推斷季銨基團的引入、溶解性能的提高、分子量的增大可能是CCTS 抑菌性提高的內(nèi)在因素。

（3）采用振蕩法測定整理前后兔毛織物的抗菌活性。結(jié)果表明，CCTS 對大腸桿菌具有明顯的抗菌作用。經(jīng)CCTS 整理后的兔毛織物對大腸桿菌的抗菌活性顯著提高，抑菌率高于CCT 和天然殼聚糖，達到99.9%以上，這表明CCTS 是一種長效優(yōu)異的毛織物抗菌整理劑，在毛織物抗菌整理上將會有良好的應(yīng)用前景。