花色苷的生物活性及提取、分離純化研究

李京城　張?zhí)苽ァ√m小中　張國強

摘 要：花色苷是一種天然色素，具有抗氧化、降血脂、抗衰老等生物活性，在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有廣大的應(yīng)用前景。該文綜述了花色苷提取工藝、分離純化技術(shù)和生物活性的最新研究成果，并總結(jié)了花色苷發(fā)展需要解決的問題，旨在為花色苷進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：花色苷;提取;純化;生物活性

中圖分類號 TS264.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）13-0140-05

Abstract： Anthocyanins ，a kind of natural pigments with biological activities such as antioxidant， hypolipidemic， and anti-aging， and has broad application prospects in the food and pharmaceutical industries. The article summarizes the latest research results of anthocyanin extraction technology， separation and purification technology and biological activity， and summarizes the problems that need to be solved in the development of anthocyanins，and aims to provide a reference for the further research of anthocyanins.

Key words： Anthocaynins;Extraction;Purification;Biological activities

花色苷（Anthocaynins）是一種存在于莖、葉、花、果實、種子等植物器官的水溶性天然色素[1]，屬于多酚類化合物，由花色素和糖分子通過糖苷鍵縮合形成[2]?；ㄉ辗N類繁多，因其糖苷鍵位點和碳環(huán)上取代基不同，花色苷大致有500多種，花色素有20多種，其中植物中最常見的花色素有6種[3]?；ㄉ詹粌H能使植物呈紅、藍(lán)、紫等顏色[4]，還具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗癌等生理活性[5-7]，可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域?；ㄉ諄碓磸V泛，獲取途徑繁多，原材料成本低，而傳統(tǒng)的提取方法有較多雜質(zhì)，不利于花色苷的定性、定量分析，因此對花色苷提取、分離、純化工藝優(yōu)化和生物活性研究很有必要。本文對花色苷提取工藝、分離純化及生物活性等研究進(jìn)行綜述，以期為花色苷的進(jìn)一步研究提供參考。

1 花色苷生物活性

1.1 抗氧化活性 抗氧化活性是花色苷的一個重要生物活性，有研究表明，植物花色苷通過清除細(xì)胞內(nèi)活性氧來維持機體正常生理活動[8]?？寡趸钚耘c酰基化基團(tuán)、糖基化位點及數(shù)量密切相關(guān)[9]。高品[10]等從紫甘薯、黑枸杞、黑加侖和桑椹中提取花色苷，選擇具有代表性含量高的花色苷純化至單體，比較其抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除能力：矢車菊-3-O-葡萄糖苷>矢車菊-3-蕓香糖苷>矮牽牛素-3-O-對香豆酰蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷>芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷>Vc;對羥基自由基清除能力：勺藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷>矢車菊-3-O-葡萄糖苷>矮牽牛素-3-O-對香豆酰蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷>矢車菊-3-蕓香糖苷>Vc，幾種花色苷單體的DPPH、羥基自由基清除能力均大于Vc。張麗霞[11]等考察了黑莓花色苷對血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、抗氧化酶活性和凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞存活率和過氧化物酶活性提高近50%，早期凋亡率和晚期凋亡率極顯著下降（P<0.01），研究表明黑莓花色苷對由H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮血管細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。周麗萍[12]等以低、中、高3組劑量喂養(yǎng)小鼠蓓蕾藍(lán)靛果花色苷，考察丙二醛（MDA）、蛋白質(zhì)羰基、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽的含量，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的丙二醛和蛋白質(zhì)羰基極顯著降低（P<0.01），而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽的含量極顯著上升（P<0.01），得出結(jié)論蓓蕾藍(lán)靛果花色苷對乙醇誘導(dǎo)的氧化損傷有抑制作用。

1.2 降血脂作用 王心哲等將小鼠分為對照組、高脂組和花色苷干預(yù)組進(jìn)行8周喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與高脂組相比，花色苷干預(yù)組小鼠的腹部脂肪和腎周脂肪顯著降低（P<0.05）;通過對總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等與高血脂癥及動脈粥樣硬化有關(guān)影響因素的含量，發(fā)現(xiàn)TG和LDL含量顯著下降，TC有下降趨勢，HDL含量干預(yù)組相比較高脂組有所升高，表明黑米花色苷有降血脂和抗動脈粥樣硬化的作用。于偉[13]等研究了藍(lán)靛果花色苷降血脂分子機制，發(fā)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷能顯著提升低密度脂蛋白受體（LDLR）和mRNA表達(dá)量，而血液中絕大部分膽固醇與LDL結(jié)合被LDLR清除和吞噬，所以血脂含量降低;同時研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)靛果花色苷能顯著增加膽固醇逆轉(zhuǎn)運途徑中ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，調(diào)控膽固醇逆轉(zhuǎn)運。

1.3 其他生物活性 大量研究報道，花色苷不僅具有抗氧化活性和降血脂作用，還具有其他一些生物活性。如薛宏坤[14]等考察了體外藍(lán)莓花色苷抗癌作用，當(dāng)花色苷濃度從100mg/L上升至300mg/L時，HepG2肝癌細(xì)胞存活率降低了29.2%;A549肺癌細(xì)胞存活率液顯著下降（P<0.05），Hela人宮頸癌細(xì)胞存活率由（90.00±1.60）%下降到（63.30±1.50）%，下降了28.7%，綜上證明藍(lán)莓花色苷對3種癌細(xì)胞的生長有抑制作用。杜靈敏[15]等對農(nóng)大4號歐李果實花色苷在D-半乳糖致衰老小鼠保護(hù)作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)農(nóng)大4號歐李果實花色苷通過降低小鼠體內(nèi)MDA（衰老指標(biāo)）含量，提高總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，達(dá)到延緩小鼠衰老的目的。機體通過自噬清除機體內(nèi)有異常細(xì)胞組分和積聚蛋白質(zhì)來維持正常代謝，有研究[16]表明飛燕草素葡萄糖苷可以活化自噬相關(guān)信號通路，來改善記憶和認(rèn)知功能障礙。此外還有研究報道花色苷具有抗炎作用[17]、抗誘變作用[18]、保護(hù)視力[19]等。

2 花色苷的提取工藝

在花色苷研究中，花色苷提取工藝是極其重要的環(huán)節(jié)，不適宜的提取工藝可能導(dǎo)致花色苷降解，得率降低。近年來常見的提取方法有機溶劑提取法、超聲輔助提取法和微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、酶提取法等。

2.1 有機溶劑提取法 有機溶劑提取法常用溶劑為水-乙醇、水-甲醇和水-丙酮的混合溶劑，通過水浴加熱、旋轉(zhuǎn)濃縮、冷凍干燥等步驟得到花色苷樣品。因為花色苷在中性和堿性環(huán)境中不穩(wěn)定[20]，故常常在提取溶劑中加入少量有機酸或鹽酸。李雨浩[21]等分別以水、60%乙醇、1%檸檬酸和60%乙醇、60%甲醇、1%檸檬酸和60%甲醇為溶劑提取黑果腺肋花楸花色苷;李金星[22]等以酸性甲醇、酸性乙醇、酸性丙酮為提取劑提取藍(lán)莓花色苷;趙桃[23]等以70%甲醇、70%乙醇為提取劑提取黑青稞花色苷。結(jié)果表明同體積分?jǐn)?shù)提取劑提取率：乙醇>甲醇>丙酮，然而也有不同研究報道甲醇為提取劑提取率高于乙醇，可能是組成花色苷樣品的成分和結(jié)構(gòu)差異造成的[24]。陳雅妮[25]等通過正交試驗確定玫瑰花色素的最佳提取工藝為40%乙醇溶液、料液比1∶40（g/mL）、70℃提取4h。張笑菊[26]等用響應(yīng)面優(yōu)化法確定紫甘藍(lán)花色苷最佳提取工藝40%乙醇、溫度41℃、料液比1∶36（g/mL），此條件下提取率最高13.92mg/g，其中溫度和乙醇濃度、料液比和乙醇濃度都存在明顯的交互作用。由此可見，有機溶劑提取法影響花色苷提取率的主要因素為提取溫度、提取時間、料液比、pH和提取劑體積分?jǐn)?shù)。

溶劑提取法具有操作簡單、所需提取設(shè)備要求及成本低等優(yōu)點，同時也有著提取時間長、提取效率低和部分提取溶劑有害等不足。越來越多的研究人員通過超聲輔助提取、微波輔助提取等方法提取花色苷，來避免溶劑提取法的不足。

2.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取法是利用超聲波輻射產(chǎn)生的機械效應(yīng)與空化作用加速細(xì)胞的破碎，熱效應(yīng)加速花色苷溶解[27]，從而達(dá)到高效提取花色苷的目的。蔣華梅[28]等利用超聲輔助法確定了插田泡花色苷最佳提取工藝為超聲時間22min、超聲功率141W、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.5%、料液比1∶40（g/mL），最佳提取率263.15mg/g，相比普通溶劑提取法提取率顯著提高。朱鳳妹[29]等通過單因素試驗探索了溫度、提取時間和料液比等工藝條件，利用響應(yīng)面優(yōu)化法確定黑果肋花楸花色苷最佳提取工藝40%乙醇溶液（含0.5%乙酸）、提取溫度43℃、超聲時間23min、料液比1∶89（g/mL），提取率最高可以達(dá)到0.79%。杜道坤[30]等利用響應(yīng)面優(yōu)化法確定了黑青稞最佳提取工藝，在最佳提取工藝的基礎(chǔ)上使用超聲提取40min，提取率從9.68mg/100g提高到14.04mg/100g，不僅縮短了提取時間，還提高了提取效率。

超聲輔助提取法具有提取時間短、效率高、能耗少、提取所需試劑少（降低了提取次數(shù)）等優(yōu)點。值得注意的是超聲時間不宜超過30min，提取時間過長容易導(dǎo)致反應(yīng)體系溫度升高，花色苷降解，提取率降低、設(shè)備損耗增加。這種兩種或以上的協(xié)同提取方法有著巨大的經(jīng)濟(jì)價值和環(huán)保效益，可以彌補單一提取方法的不足，應(yīng)該加以廣泛利用。

2.3 微波輔助提取法 微波輔助提取是利用高頻微波使植物細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)吸收大量微波能，造成細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升形成壓力差，使細(xì)胞壁出現(xiàn)裂紋和孔洞，從而有利于溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)溶解釋放花青素。王心哲[31]等探索了黑米花色苷的微波提取工藝，通過對微波功率、微波時間、提取液pH及料液比影響因素的考察，正交分析得到最佳工藝參數(shù)微波功率600W、時間7.5min、pH為5、料液比1∶4（g/mL），花色苷得率最高可達(dá)到1.28%。劉雪可[32]等分別使用常溫溶劑提取法、加熱溶劑提取法、超聲輔助提取法和微波輔助提取法4種方法從藍(lán)靛果果渣中提取花色苷，結(jié)果顯示微波提取只需用40s，花色苷得率就達(dá)到0.23%，相比常溫溶劑提取、加熱溶劑提取和超聲輔助提取得率分別提高了78.1%、73%、75%，而3種提取法所需時間分別為90min、90min、35min。朱璐[33]等使用浸提法、超聲波法和微波法的最佳提取工藝提取紫薯花色苷并比較了3種提取方法所得花色苷的6種抗氧化能力（羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子、鐵離子還原力、總抗氧化能力、金屬螯合能力），結(jié)果表明除金屬螯合能力較差，其余5種抗氧化能力中微波法>超聲波法>浸提法，紫薯花色苷采用微波提取法，抗氧化效果最佳。

因此，微波輔助提取法具有耗時短、能耗小、效率高等優(yōu)點，但是微波提取花色苷受微波功率和時間的影響較大，隨著時間和功率的增加，反應(yīng)體系溫度急劇上升，導(dǎo)致花色苷降解，得率下降?，F(xiàn)在用于工廠生產(chǎn)的微波設(shè)備技術(shù)相對滯后，應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)能力不足，未來應(yīng)該加大微波提取設(shè)備在規(guī)模化生產(chǎn)方面的研究。

2.4 超臨界CO2萃取法 超臨界CO2萃取法是指對CO2施加溫度和壓力，使它達(dá)到超臨界態(tài)，此時的CO2是既非氣態(tài)又非液態(tài)的單一相，既具有氣體的穿透性又具有液體的溶解度，能夠快速準(zhǔn)確地萃取所需物質(zhì)[34]。常見的超臨界流體有CO、CO2、N2O、NH3等。其中CO2臨界溫度31.1℃、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、無毒害，特別適用于花色苷的萃取。田密霞[35]等通過單因素試驗確定了藍(lán)莓花色苷超臨界CO2萃取的影響因素為萃取壓力、萃取時間、萃取溫度和料液比，利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝為萃取壓力28Mpa、萃取時間60min、萃取溫度40℃、料液比7∶1（mL/g）。相比較溶劑提取法，超臨界CO2萃取法有著安全無毒、提取純度高、提取物質(zhì)損耗少等優(yōu)點。

此外，花色苷的提取方法還有超高壓提取等方法。杜月嬌[36]等采用超高壓法提取山葡萄花青素，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝為壓力200Mpa、保壓時間2min、料液比1∶8.5（g/mL），相較于傳統(tǒng)的熱浸提法，提取率提高了26.7%。不同來源樣品的組成成分不同，其花色苷種類和結(jié)構(gòu)也不同，因此不同樣品花色苷的提取需要綜合考慮成本、耗時、用途等多個方面來制定提取工藝。

3 花色苷分離純化

通過有機溶劑提取法提取的花色苷中含有糖、蛋白質(zhì)、有機酸和淀粉等雜質(zhì)，不利于花色苷的保存、定性分析和其他生理活性的研究，因此需要對花色苷提取液進(jìn)行分離純化。目前，常見的純化方法有柱層析法（包括大孔樹脂柱層析、聚酰胺柱層析、凝膠柱層析和離子交換樹脂柱層析）、紙層析、薄層層析、高速逆流色譜法、膜分離法、兩相萃取法等。

3.1 大孔樹脂吸附法 大孔樹脂是一種安全無毒的分離材料，具有成本低、操作簡單、可重復(fù)利用等優(yōu)點。大孔樹脂吸附的原理是利用固定相和流動相之間的范德華力或生成氫鍵，同時多孔結(jié)構(gòu)對分子大小不同物質(zhì)進(jìn)行篩選，以達(dá)到分離純化目的[37]。譚佳琪[38]等比較了6種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸能力，初步篩選出AB-8、XAD-700有較強吸附性，X-5解吸率最高，原因是2種樹脂極性相似，易與花色苷分子形成氫鍵緊密結(jié)合[39]，X-5大孔樹脂因為有較大的孔徑而易于被洗脫下來[40]。通過靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線，最終確定AB-8樹脂效果最好，從動力學(xué)和熱力學(xué)的角度探索了吸附行為和吸附機制，得出結(jié)論AB-8大孔樹脂對樹莓花色苷的吸附屬于單層物理吸附，吸附過程為放熱過程，洗脫液流速和洗脫劑濃度為3mL/min、60%時，回收效果最好。余亞選[41]等篩選出D101大孔樹脂純化美洲合歡花花色苷，最佳工藝參數(shù)是上樣濃度1.5mg/mL、pH2.0、上樣流速2mL/min、60%酸化乙醇1mL/min洗脫。采用液相色譜法對比純化前后花色苷發(fā)現(xiàn)純化后花色苷峰值增加，雜峰減少。徐華榮[42]等使用AB-8大孔樹脂探究了紫馬鈴薯的純化工藝，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交優(yōu)化分析得到最佳純化工藝上樣濃度0.5mg/mL、pH2.0、上樣流速1mL/min，洗脫液乙醇濃度70%、pH1.0、洗脫流速1mL/min，純化后花色苷色價比純化前提高8.43倍。不同樣品花色苷因為其組成結(jié)構(gòu)不相同所以篩選的大孔樹脂也不盡相同，這與大孔樹脂的比表面積、孔徑、極性和分子間作用力有關(guān)。

3.2 高速逆流色譜法 高速逆流色譜是一種液液色譜分配技術(shù)，利用物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差異實現(xiàn)分離。因為其流動相和固定相都是液體，避免因不可逆吸附引起的樣品損失、失活、變性等，同時被分離物質(zhì)在兩相之間充分接觸，能夠高效、大量的分離樣品[43]。易建華[44]采用高速逆流色譜純化紫甘藍(lán)花色苷，以正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V/V/V/V）為溶劑系統(tǒng)，得到3種化合物，純度分別為76.28%、45.46%、91.46%。李媛媛[45]采用乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1∶40∶1∶50∶0.01）為溶劑體系，純化紅葡萄皮花色苷得到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷，純度分別為93.7%、95.2%、91.6%。薛宏坤[46]以正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V/V）為溶劑體系，純化桑葚花色苷得到飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，純度分別為和92.27%、94.05%、90.82%?；ㄉ盏纳砘钚允墙暄芯康臒狳c，但花色苷種類繁多，大規(guī)模制造花色苷的單體難以實現(xiàn)。高速逆流色譜操作簡單、成本低、高效量大的優(yōu)點，具有廣大市場前景。

3.3 聯(lián)合純化方法 因為花色苷種類和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，單一的純化方法對有些植物花色苷的純化效果不佳，聯(lián)合純化花色苷的研究相繼報道。如劉靜波[47]等將藍(lán)莓超聲浸提，乙酸乙酯萃取制得藍(lán)莓花色苷粗提液，通過XAD-7HP大孔樹脂吸附、Sep-Pak C18固相萃取、Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離，經(jīng)高效液相色譜檢測上述所得飛燕草素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-半乳糖苷，純度為96.98%、95.63%。經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)2種花色苷單體的回收率僅有10.4%、17.5%，這是因為大孔樹脂和凝膠色譜柱能造成總花色苷50%以上的損失。于澤源[48]等采用大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷，經(jīng)HPLC-MS測定花色苷單體為矢車菊-3-O-葡萄糖苷，純度為90.88%。薛宏坤[49]等采用AB-8大孔樹脂-Sephadex LH-20凝膠柱層析聯(lián)用的方法純化黑加侖花色苷，通過HPLC-MS檢測分析得出2種花色苷單體，分別是飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷。

除此之外，花色苷分離純化還有其他一些方便、快捷的純化方法。如萬瑩[50]等采用微濾-超濾膜聯(lián)用技術(shù)純化紫薯花色苷，膜分離技術(shù)有著經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和維持花色苷活性等優(yōu)點。陳亮[51]等采用Zorbax SB-C18柱固相萃取桑椹花色苷，分離純化得到3種花色苷，分別是矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷，含量占總花色苷的67.52%、31.29%和1.06%。不同的純化方法各有優(yōu)缺點，因此，針對不同的植物花色苷，應(yīng)在前人的研究基礎(chǔ)上，積極探索新的高效的純化方法。

4 展望

花色苷具有極強的生理保健作用和出色的醫(yī)療應(yīng)用價值，在食品、化妝和醫(yī)藥等行業(yè)擁有著廣泛的市場前景。但在應(yīng)用還需要解決以下幾方而問題：（1）花色苷在具有天然色素安全無毒優(yōu)點的同時，也具有天然色素穩(wěn)定性差的不足。有研究[52]報道對花色苷分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以提高其穩(wěn)定性，但目前根據(jù)實際需求精準(zhǔn)批量化修飾花色苷分子結(jié)構(gòu)的研究不足。（2）缺乏高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的提取純化技術(shù)，不足以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)?；ㄉ仗崛〖兓媾R著提取率低、損耗大和花色苷單體分離成本高等困難。目前市面上售賣的花色苷單體種類較少，價格昂貴，大規(guī)模制備花色苷單體技術(shù)具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。（3）盡管花色苷具有諸多有益的生物活性，但自然界花色苷種類高達(dá)500多種，具體某種花色苷單體具有的生物活性和對應(yīng)生物活性的調(diào)控機制的研究不足。單一花色苷提取純化工藝，總有某些方面的不足，多種方法聯(lián)用可以避免這些不足之處的同時，還可以提高花色苷產(chǎn)量和純度。我國有著豐富的花色苷資源，隨著技術(shù)的進(jìn)步，花色苷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展會越來越快，可以為我國帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

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（責(zé)編：王慧晴）