木賊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

賴正權(quán) 艾偉鵬 胡震 竇耀星 蔡雨峰 劉偉 吳瑩 張慈婷 謝曉琳 廖慧君

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）09-1080-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.11

摘 要 目的：為完善木賊藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：以來自不同產(chǎn)地的10批木賊藥材為樣品，采用薄層色譜（TLC）法對(duì)樣品中的山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷進(jìn)行定性鑒別;參照2015年版《中國(guó)藥典》附錄的相關(guān)方法，測(cè)定樣品中重金屬、黃曲霉毒素、雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物的含量;采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定樣品中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷含量，并建立木賊水溶性成分的HPLC指紋圖譜。結(jié)果：TLC鑒別結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且空白對(duì)照無干擾。10批樣品中雜質(zhì)含量為0.19%～2.32%，水分含量為10.12%～11.87%，總灰分含量為6.67%～10.11%，酸不溶性灰分含量為1.34%～2.12%，水溶性浸出物含量為9.17%～13.99%，醇溶性浸出物含量為7.49%～13.68%;初步擬定雜質(zhì)含量不得超過3.00%、總灰分含量不得超過10.00%、酸不溶性灰分含量不得超過2.50%、水溶性浸出物含量不得少于9.00%、醇溶性浸出物含量不得少于5.00%的標(biāo)準(zhǔn)。9批樣品中檢測(cè)出了砷（含量為0.064～0.225 mg/kg），6批樣品中檢測(cè)出了鎘（含量為0.106～0.132 mg/kg），所有樣品中均檢測(cè)出了鉛（含量為0.221～1.896 mg/kg），但所有樣品中均未檢測(cè)到汞和黃曲霉毒素。HPLC方法學(xué)考察結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》相關(guān)要求;10批樣品中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷含量為627.12～5 384.53 mg/kg，10批樣品的HPLC指紋圖譜相似度均大于0.900。結(jié)論：本研究新建了木賊中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的定性、定量分析方法;對(duì)木賊中重金屬、黃曲霉毒素、雜質(zhì)等項(xiàng)目進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)雜質(zhì)、灰分和浸出物進(jìn)行了限度擬定。所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于木賊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 木賊;山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷;薄層色譜法;高效液相色譜法;指紋圖譜;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

Study on Improvement of Quality Standard of Equisetum hyemale

LAI Zhengquan1，AI Weipeng1，HU Zhen2，DOU Yaoxing3，CAI Yufeng1，LIU Wei1，WU Ying1，ZHANG Citing1，XIE Xiaolin1，LIAO Huijun4（1.Dept. of Pharmacy， Shenzhen University General Hospital， Guangdong Shenzhen 518055， China;2.School of Chinese Medicine， the Chinese University of Hong Kong， Hong Kong， China;3.Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China;4.Dept. of Pharmacy， Union Shenzhen Hospital， Huazhong University of Science and Technology/the Sixth Affiliated Hospital of Shenzhen University， Guangdong Shenzhen 518052， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To provide reference for improving the quality standard of Equisetum hyemale. METHODS： Totally 10 batches of E. hyemale from different sites were collected as samples. TLC method was used to qualitatively identify kaempferol- 3-O-β-sophoroside. The contents of heavy metal， aflatoxin， impurity， moisture， total ash， acid-insoluble ash， water-soluble extract and ethanol-soluble extract were determined according to supplementary provisions of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）. HPLC method was used to determine the content of kaempferol-3-O-β-sophoroside in sample. HPLC fingerprint of water-soluble extract from E. hyemale was also established. RESULTS： TLC identification showed that in the chromatogram of the test sample， fluorescent spots with the same color were displayed on the corresponding positions of the chromatogram of substance control of kaempferol-3-O-β-sophoroside， and without interference from blank control. Among 10 batches of samples， the contents of impurities were 0.19%-2.32%; the water contents were 10.12%-11.87%; the total ash contents were 6.67%-10.11%; the acid-insoluble ash contents were 1.34%-2.12%; the water-soluble extract contents were 9.17%-13.99%; the ethanol-soluble extract contents were 7.49%-13.68%， respectively. It is preliminarily proposed that the impurity content shall not exceed 3.00%; the total ash content shall not exceed 10.00%; the acid-insoluble ash content shall not exceed 2.50%; the water-soluble extract content shall not be less than 9.00%; the ethanol-soluble extract content shall not be less than 5.00%. Arsenic （0.064-0.225 mg/kg） was detected in 9 batches of samples; cadmium （0.106-0.132 mg/kg） was detected in 6 batches of samples; lead （0.221- 1.896 mg/kg） was detected in all samples， but no mercury or aflatoxin was detected. The results of HPLC method met the relevant requirements of Chinese Pharmacopoeia. The content of kaempferol-3-O-β-D-sophoroside in 10 batches of samples was 627.12-5 384.53 mg/kg， and the similarity of HPLC fingerprints of 10 batches of samples was more than 0.900. CONCLUSIONS： A new qualitative and quantitative analysis method for kaempferol-3-O-β-D-sophoroside was established; the heavy metals， aflatoxins， impurities and other items in E. hyemale were detected; the limits of impurity， ash and extract were determined. The established method is simple， accurate and reproducible， and can be used for quality control of E. hyemale.

KEYWORDS? ?Equisetum hyemale; Kaempferol-3-O-β-sophoroside; TLC; HPLC; Fingerprint; Quality standard

木賊為木賊科植物木賊（Equisetum hyemale L.）的干燥地上部分，性平，味甘、苦，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、明目退翳的功效，用于風(fēng)熱目赤、迎風(fēng)流淚、目生云翳等[1]。木賊含有多種活性成分，包括黃酮類、酚酸類、生物堿類、揮發(fā)油類、脂類等化合物[2-4]。黃酮類成分是木賊的主要成分，具有降血脂、降血壓、保肝、抗心肌缺血和抗腫瘤等藥理作用[5-8]，而其中的山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人肝癌細(xì)胞系PLC以及人子宮頸癌細(xì)胞系HeLa具有顯著的抗腫瘤作用[9-10]，為其代表性黃酮類活性成分之一。

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]以及文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]的有關(guān)木賊薄層鑒別和含量測(cè)定的指標(biāo)成分大多為黃酮苷元成分山柰素，但山柰素主要是樣品經(jīng)酸水解后所得，由于影響酸水解程度的不可控因素較多（如酸濃度、水解溫度、水解時(shí)間等），故可能影響檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性;同時(shí)，山柰素也是瓦松、紅花、羅布麻葉、垂盆草、金錢草等多種藥材的指標(biāo)成分，專屬性較差。此外，木賊標(biāo)準(zhǔn)中也缺乏符合中藥整體性和模糊性特點(diǎn)的指紋圖譜研究[15-16]。為優(yōu)化和提升木賊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，全面控制木賊藥材質(zhì)量，確保其臨床用藥的安全性和有效性，本研究選擇具有抗腫瘤作用的山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為薄層鑒別和含量測(cè)定的指標(biāo)成分，該指標(biāo)成分屬于木賊原生黃酮苷，樣品不需經(jīng)酸水解處理便可測(cè)定，更有利于結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。同時(shí)，鑒于木賊藥材以水煎劑入藥為主，且主要成分為黃酮苷水溶性成分，故本研究擬建立其水溶性成分的指紋圖譜，并進(jìn)一步測(cè)定該藥材中重金屬、黃曲霉毒素、雜質(zhì)、水分、灰分以及浸出物的含量，以期為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

1.1 儀器

HPTLC薄層色譜系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）;1100 Series型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）;SL40型臺(tái)式離心機(jī)、iCAP-TQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）;CP225D型十萬分子一電子分析天平、BSA124S-CW型萬分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）;ED型烘箱（德國(guó)Binder公司）;SB5200型超聲波清洗機(jī)（美國(guó)Branson公司）;PMC-130S型水浴鍋（馬來西亞Pensonic公司）;SRJX型馬弗爐（上海金滬電熱儀器聯(lián)營(yíng)廠）;硅膠GF254預(yù)制板、Milli-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

10批木賊藥材分別購(gòu)自中國(guó)香港和內(nèi)地市場(chǎng)，經(jīng)香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院宗玉英研究員鑒定為木賊科植物木賊（E. hyemale L.）的干燥地上部分，樣本保存于香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院;山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品（上海交通大學(xué)，批號(hào)：20120307，純度：≥98%）;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。樣品信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的薄層色譜鑒別

取木賊粉末1.0 g，置于50 mL離心管中，加70%乙醇20 mL，超聲（功率：270 W，頻率：40 kHz，下同）1 h，濾過，減壓蒸干濾液，殘?jiān)?0%乙醇2 mL溶解，作為供試品溶液;另取山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液;以70%乙醇作為空白對(duì)照溶液。照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0502法[17]進(jìn)行試驗(yàn)：吸取空白對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254預(yù)制板上，以供試品溶液加對(duì)照品溶液作為加樣回收，以正丁醇-乙酸-水（14 ∶ 1 ∶ 0.5，V/V/V）為展開劑，上行展開，展距為4 cm。取出，晾干，置紫外光燈（波長(zhǎng)254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且空白對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.2 雜質(zhì)、水分、灰分和浸出物的含量測(cè)定

雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測(cè)定分別參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2301雜質(zhì)檢查法、0832水分測(cè)定第二法、2302灰分測(cè)定法、2201浸出物測(cè)定冷浸法（分別以水和70%乙醇為溶劑）[17]進(jìn)行，每批樣品平行測(cè)定2次，取平均值。結(jié)果顯示，各批次木賊樣品中雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量皆有差異。雜質(zhì)含量為0.19%～2.32%，平均含量為1.41%;水分含量為10.12%～11.83%，平均含量為10.79%;總灰分含量為6.67%～10.11%，平均含量為8.28%;酸不溶性灰分含量為1.34%～2.12%，平均含量為1.82%;水溶性浸出物含量為9.17%～13.99%，平均含量為12.12%;醇溶性浸出物含量為7.49%～13.68%，平均含量為10.63%。其中，水分和醇溶性浸出物含量均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）木賊標(biāo)準(zhǔn)[1];雜質(zhì)、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物是本研究新增的測(cè)定項(xiàng)，采用Excel軟件進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)分析后，根據(jù)計(jì)算出的98%置信區(qū)間，最終確定木賊中雜質(zhì)含量不得超過3.00%、總灰分含量不得超過10.00%、酸不溶性灰分含量不得超過2.50%、水溶性浸出物含量不得少于9.00%、醇溶性浸出物含量不得少于5.00%。10批木賊樣品中雜質(zhì)、水分、灰分和浸出物含量測(cè)定結(jié)果詳見表2。

2.3 重金屬、黃曲霉毒素的含量測(cè)定

重金屬、黃曲霉毒素測(cè)定分別參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2321中電感耦合等離子質(zhì)譜法和通則2351中第一法[17]進(jìn)行，每批樣品平行測(cè)定2次，取平均值。結(jié)果10批次木賊樣品中均未檢出重金屬汞;砷、鎘、鉛雖有檢出，但含量均未超出《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)（砷≤2.0 mg/kg、鎘≤0.3 mg/kg、汞≤0.2 mg/kg、鉛≤5.0 mg/kg）[18]。同時(shí)，10批木賊樣品中也均未檢出黃曲霉毒素，也符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)（黃曲霉毒素B1≤5 μg/kg）[18]。10批木賊樣品中重金屬、黃曲霉毒素含量測(cè)定結(jié)果見表3。

2.4 山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的含量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液的制備 取木賊粉末約0.2 g，精密稱定，加水10 mL，超聲處理30 min，以5 000 ×g離心5 min，濾過;殘?jiān)铀?0 mL，超聲處理30 min，以5 000×g離心5 min，濾過;合并濾液，置于25 mL量瓶中，加水定容，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 對(duì)照溶液的制備 取山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇溶解并制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品溶液。以甲醇為空白對(duì)照溶液。

2.4.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Inertsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸（A）-乙腈（B）（V/V），線性梯度洗脫（0～40 min，10%B→30%B）;檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：23～25 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。分別取供試品溶液、山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品溶液和空白對(duì)照溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷計(jì)大于6 000，待測(cè)成分與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，色譜圖見圖2。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.25、1、2.5、5、10 mL，分別置于不同10 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，分別按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=8.556x+3.210（R2=0.999 5）。結(jié)果表明，山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷質(zhì)量濃度在1～200? ? ? ?μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品溶液（20 μg/mL），按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷峰面積的RSD為0.59%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）約0.2 g，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，分別在室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷峰面積的RSD為0.98%（n=5），表明樣品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的含量。結(jié)果，山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的平均含量為2 260.11 mg/kg，RSD為1.64%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）6份，每份約0.1 g，精密稱定，每份中精密加入與樣品中含量等量的山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷對(duì)照品，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算其回收率。結(jié)果，山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的平均回收率為104.18%，RSD為2.74%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好，詳見表4。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取不同批次的木賊樣品粉末各約0.2 g，精密稱定，分別按“2.4.1”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并根據(jù)回歸方程計(jì)算山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的含量。每批樣品平行測(cè)定2次，取平均值。結(jié)果，各批樣品（S1～S10）中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的含量分別為? ? ? 2 260.32、1 965.76、677.46、1 887.83、1 729.07、5 384.53、627.12、942.75、4 773.06、2 093.17 mg/kg;最高含量? ? ? （5 384.53 mg/kg）與最低含量（657.12 mg/kg）間相差了8.19倍，可見不同批次樣品中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷含量差異較大。

2.5 木賊水溶性成分指紋圖譜的研究

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）約0.2 g，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度較好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）約0.2 g，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，于室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)，分別按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=5），表明樣品在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取木賊樣品粉末（編號(hào)：S1）6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 木賊水溶性成分指紋圖譜的建立及分析 分別取10批木賊樣品粉末，各約0.2 g，精密稱定，分別按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012A版）中，以編號(hào)為S2的樣品圖譜為參照指紋圖譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.2 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，并采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果，共標(biāo)出4個(gè)共有峰，經(jīng)與對(duì)照品圖譜比對(duì)（見圖1B），確認(rèn)了4號(hào)峰為山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷。以生成的對(duì)照指紋圖譜為參照進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)10批樣品的相似度均大于0.900，表明其與對(duì)照指紋圖譜均具有較好的一致性。但是各樣品色譜峰的面積和數(shù)量有一定差異，表明來自不同產(chǎn)地的木賊樣品存在一定的質(zhì)量差異。10批木賊樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜見圖3，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 TLC鑒別條件的選擇

前期筆者分別考察了不同展開劑[乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V）、 正丁醇-乙酸-水（14 ∶ 1 ∶ 0.5，V/V/V）和乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 2 ∶ 0.2，V/V/V）]、不同觀察方法（紫外光254 nm、紫外光366 nm、白光）、不同展距（4、5、6 cm）對(duì)TLC鑒別結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，以正丁醇-乙酸-水（14 ∶ 1 ∶ 0.5，V/V/V）為展開劑、展距為4 cm、在紫外光254 nm條件下觀察時(shí)，主要斑點(diǎn)的分離度良好，且斑點(diǎn)清晰。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）和文獻(xiàn)報(bào)道的木賊TLC鑒別均以山柰素為指標(biāo)成分，且需加熱酸水解、乙酸乙酯萃取前處理，然后以甲醇溶解制備供試品溶液，再噴以5%三氯化鋁乙醇溶液進(jìn)行顯色[12，14]。而本研究以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為指標(biāo)成分對(duì)木賊進(jìn)行TLC鑒別，采用的是70%乙醇超聲提取、乙醇溶解制備供試品溶液、在紫外光（波長(zhǎng)為254 nm）下檢視，方法更簡(jiǎn)便，重復(fù)性更好，同時(shí)減少了強(qiáng)酸、噴霧接觸，更益于檢測(cè)員的化學(xué)防護(hù)。

3.2 浸出物含量測(cè)定條件的考察

在前期研究中，筆者考察了冷浸法和熱浸法測(cè)定浸出物含量的差異，結(jié)果兩種方法測(cè)得的浸出物含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此在本研究選擇更為簡(jiǎn)便的冷浸法進(jìn)行浸出物的含量測(cè)定。接著，筆者又進(jìn)一步考察了以不同體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、95%）乙醇為溶劑時(shí)對(duì)醇溶性浸出物提取效果的影響，結(jié)果以70%乙醇作為溶劑時(shí)測(cè)得的醇溶性浸出物含量最高，因此在本研究中選擇70%乙醇作為醇溶性浸出物的提取溶劑。

3.4 供試品溶液制備條件的考察

在前期研究中，筆者以待測(cè)物的相對(duì)含量為指標(biāo)，分別對(duì)供試品溶液制備的不同提取方法（浸提、超聲、加熱回流）、不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5 h）、不同提取次數(shù)（1、2、3次）和不同提取溶劑倍數(shù)（25、50、100）進(jìn)行了考察，最終選擇了50倍水超聲提取2次、每次0.5 h為木賊供試品的制備方法（此條件下待測(cè)物的相對(duì)含量較高）。

3.5 HPLC色譜條件的考察

筆者前期對(duì)0.4%磷酸-乙腈和0.1%三氟乙酸-乙腈兩種洗脫系統(tǒng)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)以后者為洗脫體系時(shí)所得色譜圖的分離度和峰形較好，故選擇其作為本研究的洗脫系統(tǒng)。筆者還對(duì)比了Inertsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC Pack ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等3種不同色譜柱的色譜分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Inertsil C18柱的柱效較好。此外，通過全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，265 nm為山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷的最大吸收波長(zhǎng)，且在該波長(zhǎng)下所得圖譜的信息豐富、分離度好，因此選擇265 nm作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究建立了以山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷為指標(biāo)成分的TLC鑒別和HPLC含量測(cè)定方法，新增了木賊水溶性成分的HPLC指紋圖譜鑒別方法，同時(shí)新擬定了雜質(zhì)、灰分、水溶性浸出物的檢測(cè)限度。所建立的方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于木賊的質(zhì)量控制。但本研究尚未成功鑒定出木賊水溶性成分HPLC指紋圖譜中各共有峰所代表的化學(xué)成分，在后期研究中還需結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用和核磁等手段對(duì)各主要成分進(jìn)行鑒定。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：63.

[ 2 ] 張承忠，趙磊，李沖，等.木賊化學(xué)成分研究[J].中草藥，2002，33（11）：978-979.

[ 3 ] 李淑惠，李德坤，靳丹虹，等.木賊科植物研究概況Ⅰ：化學(xué)成分研究[J].中草藥，2000，31（7）：12-14.

[ 4 ] 李德坤，李靜.木賊揮發(fā)油成分的研究[J].中草藥，2001，32（6）：499-500.

[ 5 ] 董蕊，孫昌霞.木賊醇提物不同萃取部位總酚酸、黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2018，39（8）：56-60、66.

[ 6 ] 甄艷軍，侯建明.木賊對(duì)大鼠高脂血癥及主動(dòng)脈內(nèi)膜早期粥樣硬化病變的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2004，24 （7） ：643-645.

[ 7 ] 孫昌霞.木賊總黃酮的提取及對(duì)APAP致小鼠肝損傷保護(hù)作用的初步研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[ 8 ] 潘旭，張昌浩.木賊化學(xué)成分和藥理作用研究近況[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，39（3）：216-218.

[ 9 ] 李方麗.白花蛇舌草化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[10] 張春梅.木賊乙酸乙酯提取物抗腫瘤活性成分研究[D].延邊：延邊大學(xué)，2012.

[11] 張憲，趙惠萍，張小茜，等.木賊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（5）：48-50.

[12] 酈紅巖，湯小偉，周堅(jiān)祥，等.HPLC法測(cè)定木賊中槲皮素和山柰素的含量[J].齊魯藥事，2012，31（7）：400-401.

[13] 李軍山，陳鐘，張肖建，等.木賊配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].西部中醫(yī)藥，2017，30（3）：25-27.

[14] 許鑫，蘇瑞，金敏婷，等.木賊中3種成分的HPLC-DAD- MS分析[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2011，8（8）：30-33.

[15] 楊捷，朱泠音，徐翠珊，等.麥棗怡神顆粒的指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房，2019，30（17）：2374-2378.

[16] 張淼，陳龍，朱華，等.石仙桃藥材 HPLC 指紋圖譜的建立及聚類分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（13）：1792-1795.

[17] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57-58、104、202、204-206、224-225.

[18] 對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部.中華人民共和國(guó)外經(jīng)貿(mào)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[J].中藥研究與信息，2001，3（8）：9-10.

（收稿日期：2019-11-23 修回日期：2020-02-23）

（編輯：林 靜）