麻黃非生物堿部位抗過敏性哮喘活性組分的化學成分分析

靳京妹 于大永 侯滔 張秀莉 史麗穎

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1068-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.09

摘 要 目的：為闡明麻黃非生物堿部位抗過敏性哮喘的藥效物質(zhì)基礎提供參考。方法：麻黃用85%乙醇提取、正庚烷萃取后經(jīng)固相萃?。ㄌ盍蠟锳C18）前處理，對麻黃提取物進行非生物堿部位富集，并采用高效液相色譜法經(jīng)Unitary C18柱和Eclipse XDB-C18色譜柱進行麻黃非生物堿類組分制備。以HT-29細胞中高表達的G蛋白偶聯(lián)受體35（GPR35受體）為靶標、GPR35受體激動劑敏喘寧（1 μmol/L）為陽性對照、動態(tài)質(zhì)量重置（DMR）響應值為檢測指標，通過無標記細胞整合藥理學方法考察各組分（質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）對GPR35受體的激動活性和脫敏活性，以篩選抗過敏性哮喘的活性組分。應用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術對活性組分的化學成分進行鑒定。結果：麻黃非生物堿部位主要分為固相萃取前處理的沉淀部分和95%甲醇洗脫部分，從上述兩部分中共富集得到了20個組分。其中，沉淀部分中組分F1.5～F1.10及95%甲醇洗脫部分中組分F2.5～F2.10對GPR35受體有較強的激動活性，同時對GPR35受體激動劑敏喘寧顯示出了較強的脫敏活性;并且沉淀部分中組分F1.5～F1.10在HT-29細胞上引起的DMR響應信號強度甚至超過了陽性對照藥敏喘寧。經(jīng)HPLC-Q-TOF-MS分析，共從活性組分中鑒定出了24個化合物，其中黃酮類14個、揮發(fā)油類2個、有機羧酸類7個、蒽醌類1個。結論：麻黃非生物堿部位主要以黃酮類成分為主，其具有一定的抗過敏性哮喘活性。

關鍵詞 麻黃;非生物堿部位;G蛋白偶聯(lián)受體35;過敏性哮喘;化學成分;鑒定

Analysis of Chemical Components of Anti-allergic Asthma Active Fractions in Alkaloids-free Part of Ephedrae Herba

JIN Jingmei1，YU Dayong1，HOU Tao2，ZHANG Xiuli2，SHI Liying1（1.School of Life Sciences and Biotechnology， Dalian University， Liaoning Dalian 116622， China;2.Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Liaoning Dalian 116023， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To provide reference for elucidating the anti-allergic asthma constituents in alkaloids-free part of Ephedrae Herba. METHODS： Ephedrae Herba was extracted with 85% ethanol and n-heptane， and then subjected to solid-phase extraction （filler AC18） for pretreatment to enrich alkaloids-free part from the extract of Ephedrae Herba. HPLC method was adopted， and alkaloids-free fractions of Ephedrae Herba were performed on Unitary C18 column and Eclipse XDB-C18 column. Using high expression G protein coupled-receptor 35 （GPR35 receptor） in HT-29 cell as target， GPR35 receptor agonist zaprinast （1 μmol/L） as positive control， DMR response value as the detection index， the agonistic and desensitizing activity of each fraction （100 μg/mL） on GPR35 receptor was screened by label-free integrated pharmacological method， so as to screen active anti-allergic asthma fraction. HPLC-Q-TOF-MS method was used to identify the chemical composition of the selected active fractions. RESULTS： The alkaloids-free part of Ephedrae Herba was divided into two parts， involving the precipitated part before solid phase extraction and the 95% methanol elution part; from them， 20 fractions were screened. Among them， the precipitated fraction F1.5-F1.10 and 95% methanol eluted fraction F2.5-F2.10 had a strong agonistic activity on GPR35 receptor; at the same time， GPR35 receptor agonist zaprinast showed a relatively strong desensitization activity. The signal intensity of DMR induced by F1.5-F1.10 in the precipitated part of HT-29 cells was even higher than that of reference drug zaprinast. By HPLC-Q-TOF-MS analysis， 24 chemical components were identified from active fractions， involving 14 flavonoids， 2 volatile oils， 7 organic carboxylic acids， 1 anthraquinones. CONCLUSIONS： The alkaloid-free part of Ephedrae Herba is mainly flavonoids and has anti-allergic asthma activity.

KEYWORDS? ?Ephedrae Herba; Alkaloids-free part; G protein coupled-receptor 35; Allergic asthma; Chemical component; Indentification

麻黃為草麻黃（Ephedra sinica Stapf）、中麻黃（Eph- edra intermedia Schrenk et C.A.Mey.）或木賊麻黃（Ephedra equisetina Bge.）的干燥草質(zhì)莖，具有宣肺平喘、發(fā)汗解表、利水消腫等功效[1-2]。研究表明，麻黃中主要含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類、有機酚酸類和糖類等成分[3-6]。目前普遍認為麻黃生物堿類成分是其平喘的活性成分，其中的麻黃堿和偽麻黃堿可興奮支氣管平滑肌上的β2受體，從而達到平喘作用[7-8]。然而，麻黃生物堿類成分已報道的副作用也較多，比如可引起高血壓、心肌梗死、震顫、痙攣、中風等[9]。近年來，關于麻黃中非生物堿類成分的研究引起了人們的重視。日本學者的最新研究表明，去除了生物堿的麻黃提取物與麻黃總提取物相比，前者鎮(zhèn)痛、抗流感、抑制腫瘤轉移等作用并無明顯變化，同時還消除了麻黃生物堿引起的失眠、心律失常等典型副作用[10-11]。在前期研究中，本課題組通過大鼠實驗對麻黃非生物堿類組分的抗過敏性哮喘作用進行了考察，結果表明這類組分具有顯著降低致敏大鼠血清中免疫球蛋白E（IgE）和白三烯（LT）含量、顯著減少全血和肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞（EOS）數(shù)量以及顯著縮小肺組織炎癥面積的作用（專利申請?zhí)枺?01711011998.5），這提示非生物堿類成分也可能是麻黃平喘的有效成分。

無標記細胞整合藥理學技術（Cellular label-free integrative pharmacology，CLIP）是經(jīng)諧振波導光柵生物傳感器將細胞受藥物刺激產(chǎn)生的動態(tài)質(zhì)量重置（Dynamic mass redistribution，DMR）響應信號記錄為可視化譜線[12]，從而反映藥物作用靶點和通路的技術。本課題組前期通過CLIP技術研究發(fā)現(xiàn)，麻黃非生物堿類成分草質(zhì)素具有較強的激動G蛋白偶聯(lián)受體35（GPR35）受體的活性[13]，而GPR35受體被認為是哮喘治療的新靶標[14-15]。因此，本研究擬通過對麻黃提取物進行非生物堿類組分富集和制備、活性組分篩選以及其化學成分質(zhì)譜表征，進一步探討麻黃非生物堿部位抗過敏性哮喘的有效成分及作用靶點，為闡明麻黃抗過敏性哮喘的藥效物質(zhì)基礎提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1290型高效液相色譜儀、6540型高分辨質(zhì)譜儀（德國Agilent公司）;LC-20A型半制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;Milli-Q型去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）;CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;5415R型高速離心機（德國Eppendorf公司）;Heracell 240i型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Epic? 384孔生物感應器微型板、Epic?系統(tǒng)（美國Corning公司）。

1.2 藥品與試劑

麻黃藥材于2016年8月30日采自內(nèi)蒙古地區(qū)，原植物經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定為草麻黃（E. sinica Stapf）的干燥草質(zhì)莖，標本保存于大連大學生命科學與技術學院標本室（標本號：20160830）;敏喘寧標準品（美國Sigma-Aldrich公司，批號：Z0878，純度：≥98%）;二甲基亞砜（DMSO）溶液（美國Bio Basic公司，規(guī)格：500 mL）;漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）和Mc Coys 5A培養(yǎng)液（美國Gibco公司）;甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 細胞

人直腸癌HT-29細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。

2 方法與結果

2.1 麻黃非生物堿類組分的富集和制備

取麻黃干燥草質(zhì)莖1 kg，用5倍量的85%乙醇（L/kg）在80 ℃回流提取3次，每次2 h;合并3次提取液，過濾后減壓濃縮，得濃縮液250 mL（質(zhì)量濃度為600? mg/mL，以提取物計，下同）。取該濃縮液50 mL，加500 mL甲醇，充分溶解;用相同體積正庚烷萃取3次，回收溶劑，得甲醇層提取物（128 g）和正庚烷層提取物。取甲醇層提取物1.25 g，分散于25 mL甲醇-水-甲酸（25 ∶ 75 ∶ 0.1，V/V/V）溶液中，離心（8 000 r/min）10 min，得到上清液部分25 mL（質(zhì)量濃度為44 mg/mL）和沉淀部分135 mg。取該上清液0.5 mL，上樣AC18 SPE柱（dp=60 μm，6 mL）[柱子用8 mL甲醇活化，8 mL甲酸-水（0.1 ∶ 100， V/V）溶液平衡]，抽干SPE柱，棄去上樣流出液;用8 mL 甲酸-水（0.1 ∶ 100，V/V）溶液淋洗AC18 SPE柱并抽干，收集淋洗液，即得淋洗液部分;再用8 mL甲醇-水-甲酸（5 ∶ 95 ∶ 0.1，V/V/V）溶液洗脫，收集洗脫液，即得5%甲醇酸水洗脫部分;最后用8 mL甲醇-水（95 ∶ 5，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液，即得95%甲醇洗脫部分。其中，沉淀部分和95%甲醇洗脫部分為富集后的非生物堿部位，將這兩部分用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，待用。

取上述沉淀部分樣品，用甲醇-水（70 ∶ 30，V/V）溶解后，上樣Unitary C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）。設置色譜條件：流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸-水（B），梯度洗脫（0～60 min，40%A→95%A;60～80 min，95%A）;流速為0.5 mL/min;檢測波長為315 nm;進樣量為50 ?L。上樣后按色譜峰進行流分收集。結果，共收集得到10個流分，記為F1.1～F1.10，結果詳見圖1A。

取上述95%甲醇洗脫部分樣品，用甲醇-水（50 ∶ 50，V/V）溶液溶解后，上樣Eclipse XDB-C18半制備型色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 ?m）。設置色譜條件：流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸-水（B），梯度洗脫（0～25 min，30%A→50%A; 25～50 min，50%A→95%A）;流速為2? ? ?mL/min;檢測波長為254 nm;進樣量為50 ?L。上樣后按色譜峰進行流分收集。結果，共得到10個流分，記為F2.1～F2.10，結果詳見圖1B。

2.2 麻黃非生物堿部位抗過敏性哮喘活性組分的篩選

參考文獻方法[13，16]進行試驗。將處于對數(shù)生長期的HT-29細胞按3.0×104個/孔的密度接種到Epic?384孔生物感應器微型板中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。在檢測之前將Epic?384孔板中的培養(yǎng)液棄掉，換上HBSS（30 ?L/孔），然后置于 Epic?系統(tǒng)上平衡孵育1 h后，分別進行激動試驗和脫敏試驗。（1）激動試驗：在Epic?系統(tǒng)上建立一個2 min的基線，然后將待測組分（組分F1.1～F1.10和F2.1～F2.10，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，均以含0.1%DMSO的HBSS溶解）按10? ? ?L/孔的量加入培養(yǎng)HT-29細胞的Epic? 384孔生物感應器微型板中，繼續(xù)監(jiān)測1 h。通過監(jiān)測各組分引起的DMR響應信號來評價各組分對細胞內(nèi)源性GPR35受體的激動活性。同時，以GPR35受體激動劑敏喘寧（1 μmol/L，10 ?L/孔）作為陽性對照。每個樣品平行設置3個復孔。（2）脫敏試驗：在Epic?系統(tǒng)上建立一個2 min的基線，然后將待測組分（組分F1.1～F1.10和組分F2.1～F2.10，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）或等量含0.1%DMSO的HBSS（即陽性對照，考察無脫敏情況下敏喘寧引起的DMR信號強度），按10 ?L/孔的量加入培養(yǎng)HT-29細胞的Epic? 384孔生物感應器微型板中，預處理HT-29細胞1 h，然后加入敏喘寧（1 ?mol/L，10 ?L/孔）繼續(xù)處理1 h。通過監(jiān)測各組分預處理后敏喘寧引起的DMR響應信號來評價各組分對敏喘寧的脫敏作用。每個樣品平行設置3個復孔。DMR數(shù)據(jù)由Epic Imager軟件記錄，并經(jīng)Imager Beta 3.7軟件處理。采用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。所有的DMR信號均經(jīng)空白校正得到。測定結果詳見圖2。

結果顯示，沉淀部分中組分F1.1～F1.10（100 μg/mL）在激動試驗中引起了HT-29細胞不同程度的DMR響應信號（見圖2A）。其中以組分F1.5～F1.10引起的DMR響應信號最強（強度均大于200 pm），甚至超過了敏喘寧（1 μmol/L）在細胞上引起的DMR響應信號，且在脫敏試驗中其均可明顯地抑制敏喘寧在HT-29細胞上引起的DMR響應信號（見圖2C），這說明沉淀部分中組分F1.5～F1.10可能具有GPR35受體激動活性。95%甲醇洗脫部分中組分F2.1～F2.10在激動試驗中也引起了HT-29細胞不同程度的DMR響應信號（見圖2B）。其中以組分F2.5～F2.10引起的DMR響應信號最強，且在脫敏試驗中其可不同程度地抑制敏喘寧（1 μmol/L）在細胞上引起的DMR響應信號（見圖2D），這說明95%甲醇洗脫部分中組分F2.5～F2.10可能具有GPR35受體激動活性。但從整體情況而言，沉淀部分中組分F1.5～F1.10對GPR35受體的激動活性較95%甲醇洗脫部分中組分F2.5～F2.10更強。

2.3 麻黃非生物堿類抗過敏性哮喘活性組分的成分鑒定

采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC- Q-TOF-MS）技術進行成分鑒定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱：C18ME反相色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 ?m）;流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液;流速：0.2 mL/min;柱溫：30 ℃;洗脫條件：組分F1.5（0～40 min，40%A→90%A;40～50 min，90%A），組分F1.6（0～40 min，40%A→95%A;40～50 min，95%A），組分F1.7、F1.8（0～40 min，70%A→90%A;40～50 min，90%A），組分F1.9（0～20 min，40%A→90%A;20～50 min，90%A），組分F1.10（0～40 min，40%A→90%A;40～50 min，90%A），組分F2.5（0～30 min，25%A→60%A;30～30.1 min，90%A→95%A;30.1～40 min，95%A），組分F2.6、F2.7（0～30 min，40%A→90%A;30～40 min，90%A），組分F2.8（0～30 min，40%A→90%A;30～30.1 min，90%A→95%A;30.1～40 min，95%A），組分F2.9、F2.10（0～20 min，20%A→90%A;20～20.1 min，90%A→95%A;20.1～40 min，95%A）;進樣量：20 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 在正、負離子模式下檢測;離子源：雙電噴霧離子源（Dual_ESI）;電離電壓：4.5 kV;霧化氣壓力：35 psi;氣體溫度：350 ℃;干燥器流速：8.0 L/min;檢測模式：飛行時間全掃描質(zhì)譜模式和二級質(zhì)譜（MS/MS）模式;碰撞電壓：3 500 V;MS-MS碰撞能量：30 eV;掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）100～1 000。

2.3.3 活性組分的成分鑒定 取沉淀部分中組分F1.5～F1.10和95%甲醇洗脫部分中組分F2.5～F2.10各適量，分別用甲醇-水-甲酸（70 ∶ 30 ∶ 0.1，V/V/V）和甲醇-水-甲酸（50 ∶ 50 ∶ 0.1，V/V/V）溶解，制成質(zhì)量濃度均為100 ?g/mL的樣品溶液。分別按“2.3.1”“2.3.2”項下條件進樣測定，記錄圖譜。采用Qualitative Analysis B.04.00分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理。通過查閱Chemspider、NIST和Mzcloud質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結合相關文獻，對化合物的二級碎片信息進行比對。結果，共鑒定出了24個化合物，其中黃酮類14個、揮發(fā)油類2個、有機羧酸類7個、蒽醌類1個。麻黃非生物堿類抗過敏性哮喘活性組分中化學成分的鑒定結果見表1。

2.3.4 化合物的裂解特征分析 從每類化合物中分別選取1個代表成分進行裂解特征分析。

（1）黃酮類代表成分——化合物2?；衔?的保留時間為20.815 min，ESI-模式下的準分子離子峰為? ?m/z 577[M-H]-，脫去1分子鼠李糖基m/z 163[Rha]-，再脫去1分子肉桂酸酯基m/z 145[C9H7O3]-后，形成山柰酚碎片離子峰m/z 285[M-H-Rha-C9H7O3]-。結合麻黃文獻報道[18-19]，推測該化合物為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-4″-E-（4-羥基）-肉桂酸酯?；衔?的MS/MS圖見圖3。

（2）蒽醌類代表成分——化合物8。化合物8的保留時間為21.099 min，ESI-模式下準分子離子峰為m/z 269[M-H]-，脫去1分子一氧化碳形成m/z 241[M-H- CO]-，再脫去1分子氧形成m/z 225[M-H-CO-O]-。結合麻黃文獻報道[21]，推測該化合物為大黃素?；衔?的MS/MS圖見圖4。

（3）有機酸類代表成分——化合物15?；衔?5的保留時間為17.492 min，ESI-模式下準分子離子峰為? m/z 163[M-H]-，脫去1分子二氧化碳形成m/z 119[M-H- CO2]-，再脫去1分子碳形成m/z 108[M-H-CO2-C]-。結合麻黃文獻報道[25]，推測此化合物為對羥基肉桂酸?；衔?5的MS/MS圖見圖5。

（4）揮發(fā)油類代表成分——化合物13?；衔?3的保留時間為3.500 min，ESI+模式下準分子離子峰為? ?m/z 137[M+H]+，然后一種方式是脫去1分子甲基形成? m/z 121[M+H-CH3]+，再脫去1分子亞甲基形成m/z 109[M+H-CH3-CH2]+;另一種方式是脫去2分子甲基直接形成m/z 107[M+H-2CH3]+。結合麻黃文獻報道[19，24]，推測該化合物為β-蒎烯。化合物13的MS/MS圖見圖6。

3 討論

麻黃提取物中化學成分復雜，而本研究主要針對麻黃非生物堿部位進行分析研究，為減少生物堿部位對試驗的干擾，在富集前應對樣品進行一定的前處理。筆者前期參考相關文獻[28-30]后考察了3種非生物堿類成分富集方法的富集效果，分別為液-液萃取法（萃取溶劑分別為二氯甲烷+乙醇和二氯甲烷+鹽酸）、732型強酸性陽離子交換樹脂法和固相萃取法（AC18SPE柱）。結果前2種方法存在回收率低、操作復雜等問題;而固相萃取法解決了上述問題，且富集速度較快、重現(xiàn)性良好。選定方法后，筆者又在文獻報道[30]基礎上[甲酸-水（0.1 ∶ 100，? ?V/V）淋洗得到生物堿部位，甲醇洗脫得到非生物堿部位]進行條件優(yōu)化，最終選定了以甲酸-水（0.1 ∶ 100，V/V）、甲醇-水-甲酸（5 ∶ 95 ∶ 0.1，V/V/V）和甲醇-水（95 ∶ 5，V/V）依次淋洗作為固相萃取條件。

在對沉淀部分進行組分制備時，本研究選用了分析型色譜柱而非制備型色譜柱，是考慮到試驗過程中的樣品用量很少，采用CLIP篩選活性組分以及利用高分辨質(zhì)譜儀進行化學成分分析用的樣品量均只需1 mg左右;其次，分析型色譜柱的柱效比制備型色譜柱高，可以得到更多流分，更有利于后期活性組分的篩選。但從制備化合物的角度講，此方法有一定局限性。

在活性組分篩選試驗中，選用的人直腸癌HT-29細胞能夠高度表達GPR35受體。其中激動試驗是為了評價各組分在HT-29細胞上引起的DMR響應信號;脫敏試驗是為了驗證組分在HT-29細胞上引起的DMR響應信號是特異性激活GPR35受體造成的。如果組分在HT-29細胞上引起了DMR響應信號，并且能降低GPR35受體激動劑敏喘寧的DMR響應信號，那么就可確定該組分是GPR35受體的激動劑。組分的DMR激動信號越強、對敏喘寧的DMR信號降低效果越強，則說明該組分的活性越好。通過本研究試驗，初步篩選出了12個活性組分。查閱文獻[13]發(fā)現(xiàn)，具有GPR35受體激動活性的天然化合物多為黃酮類成分，如草質(zhì)素、槲皮素等。本研究從12個活性組分中共鑒定、表征出了24個化合物，包括黃酮類[如小麥黃素、山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-4″-E-（4-羥基）-肉桂酸酯、草棉黃素-3-O-α-鼠李糖苷-8-O-β-葡萄糖苷]、蒽醌類（如大黃素）、揮發(fā)油類（如β-蒎烯、古蕓烯）和有機酚酸類（如對羥基肉桂酸）等天然成分。目前還沒有相關文獻報道這些成分是否具有抗過敏性哮喘活性，但是基于CLIP活性篩選試驗，筆者推測已表征出的化合物可能具有抗過敏性哮喘的作用，但這需要進一步的驗證。故后期筆者擬通過計算機輔助藥物設計中的分子對接技術，去探究已表征出的天然化合物與GPR35受體蛋白靶點的作用方式，以期獲得相關數(shù)據(jù)和理論支持。

綜上，麻黃非生物堿類部位中主要以黃酮類成分為主，其具有一定的抗過敏性哮喘活性，這為闡明麻黃平喘的藥效物質(zhì)基礎及臨床應用提供了理論基礎，也為麻黃這一重要藥用植物資源的有效利用提供了實驗參考。

參考文獻

[ 1 ] 中國科學院植物研究所.中國植物志：第7卷[M].北京：科學出版社，1979：468.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：300.

[ 3 ] HONG H，CHEN HB，YANG DH，et al. Comparison of contents of five ephedrine alkaloids in three official origins of Ephedra Herba in China by high-performance liquid chromatography[J]. J Nat Med，2011，65（3/4）：623-628.

[ 4 ] 孫興姣，李紅嬌，劉婷，等.麻黃屬植物化學成分及臨床應用的研究進展[J].中國藥事，2018，32（2）：201-209.

[ 5 ] ZANG X，SHANG M，XU F，et al. A-type proanthocyanidins from the stems of Ephedra sinica （Ephedraceae） and their antimicrobial activities[J]. Molecules，2013，18（5）：5172-5189.

[ 6 ] 李佳蓮，方磊，張永清，等.麻黃的化學成分和藥理活性的研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2012，14（7）：21-27.

[ 7 ] VANSAL SS，F(xiàn)ELLER DR. Direct effects of ephedrine isomers on human beta-adrenergic receptor subtypes[J]. Biochem Pharmacol，1999，58（5）：807-810.

[ 8 ] 鄭孟凱，陶雪芬，錢微微，等.不同地區(qū)市售麻黃藥材中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和總生物堿的含量測定[J].中國藥房，2015，26（12）：1682-1685.

[ 9 ] Centers for Disease Control and Prevention. Adverse eve- nts associated with ephedrine-containing products-texas，December 1993-September 1995[J]. JAMA，1996，276（21）：1711-1712.

[10] HYUGA S，HYUGA M，OSHIMA N，et al. Ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract：a safer alternative to ephedra with comparable analgesic，anticancer，and anti-influenza activities[J]. J Nat Med，2016，70（3）：571- 583.

[11] KOBAYASHI Y. Analgesic effects and side effects of Ephedra Herb extract and ephedrine alkaloids-free ephedra herb extract[J]. Yakugaku Zasshi，2017，137（2）：187- 194.

[12] FANG Y. The development of label-free cellular assays for drug discovery[J]. Expert Opin Drug Discov，2011，6（12）：1285-1298.

[13] 侯滔，史麗穎，何牮，等.兩個黃酮類化合物對GPR35受體激動活性的研究[J].中國科學：生命科學，2016，46（2）：192-198.

[14] YANG Y，LU JY，WU X，et al. G-protein-coupled receptor 35 is a target of the asthma drugs cromolyn disodium and nedocromil sodium[J]. Pharmacology，2010，86（1）：1-5.

[15] ADAMS R，WORTH CL，GUENTHER S，et al. Binding sites in membrane proteins-diversity，druggability and prospects[J]. Eur J Cell Biol，2012，91（4）：326-339.

[16] DENG H，HU H，LING S，et al. Discovery of natural phenols as G protein-coupled receptor-35 （GPR35） agonists[J]. ACS Med Chem Lett，2012，3（2）：165-169.

[17] 芮雯，馮毅凡，劉守鉀，等.毛茛黃酮類成分的UPLC HILIC/Q-TOF-MS分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7（8）：18- 21.

[18] GARCEZ WS，YOSHIDA M，GOTTLIEB OR. Benzylisoquinoline alkaloids and flavonols from Ocotea vellosiana[J]. Phytochemistry，1995，39（4）：815-816.

[19] 張丹.草麻黃表觀型化學組成特征研究? 柳葉白前化學成分的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2014.

[20] 陶華明.麻黃根及羊齒天門冬化學成分研究[D].長春：吉林大學，2009.

[21] 雍潘，劉圓，呂露陽，等.基于UPLC-ESI-HRMSn技術的藏藥塔黃的化學成分分析[J].中草藥，2019，50（5）：1066- 1074.

[22] 戚軍超，周海梅，馬錦琦，等.牡丹籽油化學成分GC-MS分析[J].糧食與油脂，2005，11（11）：23-24.

[23] 李小棟.桂枝麻黃各半湯化學成分的液相色譜-質(zhì)譜分析及其抗炎活性研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學，2015.

[24] 李睿，曾岑，王平，等.基于GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS的麻黃湯化學成分識別[J].中國中藥雜志，2014，39（4）：704-709.

[25] 馮美玲，王書芳，張興賢.枸杞子的化學成分研究[J].中草藥，2013，44（3）：265-268.

[26] PUREV O，POSPISIL F，MOTL O. Flavonoids from Ephedra sinica stapf[J]. Collect Czech Chem Commun，1988，53（12）：3193-3196.

[27] 周玲，吳德康，唐于平，等.麻黃中化學成分研究進展[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2008，24（1）：71-74.

[28] 范彥博.麻黃中非生物堿類成分活性研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學，2010.

[29] OSHIMA N. Efficient preparation of ephedrine alkaloids- free Ephedra Herb extract and its antitumor effect and putative marker compound[J]. Yakugaku Zasshi，2017，137（2）：173-177.

[30] 史麗穎，陳瑤，盧軒，等.麻黃中生物堿類成分富集新方法及化學成分分析[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（21）：56-61.

（收稿日期：2019-11-20 修回日期：2020-03-20）

（編輯：林 靜）