人腦多形性膠質母細胞瘤的綜合基因組分析明確核受體輔激活因子4的預后價值及相關作用機制

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【摘要】 目的：利用生物信息學方法研究核受體輔激活因子4（NCOA4）表達與人腦多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）患者總生存時間的關系并探討其潛在機制。方法：將來源于癌癥基因組圖譜（TCGA）的152例GBM患者先按三等分法分為NCOA4高、中、低表達組（n=51、50、51），再按最佳界值法分為NCOA4高表達組（n=29）與低表達組（n=123），比較各組生存時間。將來源于人類腫瘤相關基因表達匯編（GEO）數(shù)據庫的GSE7696數(shù)據集的70例GBM患者按三等分法分為NCOA4高、中、低表達組（n=23、24、23）。比較各組生存時間，分析影響GBM患者術后獨立預后因素。基于TCGA中GBM患者的level 3 RNASeqV2基因組數(shù)據進行基因集富集分析確定NCOA4在GBM中發(fā)揮作用的關鍵機制。結果：TCGA數(shù)據庫中根據三等分法分組的NCOA4高表達組中位生存時間明顯長于NCOA4中、低表達組（P=0.005）;根據最佳界值法分組的NCOA4高表達組中位生存時間明顯長于低表達組（P<0.001）。GSE7696數(shù)據集中NCOA4高表達組中位生存時間明顯長于NCOA4中、低表達組（P=0.022）。NCOA4表達水平為影響術后GBM患者的獨立預后因素（P=0.041）。在GBM中發(fā)揮作用的關鍵是溶酶體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、趨化因子和Toll樣受體相關的信號通路。結論：NCOA4表達增高是預測術后GBM患者預后良好的獨立因素，而溶酶體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、趨化因子和Toll樣受體作用的增強可能是NCOA4在GBM中影響預后的重要作用機制。

【關鍵詞】 核受體輔激活因子4 生物信息學 多形性膠質母細胞瘤

[Abstract] Objective： To study the relationship between the expression of nuclear receptor coactivator 4 （NCOA4） and the total survival time of patients with human brain glioblastoma multiforme （GBM） by bioinformatics method and to explore its potential mechanism. Method： The 152 GBM patients derived from the cancer genome atlas （TCGA） were firstly divided into NCOA4 high， medium and low expression groups （n=51， 50， 51） according to the trisection method， and then divided into NCOA4 high expression group （n=29） and low expression group （n=123） according to the optimal cutoff method. The survival time of each group was compared. The 70 GBM patients from the GSE7696 dataset of the human tumor related gene expression omnibus （GEO） database were divided into NCOA4 high， medium and low expression groups （n=23， 24， 23）. Survival time of each group was compared， and independent prognostic factors affecting postoperative GBM patients were analyzed. Gene set enrichment analysis was performed based on level 3 RNASeqV2 genomic data of GBM patients in TCGA to determine the key mechanism of the role of NCOA4 in GBM. Result： In TCGA database， the median survival time of the NCOA4 high expression group grouped according to the method of trisection were significantly higher than those of the NCOA4 medium and low expression group （P=0.005）. The median survival time of the NCOA4 high expression group grouped according to the optimal cutoff method was significantly higher than that of the low expression group （P<0.001）. The median survival time of the NCOA4 high expression group in GSE7696 data set were significantly higher than those of the NCOA4 medium and low expression group （P=0.022）. The expression level of NCOA4 was an independent prognostic factor for the postoperative GBM patients （P=0.041）. The key roles in GBM were lysosomes， natural killer cell-mediated cytotoxicity， chemokines， and Toll-like receptor related signaling pathways. Conclusion： The increased expression of NCOA4 is an independent factor in predicting the favourable prognosis of postoperative GBM patients， and lysosomes， natural killer cell-mediated cytotoxicity， chemokines and Toll-like receptor enhancement may be the important mechanisms of NCOA4 affecting the prognosis in GBM.

[Key words] Nuclear receptor coactivator 4 Bioinformatics Glioblastoma multiforme

First-authors address： Panjin City Centre Hospital， Panjin 124010， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.038

多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）作為顱內惡性程度最高的惡性腫瘤，患者多于確診2年內死亡，除血供豐富、高度浸潤以及逃逸攻擊等機制外，其獨特的發(fā)生發(fā)展機制備受廣大研究者關注[1]。研究表明GBM不但進展迅速，而且異質性顯著，因此在大規(guī)模數(shù)據分析的基礎上，深入探討GBM發(fā)生發(fā)展的相關因素及分子機制，對于優(yōu)化GBM的診治和改善患者的生存，具有重要的臨床指導意義[2]。核受體輔激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4），也被稱為雄激素受體相關蛋白70（ARA70），可與雄激素受體AR結合并依賴于配體的結合增強AR及相關基因的轉錄活性，也可以作為過氧化物酶體增殖物激活受體-γ的共激活因子以配體非依賴性的方式發(fā)揮轉錄輔助功能[3-4]。最初是作為RET融合基因在一系列乳頭狀甲狀腺癌被發(fā)現(xiàn)的。后來研究表明NCOA4為多種核受體的共激活因子，是調節(jié)鐵代謝的重要蛋白，在調節(jié)細胞內和系統(tǒng)內鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5]。近年來研究表明，NCOA4被發(fā)現(xiàn)表達于多種惡性腫瘤如胰腺癌，膀胱癌等并影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，對惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管生成、轉移等多種生物學行為發(fā)揮作用[6]。但關于NCOA4在GBM中的表達及預后，尚無報道。本研究通過整合在線高通量數(shù)據，利用單因素和多因素的生存分析結合基因集富集分析（GSEA），明確NCOA4表達對GBM術后患者預后的預測作用以及潛在作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據篩選 生物信息學研究數(shù)據的主要篩選條件：（1）具有完整的生存資料;（2）基因表達譜數(shù)據完整。首先，通過檢索人類腫瘤相關基因表達匯編（GEO）數(shù)據庫（http：//www.ncb.nlm.nih.gov/geo），獲取GBM樣本GSE7696數(shù)據集的數(shù)據;其次，檢索并獲取癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中GBM患者的level 3 RNASeqV2基因組數(shù)據。

1.2 方法

1.2.1 初步確定NCOA4表達與GBM患者總生存的關系 針對來源于TCGA的患者數(shù)據，首先對GBM組織中NCOA4表達量進行排序，通過三等分法，以66.67%和33.33%作為NCOA4表達量分級的界值將GBM患者分為高、中、低表達三組，結合患者的總生存率，分別采用R/survival函數(shù)包survfit和plot函數(shù)以及survdiff函數(shù)先后繪制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線并進行l(wèi)og-rank檢驗計算P值。然后根據R/Maxstat函數(shù)包獲取該數(shù)據集中NCOA4表達量分級的最佳界值，再按最佳界值法將GBM患者分為NCOA4高表達組和低表達組，重復上述K-M log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。由此先后通過三等分法和最佳界值法初步確定NCOA4表達與GBM患者總生存的關系。

1.2.2 GEO數(shù)據集對TCGA數(shù)據生存分析的結果進行外部驗證 針對來源于GEO數(shù)據庫的GSE7696數(shù)據集，先對GBM組織中NCOA4表達量進行排序，通過三等分法，以66.67%和33.33%作為界值將GBM患者分為高、中、低表達三組。結合患者總生存時間，先利用K-M log-rank 法繪制生存曲線并計算P值，再進行Cox多因素回歸分析，與患者年齡，性別和術后治療方案等指標進行協(xié)同分析，確定NCOA4表達對于術后GBM患者總生存的獨立預測價值。以P<0.05作為差異顯著的判定標準。

1.2.3 基因集富集分析（GSEA）明確NCOA4在GBM中的關鍵作用機制 利用TCGA數(shù)據集，首先根據GBM組織中NCOA4表達量的中位值（2.97）將患者分為低表達組和高表達組，再利用GSEA 2.2.2版軟件，以MsigDB數(shù)據庫中的h.all.v5.2.symbols.gmt數(shù)據集為參照基因集，設置隨機組合次數(shù)為1 000次，進行加權富集統(tǒng)計分析，找出與NCOA4表達水平顯著相關的基因集，即為NCOA4參與的信號通路。P<0.05且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）<0.25作為顯著富集基因集的判定標準。

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據庫中不同NCOA4表達與GBM患者的生存關系 TCGA數(shù)據庫中共152例GBM患者[男98例，女54例，年齡為60.5（51.8，70.0）歲]，根據三等分法分為NCOA4高、中、低表達組（n=51、50、51），進一步K-M生存分析顯示NCOA4高表達組生存時間為510（388，737）d明顯長于NCOA4中、低表達組的384（329，505）和382（239，442）d，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.005），見圖1A。其次，利用最佳界值法，以NCOA4表達量分級的最佳界值4.3（maxstat函數(shù)分析，見圖1B）作為標準，將GBM患者分為NCOA4高表達組（29例）和低表達組（123例），K-M分析進一步證實NCOA4高表達組的生存時間為632（489，未達到）d明顯長于低表達組的384（335，442）d，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見圖1C。

2.2 GSE7696數(shù)據集中不同NCOA4表達與GBM患者的生存關系及預后影響因素 根據GSE7696中70例術后GBM患者的series matrix數(shù)據和生存信息進行分析，其中男51例，女19例;年齡為52.2（45.6，57.1）歲。NCOA4高表達患者23例，中表達患者24例，低表達患者23例。NCOA4高表達患者生存時間為17.0（10.6，未達到）個月明顯長于中、低表達患者的14.3（9.1，16.0）個月、14.3（8.9，17.3）個月（P=0.022），見圖2。Cox多因素回歸分析顯示，NCOA4表達水平為影響術后GBM患者的獨立預后因素（P=0.041），NCOA4高表達的患者預后良好，見表1。

2.3 GSEA確定NCOA4在GBM的關鍵作用機制 NCOA4高表達與KEGG_LYSOSOME，KEGG_NATURAL_KILLER_CELL_MEDIATED_CYTOTOXICITY，KEGG_TOLL_LIKE_RECEPTOR_SINGALING_PATHWAY和KEGG_CHEMOKINE_SINGALING_PATHWAY等基因集顯著相關（P<0.01），因此，參與溶酶體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、趨化因子和Toll樣受體等信號通路為NCOA4影響術后GBM患者預后的關鍵機制。見圖3。

3 討論

鐵死亡（ferroptosis）是2012年美國Brent R. Stockwell實驗室發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞死亡方式[7]。鐵死亡同其他細胞死亡方式一樣受信號通路的調節(jié)，其發(fā)生的關鍵是鐵的累積和脂質過氧化反應。鐵蛋白（ferritin）能夠調節(jié)鐵離子誘導的鐵死亡的發(fā)生，它能被特異性受體NCOA4識別，從而形成自噬小體參與溶酶體的降解，并導致游離鐵離子的釋放[8]。近年來對鐵死亡的深入研究表明，細胞的鐵死亡與癌癥、腎衰竭、神經退行性疾病、心腦血管疾病等多種疾病相關[8]。另外目前研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質瘤細胞比其他腫瘤細胞能夠更有效地從微環(huán)境中攝取鐵，鐵死亡的失控可能與膠質瘤的惡性進展存在密切的關系[9]。研究表明在鐵死亡中NCOA4是一種選擇性的運載受體，可用于鐵蛋白的選擇性自噬;同樣NCOA4的遺傳抑制可抑制鐵蛋白降解，并抑制鐵死亡。Gao等[10]通過RNAi技術，發(fā)現(xiàn)一批自噬相關基因參與調解鐵死亡過程，敲除自噬相關基因ATG5、ATG7或NCOA4可以抑制鐵蛋白自噬性降解過程，從而抑制細胞鐵死亡;過度表達NCOA4則可以通過促進鐵蛋白降解誘導細胞鐵死亡。本文首先利用TCGA和GEO數(shù)據集，結合生物信息學分析方法，證實在GBM組織中，NCOA4高表達患者的生存期更長，兩個數(shù)據集的結果基本一致。結果提示GBM組織中NCOA4低表達者預后較差，故NCOA4表達可作為評價GBM患者預后的指標。

膠質瘤發(fā)生發(fā)展涉及眾多通路相互作用形成信號通路網共同發(fā)揮作用，已有研究表明，NK介導的細胞毒性信號通路可調節(jié)NK細胞的細胞毒性作用起到抑癌作用，減弱NK細胞對膠質瘤細胞的識別和殺傷，引起膠質瘤細胞的過度增殖并最終影響膠質瘤患者的預后[11]。另外多種趨化因子及其受體在膠質瘤中表達升高，可促進膠質瘤細胞侵襲、增殖、存活、上皮間質轉化[12]。研究發(fā)現(xiàn)在鐵自噬發(fā)生過程中需要NCOA4作為貨物受體特異性的識別鐵蛋白與自噬小體結合，通過自噬-溶酶體途徑可調控鐵自噬的發(fā)生[13]。同時Toll樣受體信號通路對膠質瘤的生長、分化、入侵及遷移至關重要，激活Toll樣受體信號通路，導致膠質瘤細胞過度增殖、侵襲力增強，最終影響患者預后[14]。為研究NCOA4高表達狀態(tài)所激活的信號通路對膠質瘤細胞生物學功能的影響，本文采用基因富集分析進行相關研究，發(fā)現(xiàn)當NCOA4高表達時可激活上述四條影響膠質瘤細胞生物學功能的重要信號通路。

綜上所述，本研究利用TCGA及GEO數(shù)據庫推測出GBM組織NCOA4高表達提示GBM患者預后更好，NCOA4可能參與調節(jié)溶酶體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、趨化因子和Toll樣受體四條信號通路，最終影響患者預后。本文通過研究調控網絡對膠質瘤細胞生物學功能的影響，探索膠質瘤的發(fā)病機制，為尋找膠質瘤綜合治療的新靶點提供幫助。

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（收稿日期：2020-04-10） （本文編輯：田婧）