miR-508-5p介導mTOR對骨肉瘤細胞自噬的影響

彭麗嬌　吳廷瑞　李驍　黃靜

【摘要】 目的：探討miR-508-5p對骨肉瘤細胞自噬及雷帕霉素靶向基因（mTOR）信號通路的影響。方法：收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織，另購買人骨肉瘤細胞株MG-63與人成骨細胞hFOB，采用RT-PCR法檢測各組織與細胞中miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量;將MG-63細胞分成三組：空白組不進行轉染，NC組轉染空載質粒，過表達組轉染miR-508-5p重組質粒，采用CCK-8法檢測轉染培養(yǎng)后的三組細胞增殖情況，流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率，采用RT-PCR法檢測各組miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量;采用Western blot法檢測細胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量。結果：相比癌旁正常組織與hFOB細胞，癌組織與MG-63細胞中miR-508-5p相對表達量均明顯降低，而mTOR mRNA的相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;相比空白組與NC組，過表達組miR-508-5p相對表達量明顯上升，mTOR mRNA的相對表達量明顯降低，細胞OD值明顯降低，凋亡率明顯增加，Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量均升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：miR-508-5p在骨肉瘤細胞中呈現(xiàn)低表達趨勢，過表達miR-508-5p后可通過抑制mTOR通路，引發(fā)細胞自噬，從而抑制細胞增殖與促進細胞凋亡。

【關鍵詞】 miR-508-5p 骨肉瘤 細胞自噬 雷帕霉素靶向基因 細胞系

[Abstract] Objective： To investigate the effect of miR-508-5p on autophagy and rapamycin targeting gene （mTOR） signaling pathway in osteosarcoma cells. Method： A total of 59 cases of osteosarcoma in our hospital in the past five years were collected from cancer tissues and adjacent tissues， and human osteosarcoma cell line MG-63 and human osteoblasts hFOB were purchased. miR-508-5p and mTOR were detected by RT-PCR MG-63 cells were divided into three groups： blank group was not transfected， NC group was transfected with empty plasmid， over expression group was transfected with miR-508-5p recombinant plasmid， CCK-8 method was used to detect the proliferation of three groups of cells after transfection， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of three groups， RT-PCR method was used to detect the relative expression of miR-508-5p and mTOR mRNA in each group; Western blot was used to detect the relative expression of mTOR， Bax， Bcl-2， LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ in the cells. Result： The relative expression of miR-508-5p in cancer tissue and MG-63 cell were significantly lower than those in normal tissue and hFOB cell， while the relative expression of mTOR mRNA were significantly higher， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with the blank group and NC group， the relative expression of miR-508-5p， mTOR mRNA， odvalue， apoptosis rate， Bax and LC3-Ⅱ protein in the overexpression group increased significantly， while the relative expression of mTOR， Bcl-2 and LC3-Ⅰ protein decreased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-508-5p was low in osteosarcoma cells， and the over expression of miR-508-5p can induce autophagy by inhibiting mTOR pathway， thus inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis.

[Key words] miR-508-5p Osteosarcoma Autophagy Mammalian target of rapamycin Cell line

First-authors address： The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.002

骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是由于間充質干細胞向成骨細胞的遺傳與表觀遺傳分化引起的一種惡性腫瘤，在兒童與青少年中較為常見。骨肉瘤生長迅速，有著較高的組織破壞性與遷移率，傳統(tǒng)的手術切除預后并不理想，因此，尋找新的有效控制措施對改善患者的預后有著十分重要的意義[1-2]。近年來分子靶向治療為臨床及研究的熱點，與腫瘤形成與進展的信號通路及相關的基因相繼被發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）則是其中一類。相關研究表明，miR-508-5p在骨肉瘤中表達異常，且與骨肉瘤的分期有關，可能參與骨肉瘤的發(fā)生與進展，有望成為新的靶向治療點[3]。雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin，mTOR）是與腫瘤形成密切相關的一個重要的真核細胞信號，參與免疫抑制、轉錄與蛋白合成，具有調節(jié)細胞自噬、生長與凋亡等，在多種癌癥中表達異常，其調控的信號機制目前研究得較多[4-6]?；诖?，本文探討了骨肉瘤中miR-508-5p表達及其可能的調控信號機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織，所有患者均經(jīng)影像學檢查與術后病理確診為骨肉瘤，患者組織收集前未進行過放化療。59例患者中男38例，女21例，平均年齡（21.50±10.55）歲。

1.2 材料與試劑 人骨肉瘤細胞MG-63與人成骨細胞hFOB1.19均來源于中科院細胞庫，MEM與DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，LipofectaminTM 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，Taqman miRNA檢測試劑盒與實時熒光PCR儀購自美國ABI公司，兔抗人抗體與GAPDH兔抗人抗體、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自美國Sigma公司，HRP標記的山羊抗兔IgG購自美國KPL公司，RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自上海索萊寶生物技術公司，ECL電化學發(fā)光顯影液購自Invitrogen，CCK8試劑盒購自南京固與生物，引物序列由廣州生工生物設計合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 將hFOB細胞株培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于33.5 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，MG-63細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，得到對數(shù)期生長MG-63細胞，隨機分為三組進行相應的操作：空白組不進行轉染，NC組轉染空載質粒，過表達組轉染miR-508-5p重組質粒，轉染48 h。以下每組檢測均設置3個平行復孔，每孔重復檢測3次取平均值。

1.3.2 各組織與細胞中mRNA相對表達量的測

定 對所有患者癌組織與癌旁正常組織、未轉染的對數(shù)期MG-63與hFOB細胞、轉染后的三組細胞分別提取總RNA，進行逆轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR法檢測miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算相對表達含量。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染48 h后的三組細胞以胰酶消化，制成細胞懸液，取100 μL/孔接種于96孔板，加入CCK-8后在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，采用酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將轉染48 h的三組細胞以胰酶消化，收集于流式管內(nèi)，6 ℃預冷孵育，以1*Annexin V結合液懸浮細胞，Annexin V-FITC著色，置于4 ℃冰箱避光靜置后，加入PI混勻靜置，使用流式細胞儀檢測，計算三組凋亡率（%）=（早晚期凋亡細胞數(shù)之和/總細胞數(shù)）×100%。

1.3.5 Western blot檢測蛋白相對表達量 提取轉染后三組細胞的總蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度，進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉、封閉，添加一抗后4 ℃孵育過夜，滴加HRP標記的山羊抗兔IgG后在室溫孵育1 h，采用電化學發(fā)光顯色，掃描條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算各蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行比較，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織及其細胞系中miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量比較 與癌旁正常組織（1.22±0.47）比較，骨肉瘤組織中miR-508-5p相對表達量（0.41±0.15）明顯降低（t=7.767，P<0.05）;與癌旁正常組織（1.03±0.31）比較，骨肉瘤組織中mTOR mRNA的相對表達量（1.62±0.59）明顯升高（t=7.853，P<0.05）;與人成骨細胞hFOB（1.07±0.08）比較，骨肉瘤細胞系MG-63中miR-508-5p相對表達量（0.53±0.09）明顯降低（t=7.767，P<0.05）;與人成骨細胞hFOB（0.98±0.09）比較，骨肉瘤細胞系MG-63中mTOR mRNA的相對表達量（1.59±0.10）明顯升高（t=7.853，P<0.05）。見圖1。

2.2 細胞轉染后三組細胞miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量比較 相比空白組（0.61±0.11）與NC組（0.65±0.10），過表達組miR-508-5p相對表達量（6.38±1.82）明顯上升（F=29.757，P<0.05）;相比空白組（1.16±0.09）與NC組（1.08±0.11），過表達組mTOR mRNA的相對表達量（0.61±0.11）明顯降低（F=26.315，P<0.05）。見圖2。

2.3 轉染后三組細胞增殖情況與凋亡率比較 相比空白組（0.58±0.03）與NC組（0.55±0.06），過表達組細胞48 h OD值（0.36±0.04）明顯降低（F=21.000，P<0.05）;相比空白組（3.26±0.73）%與NC組（3.24±0.61）%，過表達組48 h細胞凋亡率（15.39±1.95）%明顯增加（F=93.922，P<0.05）。見圖3。

2.4 轉染后三組細胞中mTOR、Bax、Bcl-2與LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量比較 相比空白組與NC組，過表達組細胞Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），

見表1。

3 討論

miRNA是一種具有廣泛基因調節(jié)功能的非編碼RNA，具有多種生物學功能，可以通過與目標mRNA的非編碼區(qū)域以堿基配對的方式結合，從而促使mRNA降解或翻譯過程受阻滯，沉默相應的下游基因表達，進一步調節(jié)細胞內(nèi)多種病理生理活動，包括細胞周期調控、細胞增殖、分化與凋亡等過程[7-9]。相關研究指出多種miRNA均參與了骨肉瘤的發(fā)生、進展，例如，miR-34a作為抑癌基因p53的直接靶向miRNA，過表達后可以抑制腫瘤細胞增殖;miR-570-3p表達上調可抑制肺癌轉移相關蛋白與凋亡相關的翻譯從而抑制骨肉瘤細胞的轉移;miR-222可通過下調腫瘤啟動因子從而抑制腫瘤細胞增殖與侵襲能力[10-12]。除此之外，不斷有新的miRNA在臨床研究中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這將為骨肉瘤的藥物治療提供新的靶點。

本研究通過對本院收治的109例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)miR-508-5p在癌組織中呈現(xiàn)低表達趨勢，而mTOR則呈現(xiàn)高表達趨勢，提示這兩種分子均可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關。既往關江鋒等[3]通過檢測66例骨肉瘤組織和31例骨軟骨瘤組織中miR-508-5p的表達量亦發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miR-508-5p呈低表達，其表達量與分期及AKP水平有關，通過生存分析還發(fā)現(xiàn)miR-508-5p低表達與患者較短生存期相關，提示其對預后有一定價值[3]。mTOR是細胞自噬調控通路中關鍵負調節(jié)因子，可以通過影響下游自噬復合體的形成，進而抑制細胞自噬，在多種癌癥中已被發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)高表達趨勢[13-15]。同樣在骨肉瘤細胞系MG-63細胞與成骨細胞hFOB中亦表現(xiàn)出癌組織與正常組織中的差異，亦可說明同樣的道理。

為進一步驗證miR-508-5p與骨肉瘤細胞自噬的關系，筆者構建了miR-508-5p重組質粒過表達載體轉染細胞株，通過RT-PCR檢測證明轉染組miR-508-5p相對表達量明顯上升，mTOR mRNA的相對表達量明顯降低，表明過表達的細胞模型構建成功。相比空白組與NC組，過表達組細胞OD值明顯降低，凋亡率明顯增加，這進一步提示上調miR-508-5p的表達可抑制腫瘤細胞增殖與促進細胞凋亡，具體的機制可能與如下的分子檢測結果相關。通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量均升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量均降低。Bax與Bcl-2是一對拮抗的調控細胞凋亡因子，Bax升高而Bcl-2降低導致細胞凋亡率升高[16-17];而LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ則是與自噬相關的一對調控因子，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加導致細胞自噬增多，這與mTOR比值降低時協(xié)同發(fā)生，導致骨肉瘤細胞自噬增加，從而使得細胞增殖率降低，凋亡率升高[18-19]。

綜上所述，miR-508-5p在骨肉瘤細胞中呈現(xiàn)低表達趨勢，過表達miR-508-5p后可通過抑制mTOR通路，引發(fā)細胞自噬，從而抑制細胞增殖與促進細胞凋亡。

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（收稿日期：2020-04-09） （本文編輯：張爽）