ARTP-DES連續(xù)誘變選育高產(chǎn)ε-聚賴氨酸突變株

席志文,黃林娜,翟一暢,惠豐立

(南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,河南 南陽(yáng) 473061)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由鏈霉菌產(chǎn)生的由25～35賴氨酸單體組成的一種天然聚合物。由于其具有廣譜抑菌性[1],被廣泛應(yīng)用于食品保鮮行業(yè)[2-3]。此外,ε-PL還具有水溶性好、熱穩(wěn)定強(qiáng)、安全性能高等優(yōu)點(diǎn),在醫(yī)學(xué)、農(nóng)藥等領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用潛力[4-5]。野生型菌株ε-PL產(chǎn)量很低,無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)野生菌株進(jìn)行選育以提高其ε-PL產(chǎn)量在工業(yè)化生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位。日本學(xué)者最早通過選育S-2-氨乙基-L-半胱氨酸抗性菌株,獲得了搖瓶產(chǎn)量2.1 g/L的高產(chǎn)ε-PL菌株,提高了近20 倍[6]。國(guó)內(nèi)也有一些文獻(xiàn)報(bào)道[7-12]。陳緯緯等[7]對(duì)Kitasatospora PL623采用硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)誘變,將其ε-PL搖瓶產(chǎn)量提高了2 倍,達(dá)到1.17 g/L;Zong Hong等[8]通過對(duì)Streptomyces albulus A-29進(jìn)行ARTP誘變,其ε-PL產(chǎn)量從0.40 g/L提高至1.59 g/L。近年來核糖體工程技術(shù)[13-17]、原生質(zhì)體融合[18-21]以及分子學(xué)手段[22-23]等也引入到ε-PL高產(chǎn)菌的選育中。吳光耀等[13]對(duì)S. albulus AS3-14連續(xù)引入鏈霉素和利福平兩種抗生素,獲得1 株雙抗高產(chǎn)突變株S. albulus WG-608,ε-PL搖瓶產(chǎn)量達(dá)到3.7 g/L,較出發(fā)菌株提高42.3%;Wang Liang等[14]通過基因組重排技術(shù)結(jié)合慶大霉素抗性篩選,得到1 株抗性突變株S. albulus AG3-28,ε-PL搖瓶產(chǎn)量為3.43 g/L,較出發(fā)菌株提升49.1%。可見不管采用何種選育手段,只要確定合適的條件,都能一定程度提高目的菌株的ε-PL產(chǎn)量。

傳統(tǒng)誘變不需要了解菌株自身復(fù)雜的遺傳背景,可以直接進(jìn)行誘變,誘變過程簡(jiǎn)單[24]。其關(guān)鍵在于確定合適的誘變及篩選手段。新興的誘變技術(shù)雖然篩選效率較高,但是由于代謝合成過程的高度復(fù)雜,也面臨著遺傳穩(wěn)定性較低、過程繁瑣等問題。目前對(duì)于產(chǎn)ε-PL菌株的選育主要是以傳統(tǒng)誘變?yōu)榛A(chǔ)的非理性改造,主要集中在單因子誘變及多因子間斷誘變[7-11],誘變效果不盡相同。對(duì)于多因子連續(xù)誘變的研究較少。有學(xué)者對(duì)1 株工業(yè)釀酒酵母采用己烯雌酚和紫外線連續(xù)復(fù)合誘變,得到的高產(chǎn)菌株乙醇產(chǎn)量高于常規(guī)誘變獲得的菌株,且此方法正突變率也高于常規(guī)復(fù)合誘變[25]。因此,本研究以傳統(tǒng)誘變?yōu)榛A(chǔ),對(duì)1 株ε-PL產(chǎn)生菌小白鏈霉菌S. albulus進(jìn)行常溫室壓等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)與DES兩因子連續(xù)誘變,通過ARTP誘變創(chuàng)造豐富的突變基因組文庫(kù),以突變文庫(kù)作為DES誘變的“出發(fā)菌株”,并改進(jìn)突變菌篩選方法,探究一種更高效的選育方法,以期獲得1 株性能穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株,為其工業(yè)化打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

工業(yè)菌株小白鏈霉菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

貝特納固體培養(yǎng)基:葡萄糖1%,蛋白胨0.2%,酵母粉0.1%,瓊脂2%,pH 7.5;M3G種子(發(fā)酵)培養(yǎng)基:葡萄糖5%,酵母粉0.5%,硫酸銨1%,磷酸二氫鉀0.14%,磷酸氫二鉀0.08%,七水合硫酸鎂0.05%,硫酸鋅0.004%,硫酸鐵0.003%,pH 6.8;優(yōu)化培養(yǎng)基[13]:葡萄糖6%,酵母粉0.8%,硫酸銨0.5%,七水合硫酸鎂0.2%,磷酸二氫鉀0.2%,硫酸鋅0.003%,硫酸鐵0.004%,pH 6.8;RSM培養(yǎng)基[13]:葡萄糖6%,牛肉膏1%,硫酸銨0.5%,七水合硫酸鎂0.08%,磷酸二氫鉀0.4%,硫酸鐵0.004%,pH 6.8;亞甲基藍(lán)培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基加0.002%亞甲基藍(lán)。上述培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP誘變育種系統(tǒng) 無錫源清天木生物科技有限公司;多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer公司;ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;SGD-IV型還原糖測(cè)定儀 山東省科學(xué)院生物研究所;MB100-4A型微孔板恒溫振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;CT14RD11臺(tái)式離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸浮液制備

將出發(fā)菌株在貝特納固體平板上活化,30 ℃培養(yǎng)5～7 d至孢子長(zhǎng)滿平板,用15%的滅菌甘油沖洗下孢子,經(jīng)4 層無菌擦鏡紙過濾2 次,適當(dāng)稀釋孢子懸液,使其濃度在108CFU/mL左右,-80 ℃保藏備用。

1.3.2 小白鏈霉菌的連續(xù)誘變

1.3.2.1 ARTP誘變

取出發(fā)菌株孢子懸液10 μL均勻涂到無菌金屬誘變片上,將裝有誘變片的平皿轉(zhuǎn)移至提前滅菌的ARTP誘變儀工作室中。工作電壓110 W,照射距離2 mm,工作氣流10 slpm,設(shè)置照射時(shí)間30、45、60、90、105、120、150、180 s。將處理過的誘變片于1 mL生理鹽水的EP管中充分混勻,稀釋涂布平板,每個(gè)時(shí)間設(shè)置3 個(gè)平行,30 ℃培養(yǎng)3～5 d,記錄每個(gè)平板的菌落數(shù),以出發(fā)菌株的菌落數(shù)作對(duì)照,計(jì)算致死率。

1.3.2.2 ARTP-DES連續(xù)誘變

選取合適的ARTP誘變條件對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變,將所得孢子懸液于恒溫?fù)u床30 ℃培養(yǎng)30 min后加入到pH 7.0磷酸緩沖液中,配成20 mL反應(yīng)體系,分別加入40、80、120、160、200 μL DES,使其反應(yīng)體積分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,30 ℃避光反應(yīng)20 min后加入25%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)終止反應(yīng),稀釋涂布平板,30 ℃培養(yǎng)3～5 d,以孵育后的孢子懸液為對(duì)照,根據(jù)平板菌落數(shù)計(jì)算連續(xù)誘變致死率。圖1為連續(xù)誘變技術(shù)流程圖。

圖1 連續(xù)誘變流程Fig. 1 Flowchart of continuous mutagenesis

1.3.3 突變菌株的篩選

將誘變后的孢子懸液梯度稀釋,均勻涂布鏈霉素最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)抗性平板,30 ℃培養(yǎng)5～7 d。初篩時(shí)用無菌牙簽挑取抗性平板上剛長(zhǎng)出的單菌落至亞甲基藍(lán)平板中,30 ℃培養(yǎng)5～7 d,選取透明圈較大的單菌落劃線貝特那固體平板培養(yǎng)3～5 d。挑取平板上成熟孢子接種至M3G種子培養(yǎng)基的48微孔板中(裝液量0.5 mL),30 ℃、500 r/min培養(yǎng)24 h;以10%接種量轉(zhuǎn)接種子液至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中,每孔3 個(gè)平行,30 ℃、500 r/min培養(yǎng)84 h。采用酶標(biāo)儀對(duì)其ε-PL含量快速測(cè)定。挑選ε-PL產(chǎn)量得到提升的菌株劃線貝特那固體平板。

復(fù)篩時(shí)挑取初篩所得菌株的孢子至裝有20 mL M3G種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,培養(yǎng)24 h,以10%接種量轉(zhuǎn)接種子液至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)84 h。搖瓶培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min。測(cè)定ε-PL含量,選出高產(chǎn)菌株。

1.3.4 指標(biāo)分析測(cè)定

1.3.4.1 突變率及正突變率

突變率及正突變率計(jì)算如式(1)、(2)所示:

式中:T為挑選菌落總數(shù);M為突變菌總數(shù)(為避免誤差,選取產(chǎn)量高于或低于出發(fā)菌株5%以上的菌株);P為ε-PL產(chǎn)量大于出發(fā)菌株5%以上的突變菌總數(shù)。

1.3.4.2 ε-PL含量測(cè)定

參考甲基橙測(cè)定法[26]:取1 mL發(fā)酵液,8 000 r/min離心15 min,上清液用0.7 mmol/L pH 6.9磷酸緩沖液稀釋,使ε-PL質(zhì)量濃度在0.01～0.12 g/L之間。2 mL稀釋液與等體積1 mmol/L甲基橙溶液振蕩反應(yīng),30 ℃、200 r/min反應(yīng)30 min。離心上清稀釋20 倍后吸取250 μL加入96 微孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)定465 nm波長(zhǎng)處的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ε-PL質(zhì)量濃度。

1.3.4.3 菌體干質(zhì)量測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液,8 000 r/min離心10 min,棄上清液,用無菌水洗滌2 次,用提前稱量的濾紙過濾,100 ℃過夜烘至質(zhì)量恒定,得到菌體干質(zhì)量。

1.3.4.4 發(fā)酵液葡萄糖含量測(cè)定

采用SGD-IV型還原糖測(cè)定儀測(cè)定。

1.3.5 高產(chǎn)菌株生理特性

1.3.5.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵性能測(cè)試

刮取平板上突變菌株AD-9與出發(fā)菌株孢子接種至裝有20 mL M3G種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h,后按10%接種量分別接種至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基、RSM培養(yǎng)基及優(yōu)化培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)84 h。檢測(cè)發(fā)酵液ε-PL質(zhì)量濃度。

1.3.5.2 發(fā)酵過程中菌絲球差異

刮取平板上突變菌株AD-9與出發(fā)菌株孢子接種至M3G種子培養(yǎng)基,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h,以10%接種量轉(zhuǎn)接至優(yōu)化培養(yǎng)基。取發(fā)酵至24、48、72 h的發(fā)酵液,采用微分干涉顯微鏡觀察菌絲球形態(tài)。

1.3.5.3 高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株搖瓶自然發(fā)酵過程比較

刮取平板上突變菌株AD-9與出發(fā)菌株孢子接種至M3G種子培養(yǎng)基,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h,后按10%接種量接種至優(yōu)化培養(yǎng)基,培養(yǎng)84 h。測(cè)定發(fā)酵過程中pH值、菌體干質(zhì)量及ε-PL含量,每隔12 h取一次樣,每瓶3 個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖像繪制均采用GraphPad Prism5軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白鏈霉菌的連續(xù)誘變

2.1.1 ARTP誘變時(shí)間確定

圖2 小白鏈霉菌ARTP誘變致死率曲線Fig. 2 Death rate of S. albluus caused by ARTP

圖2 結(jié)果表明,致死率隨誘變時(shí)間的延長(zhǎng)不斷變大,180 s致死率達(dá)到97.4%,接近100%。本研究為構(gòu)建多樣基因組文庫(kù),選取低(照射時(shí)間30 s、致死率36.8%)、中(照射時(shí)間60 s、致死率60.8%)、高(照射時(shí)間105 s、致死率87.6%)3 個(gè)致死率對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變。

2.1.2 DES誘變劑量的確定

按1.3.2.2節(jié)方法取出發(fā)菌株孢子懸液200 μL加入19.8 mL磷酸緩沖液中,分別加入40、80、120、160、200 μL DES原液,使其體積分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,30 ℃避光反應(yīng)20 min,反應(yīng)結(jié)束后立即加入1 mL 25% Na2S2O3溶液終止反應(yīng),以出發(fā)菌株孢子懸液作為對(duì)照,稀釋涂布平板,30 ℃培養(yǎng)3～5 d,根據(jù)平板菌落數(shù)計(jì)算致死率。出發(fā)菌株DES誘變致死率曲線如圖3所示,DES體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí),致死率達(dá)到97.1%,DES體積分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí),致死率為81.1%。本研究選取體積分?jǐn)?shù)0.6%為小白鏈霉菌的DES誘變劑量。

圖3 小白鏈霉菌DES誘變致死率曲線Fig. 3 Death rate of S. albluus caused by DES

2.1.3 ARTP-DES連續(xù)誘變劑量的確定

圖4 小白鏈霉菌ARTP-DES連續(xù)誘變致死率曲線Fig. 4 Death rate of S. albluus caused by ARTP-DES

連續(xù)誘變由于各種誘變因子的作用機(jī)制不同,因此可以取長(zhǎng)補(bǔ)短,動(dòng)搖DNA分子上多種基因的遺傳穩(wěn)定性,以彌補(bǔ)某種不親和性或熱點(diǎn)飽和現(xiàn)象,得到更多的突變類型[24]。根據(jù)小白鏈霉菌ARTP致死率曲線,以低、中、高3 個(gè)致死率對(duì)小白鏈霉菌誘變,得到的孢子懸液孵育30 min后配成20 mL DES反應(yīng)體系。以孵育后的孢子懸液為對(duì)照計(jì)算連續(xù)誘變致死率。如圖4所示,DES體積分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí),致死率達(dá)到86.45%。比相同劑量出發(fā)菌株DES誘變高5.35%,說明經(jīng)過一輪ARTP誘變后,突變孢子基因發(fā)生改變,對(duì)DES的敏感程度增強(qiáng)。根據(jù)育種經(jīng)驗(yàn),本研究選取DES體積分?jǐn)?shù)0.6%作為最佳誘變劑量。

2.2 突變菌株初篩方法的確定

2.2.1 鏈霉素MIC分析

核糖體工程通過對(duì)菌株引入抗生素抗性突變,進(jìn)而影響其核糖體結(jié)構(gòu)和次級(jí)代謝過程,造成次級(jí)代謝產(chǎn)物的大幅提升[27]。鏈霉素是作用于核糖體上的一種常用抗生素,它可以抑制mRNA翻譯起始,進(jìn)而影響微生物次級(jí)代謝,己有不少學(xué)者利用鏈霉素抗性突變并取得顯著效果[10,13,16]。將小白鏈霉菌孢子懸液涂布鏈霉素抗性平板,在鏈霉素質(zhì)量濃度1 μg/mL(圖5a)和3 μg/mL(圖5b)的平板上,菌落生長(zhǎng)受到抑制,生長(zhǎng)5 d之后未長(zhǎng)孢子,而鏈霉素質(zhì)量濃度在4 μg/mL(圖5c)時(shí),平板有生長(zhǎng)很小的單菌落,生長(zhǎng)極為緩慢,說明小白鏈霉菌生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制。MIC是指菌落在抗性平板上正好不生長(zhǎng)或只有極少數(shù)菌落生長(zhǎng)的最小濃度。本研究中鏈霉素對(duì)小白鏈霉菌具有明顯抑制作用,說明它可以作為抗性“篩子”對(duì)突變菌進(jìn)行篩選。為了擴(kuò)大篩選范圍,選取4 μg/mL為小白鏈霉菌對(duì)鏈霉素的MIC。

圖5 小白鏈霉菌在不同質(zhì)量濃度鏈霉素平板上的生長(zhǎng)情況Fig. 5 Growth of S. albulus on medium plates containing streptomycin at different concentrations

2.2.2 亞甲基藍(lán)透明圈法

圖6 突變菌株在亞甲基藍(lán)平板上的透明圈Fig. 6 Transparent circles on methylene blue plates produced by mutant strains

小白鏈霉菌ARTP誘變所得突變菌在亞甲基藍(lán)平板上的生長(zhǎng)情況如圖6所示,平板上呈現(xiàn)大小不同的透明圈。挑選透明圈較大的菌株進(jìn)行48微孔板發(fā)酵。突變菌ε-PL產(chǎn)量見圖7,在亞甲基藍(lán)平板上挑取的大部分菌株ε-PL產(chǎn)量提升。對(duì)初篩ε-PL產(chǎn)量提高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,得到1 株突變菌A-6,搖瓶產(chǎn)量為0.701 g/L,較出發(fā)菌株提高了16.8%?？梢婃溍顾乜剐越Y(jié)合亞甲基藍(lán)透明圈篩選可以作為快速篩選高產(chǎn)菌株的一種方法。有學(xué)者通過測(cè)量菌落透明圈的H/C值篩選高產(chǎn)菌株[28]。而本研究中挑取的單菌落為剛長(zhǎng)出的單菌落,大小基本一致,因此可以在同一條件肉眼比較透明圈的大小,省去了測(cè)量的繁瑣過程。

圖7 ARTP誘變初篩結(jié)果Fig. 7 Results of primary screening of ARTP-induced mutants

2.3 ARTP-DES連續(xù)誘變篩選結(jié)果

表1 ARTP-DES連續(xù)誘變突變株ε-PL產(chǎn)量比較Table 1 Comparison of ε-PL yields in ARTP-DES-induced mutants

表2 3 種誘變方法的突變率及正突變率Table 2 Mutation rates and positive mutation rates

挑取抗性平板上菌株898 株至亞甲基藍(lán)平板中,從中選擇透明圈較大的菌株547 株,對(duì)其進(jìn)行48 微孔板及搖瓶含量測(cè)定,搖瓶部分復(fù)篩結(jié)果見表1,突變菌株表現(xiàn)出ε-PL產(chǎn)量的大幅提升,其中菌株AD-1、AD-7、AD-9、AD-68搖瓶產(chǎn)量均超過1 g/L,AD-9的ε-PL產(chǎn)量為1.252 g/L,較出發(fā)菌株提升108.7%。為比較誘變效果,本研究也對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行單一的ARTP與DES誘變篩選,得到ARTP高產(chǎn)菌株A-6,ε-PL產(chǎn)量為0.701 g/L;DES高產(chǎn)菌株D-1,ε-PL產(chǎn)量為0.885 g/L。AD-9的ε-PL產(chǎn)量較A-6高78.6%,較D-1高41.5%。同時(shí),在進(jìn)行ARTP誘變、DES誘變、ARTP-DES連續(xù)誘變的過程中,隨機(jī)挑選鏈霉素抗性平板菌落各100 株進(jìn)行發(fā)酵測(cè)試,以ε-PL產(chǎn)量為指標(biāo)計(jì)算每種誘變100 個(gè)菌株的突變率及正突變率。由表2可知,3 種誘變突變率都較高,這得益于鏈霉素抗性篩選。DES誘變突變率及正突變率高于ARTP誘變,說明DES對(duì)細(xì)胞的誘變效應(yīng)更強(qiáng);連續(xù)誘變的突變率及正突變率都高于ARTP誘變和DES誘變,說明ARTP與DES連續(xù)誘變效果顯著,結(jié)合篩選得到的高產(chǎn)菌株,進(jìn)一步說明連續(xù)誘變可用于篩選高產(chǎn)ε-PL突變菌。AD-9經(jīng)多次傳代表明遺傳性能穩(wěn)定,因此選擇AD-9進(jìn)行下一步的生理特性研究。

2.4 高產(chǎn)菌株生理特性

2.4.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵性能

圖8 不同培養(yǎng)基ε-PL產(chǎn)量對(duì)比Fig. 8 Comparison of ε-PL production of S. albulus and AD-9 with different media

菌株經(jīng)過誘變,自身基因發(fā)生改變,造成代謝過程發(fā)生改變,引起目標(biāo)產(chǎn)物的大幅度提升。伴隨著產(chǎn)量的提升,其營(yíng)養(yǎng)需求可能也會(huì)發(fā)生改變。為發(fā)揮高產(chǎn)菌株的最大發(fā)酵潛能,本研究設(shè)置了3 種培養(yǎng)基(M3G發(fā)酵培養(yǎng)基、RSM培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)基)以測(cè)試菌株發(fā)酵性能。從圖8可以看出,出發(fā)菌株與AD-9在3 種培養(yǎng)基中ε-PL 產(chǎn)量呈現(xiàn)相同的趨勢(shì),產(chǎn)量由高到低分別為優(yōu)化培養(yǎng)基、RSM培養(yǎng)基、M3G發(fā)酵培養(yǎng)基,說明優(yōu)化培養(yǎng)基可以更高效地合成ε-PL。AD-9在3 種培養(yǎng)基中的ε-PL產(chǎn)量都高于出發(fā)菌株的ε-PL產(chǎn)量。說明經(jīng)過連續(xù)誘變,AD-9的ε-PL合成能力得到加強(qiáng)。

2.4.2 發(fā)酵過程中菌絲球差異

在發(fā)酵過程中,不同菌絲球形態(tài)會(huì)影響菌株養(yǎng)料和氧氣的獲取,為進(jìn)一步了解高產(chǎn)菌株AD-9發(fā)酵過程中的變化,觀察出發(fā)菌株與AD-9在發(fā)酵不同時(shí)期菌絲球形態(tài)。如圖9、10所示,在第24小時(shí),出發(fā)菌株菌球較少,直徑較大,且菌絲球相互纏繞呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài);AD-9菌球致密,菌絲球直徑較小,大部分菌絲球呈現(xiàn)規(guī)則的橢圓形。發(fā)酵48 h,出發(fā)菌株菌絲球繼續(xù)纏繞,形成不規(guī)則的橢圓和條狀,有裂解的趨勢(shì),AD-9菌絲球直徑稍增大,仍保持致密的狀態(tài)。到第72小時(shí),出發(fā)菌株大部分菌絲球己出現(xiàn)了裂解現(xiàn)象,而AD-9仍保持致密狀態(tài),菌絲球邊緣只出現(xiàn)少部分裂解。Hobbs等[29]通過向培養(yǎng)基中添加2 g/L的聚丙烯酸,發(fā)現(xiàn)Streptomyces coelicolorJ802菌絲球明顯分散,直徑變小,并且生物量和放線菌紫素含量得到大幅提升。王國(guó)良等[30]向培養(yǎng)基中添加0.5 g/L Mg2+,發(fā)酵過程中菌絲球直徑明顯減小,ε-PL比對(duì)照組提高了30.91%。可見菌體發(fā)酵中保持一定的菌絲球形態(tài)更有利于目的產(chǎn)物的分泌與積累。菌株AD-9優(yōu)勢(shì)在于發(fā)酵過程中能保持致密且均勻的菌絲球形態(tài),促進(jìn)ε-PL持續(xù)分泌。

圖9 出發(fā)菌株（a）與AD-9（b）發(fā)酵過程菌體形態(tài)比較（×10）Fig. 9 Comparison of pellet morphology of the original strain (a) and AD-9 (b) on during fermentation (× 10)

圖10 出發(fā)菌株（a）與AD-9（b）菌絲球直徑比較（×20）Fig. 10 Comparison of the diameter of mycelial pellets of the original strain (a) and AD-9 (b) (× 20)

2.4.3 搖瓶自然發(fā)酵過程比較

如圖11所示,兩個(gè)菌株在發(fā)酵過程中pH值變化基本一致,在12～48 h內(nèi)pH值下降較快,從最初的pH 6.8降到pH 3.2左右,此后開始緩慢下降,其中在12～24 h,出發(fā)菌株pH值下降幅度較AD-9大,這一階段出發(fā)菌株菌體干質(zhì)量斜率高于AD-9,說明此階段出發(fā)菌株生長(zhǎng)代謝強(qiáng)于AD-9。發(fā)酵過程中葡萄糖消耗趨勢(shì)基本一致,AD-9的葡萄糖消耗速率高于出發(fā)菌株,說明經(jīng)過誘變,AD-9的生長(zhǎng)代謝得到加強(qiáng)。AD-9發(fā)酵過程中的菌體干質(zhì)量一直高于出發(fā)菌株,第84小時(shí)達(dá)到最大值5.52 g/L,比出發(fā)菌株的菌體干質(zhì)量(4.18 g/L)高了1.3 g/L。對(duì)比ε-PL產(chǎn)量的變化,發(fā)現(xiàn)菌株AD-9 ε-PL的合成速率一直高于出發(fā)菌株,到第84小時(shí),達(dá)到最大值2.1 g/L,而出發(fā)菌株第84小時(shí)的ε-PL產(chǎn)量為1 g/L,是其產(chǎn)量的2.1 倍。通過對(duì)菌體單位細(xì)胞ε-PL產(chǎn)量計(jì)算得到,出發(fā)菌株單位細(xì)胞產(chǎn)量為0.241 6 g/g,AD-9為0.380 4 g/g,突變后菌株單位細(xì)胞產(chǎn)量也得到加強(qiáng)。說明AD-9自身代謝過程發(fā)生改變,合成ε-PL能力增強(qiáng)。

圖11 出發(fā)菌株與AD-9自然搖瓶發(fā)酵過程比較Fig. 11 Comparison of shake flask fermentation characteristics of the original strain and AD-9

3 結(jié) 論

優(yōu)良的菌株對(duì)于ε-PL工業(yè)化生產(chǎn)非常重要,而高效的誘變及篩選方法是獲得高產(chǎn)菌株的前提。傳統(tǒng)誘變?nèi)允悄壳肮I(yè)菌種選育的有效手段,但是傳統(tǒng)誘變耗時(shí)、耗力,缺乏高效篩選方法。本研究基于傳統(tǒng)誘變,將ARTP與DES連續(xù)誘變引入ε-PL高產(chǎn)菌株的選育中,并建立了鏈霉素抗性、亞甲基藍(lán)透明圈法定性檢測(cè)的快速篩選方法,大大提高了篩選效率。最終獲得1 株性狀優(yōu)良的突變菌AD-9,其ε-PL搖瓶產(chǎn)量達(dá)到2.1 g/L,是出發(fā)菌株的2.1 倍。對(duì)比ARTP或DES誘變篩選得到的突變菌株,其產(chǎn)量提升幅度及正突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先,說明連續(xù)誘變對(duì)于產(chǎn)ε-PL菌株的產(chǎn)量提升效果明顯。對(duì)高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行生理特性比較,發(fā)現(xiàn)誘變后突變菌株發(fā)酵過程菌絲球形態(tài)及營(yíng)養(yǎng)需求均發(fā)生了變化,對(duì)比不同培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)ε-PL的影響,發(fā)現(xiàn)AD-9在所選培養(yǎng)基中的ε-PL產(chǎn)量都高于出發(fā)菌株,說明AD-9合成ε-PL的代謝過程得到加強(qiáng),其代謝機(jī)制還需進(jìn)一步研究。