牛源無乳鏈球菌的耐藥率調(diào)查及其耐藥機制研究進(jìn)展

李明，趙艷坤，陳賀，李建洲，邵偉

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)面臨的一大難題。病原微生物是引起奶牛患乳房炎的主要原因，其中無乳鏈球菌（S. agalactiae）又是引起奶牛隱性乳房炎的主要病原。無乳鏈球菌具有高度傳染性，能造成乳腺組織慢性感染，最終導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降甚至無乳[1]，導(dǎo)致高產(chǎn)牛淘汰，還會傳染給犢牛，給奶牛場造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，抗菌藥是治療奶牛乳房炎最常用的藥物。由于濫用抗菌藥，導(dǎo)致很多藥物對乳房炎療效變差，并且這些抗菌藥會對菌株進(jìn)行選擇，有增加細(xì)菌耐藥性趨勢[2]，使得無乳鏈球菌耐藥情況越來復(fù)雜。目前人們對無乳鏈球菌的耐藥性和耐藥機制領(lǐng)域研究較少，主要集中在人源、魚源等無乳鏈球菌的耐藥性上。筆者就近十年國內(nèi)外有關(guān)無乳鏈球菌的耐藥率及其機理的研究概況進(jìn)行綜述，以期找到奶牛乳房炎耐藥現(xiàn)狀及其規(guī)律，為無乳鏈球菌引起奶牛乳房炎的常用藥提供理論參考。

1 無乳鏈球菌的耐藥性研究現(xiàn)狀

1.1 國外無乳鏈球菌的耐藥現(xiàn)狀

在國外，北美和歐洲的一些地區(qū)，通過制定特定控制程序來減少引起傳染性乳房炎的一些因素，無乳鏈球菌引起的乳房炎已經(jīng)變得少見[3,4]。在其他地區(qū)，如南美某些國家，無乳鏈球菌仍然是乳房內(nèi)細(xì)菌感染的一個重要原因。例如在哥倫比亞奶牛群中，有28%～35%的乳房內(nèi)細(xì)菌感染是由無乳鏈球菌引起的[5]；在巴西，Tiago Tomazi等[6]最近的一項研究報告稱，無乳鏈球菌是導(dǎo)致20個奶牛群患臨床型乳房炎的第三大流行細(xì)菌之一。目前國外對人源無乳鏈球菌的研究較多，本數(shù)據(jù)主要由人源和牛源無乳鏈球菌耐藥率組成。從表1中可以看出近10年（2009-2018年）國外12種常用于治療無乳鏈球菌的抗菌藥耐藥情況。表中結(jié)果顯示，通過對不同地區(qū)、不同年份進(jìn)行無乳鏈球菌耐藥性檢測，其中從單地區(qū)來看：對美國、孟買、埃塞俄比亞各地區(qū)的β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類7種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，美國有1種抗菌藥即四環(huán)素（TET）的耐藥率≥50%，孟買有2種抗生素即鏈霉素（STR）和TET的耐藥率≥50%，埃塞俄比亞沒有抗菌藥耐藥。對阿根廷、巴西6種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，阿根廷沒有抗菌藥耐藥，巴西有1種抗菌藥（TET）耐藥，耐藥率≥50%。對波蘭、伊朗、加拿大各地區(qū)的5種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)波蘭、伊朗、加拿大地區(qū)TET的耐藥率均≥50%。

從多個地區(qū)來看：對約旦、巴西（簡稱2a地）和喀麥隆、埃及（簡稱2b地）的8種抗生素耐藥性進(jìn)行檢測，2a地有4種抗生素即青霉素（PEN）、STR、TET和復(fù)方新諾明（SXT）的耐藥率≥50%，耐藥情況很嚴(yán)重；2b地沒有抗生素耐藥。

從時間軸上來看，不同國家的無乳鏈球菌耐藥情況如下（以耐藥率≥50%的次數(shù)表示耐藥的嚴(yán)重性）：PEN類耐藥情況不嚴(yán)重，17次中有1次抗菌藥耐藥率≥50%；頭孢類耐藥情況不嚴(yán)重，3次中有0次抗菌藥耐藥率≥50%；大環(huán)內(nèi)酯（ERY）耐藥情況不嚴(yán)重，9次中有0次抗菌藥耐藥率≥50%；林可胺類耐藥情況不嚴(yán)重，9次中有0次抗菌藥抗生素耐藥率≥50%；氨基糖苷類耐藥情況嚴(yán)重，6次中有2次抗菌藥抗生素耐藥率≥50%；四環(huán)素類耐藥情況很嚴(yán)重，10次中有7次抗菌藥抗生素耐藥率≥50%；喹諾酮類耐藥情況不嚴(yán)重，6次中有0次抗菌藥抗生素耐藥率≥50%；磺胺類耐藥情況不嚴(yán)重，4次中有1次抗菌藥耐藥率≥50%。

由此國外可以選用β-內(nèi)酰胺類、頭孢類、林可胺類、喹諾酮類抗生素治療奶牛乳房炎 。

1.2 國內(nèi)無乳鏈球菌的耐藥現(xiàn)狀

目前國內(nèi)對人源性、魚源性無乳鏈球菌的研究較多，通過14種常用于治療無乳鏈球菌的抗生素耐藥率統(tǒng)計分析可以了解其耐藥的研究現(xiàn)狀。但對于奶牛乳房炎無乳鏈球菌的耐藥性及耐藥基因報道的較少，而我國奶牛乳房炎發(fā)病率又很高，據(jù)報道臨床型乳房炎發(fā)病率為9.7%～55.6%，隱性乳房炎發(fā)病率為61.03%～79.62%[29]，故暫且以人源、魚源無乳鏈球菌耐藥率的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表2顯示了對不同地區(qū)、不同年份進(jìn)行無乳鏈球菌耐藥性檢測的結(jié)果，其中從單地區(qū)來看：對云南10種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，有4種抗菌藥即氨芐青霉素（AMP）、青霉素G（PG）、ERY、CLI（克林霉素）耐藥率≥50%；對新疆、長春8種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，新疆有2種抗菌藥（TET、SXT）耐藥率≥50%，長春有2種抗菌藥即慶大霉素（GM）、卡那霉素（K）耐藥率≥50%。上海、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅地區(qū)對7種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，上海有3種抗菌藥（AMP、GM、TET）耐藥率≥50%；黑龍江有2種抗菌藥（AMP、CLI）耐藥率≥50%；內(nèi)蒙古有2種抗菌藥（ERY、TET）耐藥率≥50%；甘肅有3種抗菌藥（AMP、ERY、CLI）耐藥率≥50%。對北京、江蘇5種抗菌藥進(jìn)行檢測，北京、江蘇均有2種抗菌藥（ERY、CLI）耐藥率≥50%。

表1 2009-2018年國外無乳鏈球菌對臨床適用12種抗菌藥物的耐藥結(jié)果[7～16]

表2 2009-2018年國內(nèi)無乳鏈球菌對臨床使用14種抗菌藥物的耐藥結(jié)果[17～28]

從多個地區(qū)來看：對蘭州、天津、重慶、青島和西安等（簡稱多地a）的13種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，有5種抗菌藥（AMP、PG、STR、CIP、SXT）耐藥率≥50%，耐藥情況比較嚴(yán)重。對甘肅、山西、青海、浙江、江蘇和河北等（簡稱多地b）的7種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，有1種抗菌藥（K）耐藥率≥50%。對上海、黑龍江、內(nèi)蒙古、河北、山東（簡稱多地c）8種抗菌藥耐藥性進(jìn)行檢測，沒有抗菌藥耐藥。

從時間軸上來看，青霉素類耐藥情況嚴(yán)重，19次中8次抗菌藥耐藥率≥50%；頭孢類耐藥情況不嚴(yán)重，15次中有0次抗菌藥耐藥率≥50%；大環(huán)內(nèi)酯類（ERY）耐藥情況不嚴(yán)重，15次中有4次抗菌藥耐藥率≥50%；林可胺類耐藥情況嚴(yán)重，15次中5次抗菌藥耐藥率≥50%；氨基糖苷類耐藥情況不嚴(yán)重，20次中有5次抗菌藥耐藥率≥50%；TET類耐藥情況不嚴(yán)重，15次中有3次抗菌藥耐藥率≥50%；喹諾酮類耐藥情況不嚴(yán)重，16次中1次抗菌藥耐藥率≥50%；磺胺類耐藥情況不嚴(yán)重，9次中2次抗菌藥耐藥率≥50%，由此國內(nèi)可以選用頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥治療無乳鏈球菌。

表1與表2對比可知，就青霉素類而言，國內(nèi)無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的耐藥比國外嚴(yán)重。國內(nèi)PEN耐藥率高，不建議用青霉素類治療乳房炎；國外PEN類耐藥率低，可用PEN治療乳房炎。就頭孢菌素類而言，國內(nèi)無乳鏈球菌對頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類抗菌藥的耐藥嚴(yán)重性高于國外，但可用于治療乳房炎。氨基糖苷類的耐藥嚴(yán)重性國內(nèi)略高于國外，國內(nèi)外都可用于治療乳房炎。TET類的耐藥嚴(yán)重性略低于國外，國內(nèi)可用于治療乳房炎，國外應(yīng)減少四環(huán)素類對無乳鏈球菌的治療。喹諾酮類的耐藥性國內(nèi)與國外幾乎相同，都不嚴(yán)重，可用于治療乳房炎。國內(nèi)磺胺類抗菌藥的耐藥嚴(yán)重性低于國外，國內(nèi)外磺胺類藥物可用于治療乳房炎。

2 無乳鏈球菌對抗菌藥物的耐藥機制研究現(xiàn)狀

無乳鏈球菌隸屬于鏈球菌屬，是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，按照血清學(xué)分類法將無乳鏈球菌歸為B群，因此無乳鏈球菌又稱B群鏈球菌（人醫(yī)又稱其為GBS）[30]。無乳鏈球菌的耐藥機制國內(nèi)外報道較少，其與鏈球菌的耐藥機制相似。

2.1 無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥機制

由表2知，無乳鏈球菌對青霉素類耐藥性強。β-內(nèi)酰胺類抗生素殺菌機理是通過β-內(nèi)酰胺環(huán)與細(xì)胞壁 化合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）絲氨酸活化位點共價結(jié)合，使細(xì)胞壁 肽合成受到阻礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的缺損，菌體因膨脹而裂解[31]。而耐藥機制主要有以下兩種：

（1）產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。鏈球菌質(zhì)?；蛉旧w突變，能夠產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶來降解抗生素，使β-內(nèi)酰胺環(huán)遭到破壞，使β-內(nèi)酰胺類抗生素在到達(dá)靶作用部位之前就失去了活性[32]。

（2）青霉素結(jié)合蛋白（即PBPs）的變異。PBPs的變異使鏈球菌與藥物的親和力降低，從而發(fā)生耐藥，還有PBP的含量發(fā)生變化或缺失也可發(fā)生耐藥。誘導(dǎo)性PBPs的出現(xiàn)，可不依賴β-內(nèi)酰胺酶的存在而對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，稱內(nèi)在或固有耐藥；細(xì)菌可產(chǎn)生緩慢結(jié)合的PBPs，這種由PBP介導(dǎo)的耐藥性在革蘭氏陽性菌中更常見，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐青霉素肺炎球菌[33]。

2.2 無乳鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機制

無乳鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性強，其耐藥機制主要有如下三種：

（1）靶位改變。產(chǎn)生耐藥性的鏈球菌通過合成由ermB、ermF基因編碼的核糖體甲基化酶erm，使與大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物結(jié)合的23S rRNA特定腺嘌呤甲基化，阻止藥物與核糖體的結(jié)合[34]。

（2）主動外排系統(tǒng)作用。產(chǎn)生耐藥性的鏈球菌通過mef基因和MsrD[35]基因介導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，mef和MsrD能夠編碼跨膜區(qū)域的能量依賴的膜外排蛋白，依靠質(zhì)子運動力泵出14,15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥[36,37]。

（3）23S rRNA和核糖體蛋白L4和L22突變。大環(huán)內(nèi)酯類藥物的結(jié)合域主要由23S rRNA的V區(qū)和II區(qū)以及核糖體蛋白L4和L22組成。核糖體蛋白L4和L22最初與23S rRNA的I區(qū)結(jié)合在一起，當(dāng)L4和L22發(fā)生變異時會破壞大環(huán)內(nèi)酯結(jié)合部位而導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥[38]。

2.3 無乳鏈球菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制

無乳鏈球菌對氨基糖苷類耐藥情況嚴(yán)重，氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)相似，均是由2～3個氨基糖分子和非糖部分的苷元通過氧橋連接而成，因此交叉耐藥性現(xiàn)象普遍存在。氨基糖苷抗性相關(guān)的基因有addE和aphA-3，主要編碼6-腺苷酰(基)轉(zhuǎn)移酶( AAD ( 6') ) 和3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH( 3' ) -Ⅲ)，分別可導(dǎo)致STR、K和新霉素耐藥[39]。耐藥的無乳鏈球菌以產(chǎn)生鈍化酶為主，即抗生素分子中的某些保持抗菌活性所必需的基團(羥基或氨基)經(jīng)酶修飾后與其作用靶位核糖體結(jié)合的親和力下降，不能進(jìn)入發(fā)揮抗菌活性階段[40]。

2.4 無乳鏈球菌對四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥機制

無乳鏈球菌對四環(huán)素耐藥情況較嚴(yán)重，以下是鏈球菌對TET類抗菌藥物的耐藥機制：

（1）tetM、tetO、tetS是編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因，使TET無法與細(xì)菌核糖體結(jié)合而失去效能[41]。

（2）tetK、tetL基因與藥物排出泵機制相關(guān)。藥物排出泵是將細(xì)胞內(nèi)的TET由導(dǎo)出泵排出細(xì)胞外，從而使TET無法發(fā)揮作用[42～44]。

（3）產(chǎn)生滅活或鈍化TET酶的基因及其表達(dá)的蛋白。因tetX常與編碼rRNA甲基化酶的ermF基因(介導(dǎo)ERY耐藥)連在一起，這在克隆ermF時發(fā)現(xiàn)了tetX，tetX是唯一編碼鈍化或滅活TET酶的基因，它能編碼約44ku胞質(zhì)蛋白，在有氧呼吸和NADPH時對TET進(jìn)行化學(xué)修飾[45]。

2.5 無乳鏈球菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制

無乳鏈球菌對喹諾酮類耐藥情況不嚴(yán)重，但仍然有耐藥菌。以下是鏈球菌對喹諾酮類藥物耐藥的機制：

（1）靶位突變。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV由2個ParC蛋白與2個ParD蛋白各組成一個四聚體，ParC與ParD由parC與parD基因分別編碼。DNA旋轉(zhuǎn)酶由gyrA和gyrB基因編碼，A,B各2個亞基組成的蛋白四聚體，4個編碼基因中任意一個發(fā)生變異均會引起喹諾酮耐藥性?；騡yrA或parC的單一位點突變可導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類抗菌藥低水平耐藥，但高水平耐藥的表達(dá)需要gyrA和parC雙位點同時突變[46,47]。

（2）鏈球菌主動調(diào)控基因的突變導(dǎo)致主動外排系統(tǒng)的增強。個別報道關(guān)于喹諾酮類藥物基因的突變發(fā)生在質(zhì)粒上如qnr可編碼喹諾酮耐藥[48]。Zeller等[49]在體外篩選的對CIP低水平耐藥的肺炎鏈球菌中首次觀察到喹諾酮的耐藥決定區(qū)沒有發(fā)生突變，證明肺炎鏈球菌存在主動外排系統(tǒng)。

3 小結(jié)與展望

本文主要總結(jié)了2009-2018年國內(nèi)外對人、魚、牛等治療無乳鏈球菌病中常用抗生素對無乳鏈球菌的耐藥率，了解國內(nèi)外無乳鏈球菌耐藥現(xiàn)狀及其變遷情況，并對無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素、喹諾酮類和磺胺類7大抗菌藥耐藥性進(jìn)行了簡明扼要介紹。得知國內(nèi)無乳鏈球菌對青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、磺胺類耐藥性強，存在著濫用現(xiàn)象，導(dǎo)致藥物療效變差，但可以用頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗生素治療乳房炎。國外各地?zé)o乳鏈球菌主要對TET類產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，說明國外農(nóng)場大量使用TET，導(dǎo)致無乳鏈球菌對TET耐藥嚴(yán)重，可以用除此之外的其他抗菌藥治療乳房炎。

從分子水平來看，無乳鏈球菌中存在結(jié)合轉(zhuǎn)座子、噬菌體、質(zhì)粒等在內(nèi)的可移動遺傳因素，使無乳鏈球菌耐藥性越來越復(fù)雜，導(dǎo)致耐藥基因在傳染性病原體間廣泛傳播和流行。因此，應(yīng)重點關(guān)注從分子水平深層探索無乳鏈球菌耐藥機制，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因，找出降低無乳鏈球菌耐藥性的方法，避免抗菌藥物的濫用，為奶牛乳房炎設(shè)計合理的臨床治療方案。