新疆和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因分型研究

薛新梅，齊萌，陶大勇

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300）

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病，是由棘球絳蟲(Echinococcus)的幼蟲棘球蚴(Echinococcus cyst)寄生于人畜體內(nèi)引起的一種嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。目前公認(rèn)的棘球?qū)俳{蟲有4個(gè)種，而我國主要是細(xì)粒棘球絳蟲（E.granulosus）[1]。該病呈世界分布，廣泛流行于亞洲、拉丁美洲、南歐、大洋洲及冰島等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家及地區(qū)，主要以發(fā)展中國家流行強(qiáng)度較高[2,3]。在我國主要以新疆、云南、陜西、青海、甘肅、西藏、寧夏、內(nèi)蒙古和四川西部等地區(qū)流行為主，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。近年來由于分子生物學(xué)在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用，能夠在基因水平上進(jìn)行細(xì)粒棘球蚴病的診斷。應(yīng)用PCR測(cè)定線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（Cytochrome c oxidase subunit 1,COx1）基因的序列可用于鑒定細(xì)粒棘球蚴的基因變異，并可作為細(xì)粒棘球蚴進(jìn)化變異的指示器，因此許多學(xué)者常常把其作為細(xì)粒棘球蚴的基因分型、進(jìn)化關(guān)系分析和重新分類等的重要依據(jù)[6,7]。

和靜縣作為畜牧業(yè)大縣，牲畜存欄104.3萬頭（只），其中羊存欄88.5萬只，已成為新疆現(xiàn)代畜牧業(yè)的重要組成部分，因此肝包蟲的防控顯得日益重要。為了弄清新疆和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴病的感染情況及其流行株基因分型，筆者于2019年9～10月對(duì)來源于新疆和靜縣屠宰場(chǎng)1 115只1歲以上綿羊采取剖檢的方法進(jìn)行了細(xì)粒棘球蚴病的感染情況調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，并對(duì)隨機(jī)分離的10個(gè)包囊病灶利用線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因1（mtCO1）通過PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序的方法進(jìn)行了細(xì)粒棘球蚴流行株的基因分型，以確定和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴的感染情況和主要流行基因型，為該地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 取樣地區(qū)概述

和靜縣隸屬于新疆巴音郭楞蒙古自治州，位于巴音郭楞蒙古自治州西北部，下轄1個(gè)區(qū)公所（巴音布魯克區(qū)公所）、4個(gè)鎮(zhèn)、8個(gè)鄉(xiāng)，其中農(nóng)區(qū)有5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)、牧區(qū)有7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，擁有草場(chǎng)面積達(dá)214.79萬hm2，是全國面積最大的高山天然草原。

1.2 病例來源

來源于2019年9～10月和靜縣屠宰場(chǎng)屠宰綿羊（主要來自和靜縣農(nóng)區(qū)和牧區(qū)）。

1.3 主要儀器及試劑

離心機(jī)和PCR儀，購自Eppendorf中國有限公司；JY系列電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，購自BioRad公司；組織DNA提取試劑盒、Taq plus DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNAMarker及其他生化試劑，購自上海生物工程公司；pMD18-T載體，購自大連TaKara公司；大腸桿菌 (E.coli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞，石河子大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 病原學(xué)檢測(cè)

進(jìn)行剖解檢查：待羊屠宰后，取出肝、肺等臟器，經(jīng)肉眼觀察和觸摸仔細(xì)檢查肝臟和肺臟表面有無棘球蚴包囊，并記錄綿羊的來源地和細(xì)粒棘球蚴的感染數(shù)，然后將帶有棘球蚴包囊的臟器帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.5 病料的采集及DNA的提取

從和靜縣屠宰場(chǎng)收集感染細(xì)粒棘球蚴綿羊的臟器，以一只羊肝臟或肺臟臟器的包囊為一份陽性病料，用5mL注射器共抽取10份感染病料囊液于1.5mL EP管中，8 000r/min離心8min，將上清液置于-20℃保存，將含有原頭細(xì)粒棘球蚴的樣品用TIANamp UenomicDNA Kit提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

以提取的基因組DNA為模板，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的目的基因進(jìn)行測(cè)試[8]，引物由北京六合華大基因生物公司合成。首先擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因1（mtCO1）。mtCO1上游引物：5'- TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3'，mtCO1下游引物：5'-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3'；采用20μL反應(yīng)體系：ddH2O 9μL，2×PCR Mix 8μL，模板2μL，上、下游引物各0.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸35s，38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，并與載體pMD19-T在4℃條件下過夜連接；12h后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在氨芐青霉素平板上進(jìn)行篩選，然后做菌液PCR反應(yīng)，進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組載體產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，以確定在新疆和靜縣流行的細(xì)粒棘球蚴的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊細(xì)粒棘球蚴感染情況

經(jīng)對(duì)2019年9～10月和靜縣屠宰場(chǎng)屠宰的1 115只綿羊細(xì)粒棘球蚴病的感染情況進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)有88只綿羊臟器表面有棘球蚴包囊，感染率為7.89%，其中來自農(nóng)區(qū)的綿羊感染率為3%（10/331），來自牧區(qū)的綿羊感染率為9.9%（78/784），見表1。

表1 綿羊細(xì)粒棘球蚴的感染情況

2.2 細(xì)粒棘球蚴mtCOl基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過mtCO1引物PCR擴(kuò)增后的目的基因產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得特異性的PCR產(chǎn)物，片段長度為446bp（圖1）?？寺∞D(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取單菌落，做菌液PCR篩選驗(yàn)證，成功得到陽性轉(zhuǎn)化子（圖2）。

圖1 細(xì)粒棘球蚴mtCO1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 細(xì)粒棘球蚴mtCO1基因的序列比對(duì)分析

經(jīng)測(cè)序，新疆和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的片段長度為446 bp。對(duì)10個(gè)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株的mtCO1基因序列通過NCBI中的Blast功能比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與登錄號(hào)為KT446001.1、KT968706.1、HF947595.1的同源性為99%～100%，證實(shí)新疆和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因型為G1型。

3 討論

細(xì)粒棘球絳蟲自1905年我國青島首次報(bào)道以來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其感染情況進(jìn)行了大量調(diào)查研究。Kamal等于2011年對(duì)非洲蘇丹地區(qū)待屠宰的4 378只綿羊的細(xì)粒棘球蚴感染情況進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示有26只綿羊感染，感染率為0.6%[9]。宋雪梅于2013年8～11月對(duì)新疆塔城地區(qū)沙灣縣屠宰場(chǎng)屠宰的1 040只綿羊細(xì)粒棘球蚴病感染情況進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示綿羊棘球蚴平均感染率為4.3%[10]。本研究通過對(duì)和靜縣源自農(nóng)區(qū)和牧區(qū)的綿羊進(jìn)行細(xì)粒棘球蚴感染情況調(diào)查統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)來自牧區(qū)的綿羊細(xì)粒棘球蚴病感染率為7.89%，明顯高于農(nóng)區(qū)感染率的3%。分析其原因，可能與綿羊飼養(yǎng)方式有關(guān)。根據(jù)走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牧區(qū)多以放牧的形式進(jìn)行飼養(yǎng)，由于羊群數(shù)量龐大，常伴有牧羊犬看護(hù)，牧羊犬往往造成驅(qū)蟲給藥預(yù)防不及時(shí)，再加上防控意識(shí)缺乏，常有牧民把感染包蟲囊的內(nèi)臟給牧羊犬吞食；最后由于放牧區(qū)域經(jīng)常轉(zhuǎn)場(chǎng)，加大了其傳播風(fēng)險(xiǎn)。而農(nóng)區(qū)多以圈養(yǎng)形式飼養(yǎng)，降低了以上感染風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)這一現(xiàn)狀，建議采取以下措施來控制和靜縣牧區(qū)包蟲病的流行：①加強(qiáng)牧區(qū)包蟲病的預(yù)防工作；②對(duì)包蟲病感染臟器進(jìn)行無害化處理，嚴(yán)格控制其流向牧羊犬；③定期對(duì)牧羊犬進(jìn)行驅(qū)蟲，并對(duì)糞便進(jìn)行深埋處理；④加強(qiáng)和普及綿羊細(xì)粒棘球蚴的疫苗免疫工作，并及時(shí)做好監(jiān)測(cè)；⑤控制牧羊犬的數(shù)量。由于犬作為細(xì)粒棘球絳蟲的終末宿主，糞便中的蟲卵量很大，易污染牧場(chǎng)環(huán)境，因此應(yīng)將和靜縣包蟲病的防控重點(diǎn)放在牧羊犬?dāng)?shù)量的控制上，從而有效控制包蟲病在人畜間的流行[11]。

養(yǎng)羊業(yè)是新疆和靜縣畜牧業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)支柱，由于草場(chǎng)資源豐富，多選擇放牧的形式飼養(yǎng)，使該地區(qū)成為人畜包蟲病的高發(fā)區(qū)。近些年來，國外學(xué)者借助分子生物學(xué)方法以及細(xì)粒棘球蚴絳蟲基因組的特征，把其分為10種（G1-G10），其中G1為最常見的綿羊株[12,13]。Vural等對(duì)土耳其綿羊源細(xì)粒棘球蚴分離株樣品進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)G1型基因廣泛存在于綿羊體內(nèi)，且同時(shí)發(fā)現(xiàn)G3型[14]。張學(xué)勇等對(duì)青海天峻地區(qū)16份綿羊源和2份人源細(xì)粒棘球蚴分離株樣品進(jìn)行COx1基因PCR擴(kuò)增、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)人和綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株的基因型均屬于G1型[15]。本研究對(duì)源自新疆和靜縣農(nóng)區(qū)和牧區(qū)的10份綿羊細(xì)粒棘球蚴分離株樣品進(jìn)行了線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因1（mtCO1）的擴(kuò)增、克隆測(cè)序，通過NCBI中的Blast功能比對(duì)發(fā)現(xiàn)，和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株均為G1型，未發(fā)現(xiàn)其他型，這可能與采樣基數(shù)偏少有關(guān)。確定和靜縣綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株的基因型，為該地區(qū)綿羊包蟲病防控工作和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)依據(jù)以及數(shù)據(jù)支持。