益氣化瘀方聯(lián)合干細(xì)胞移植促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究※

●周瑞娟 盧曉惠 張秋萍 陳海鵬 徐 浩 劉書芬 徐樂勤▲

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，全球范圍每年平均每百萬人口中約有10.4～83人發(fā)生SCI[1]。該疾病可導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙，給患者日常生活帶來極大的痛苦，同時也給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。細(xì)胞移植是目前神經(jīng)再生領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，也是最有希望治愈SCI的方法之一[2]。當(dāng)前可用于移植的細(xì)胞種類有誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPS）、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等[2-3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)Mash-1基因可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞（CE3小鼠胚胎干細(xì)胞）在體外[4]和脊髓損傷部位向神經(jīng)細(xì)胞分化[5]。在實(shí)驗(yàn)中，本課題組也觀察到移植細(xì)胞在脊髓損傷部位的存活數(shù)量較少。文獻(xiàn)報道，移植細(xì)胞的存活數(shù)量多少與脊髓損傷的炎癥環(huán)境密切相關(guān)[6]。

在既往的研究中，本課題組觀察到益氣化瘀方可減輕慢性脊髓損傷的炎癥反應(yīng)[7]；促進(jìn)背根節(jié)細(xì)胞表達(dá)BDNF[8]，抑制caspase-3和bax的表達(dá)[9-10]，進(jìn)而減少背根節(jié)細(xì)胞的凋亡。由此可見，益氣化瘀方具有改善炎癥反應(yīng)，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察益氣化瘀方聯(lián)合移植過表達(dá)Mash-1基因的胚胎干細(xì)胞對脊髓損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物KM種小鼠60只，雄性，無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級，6～8周齡，體重（20±2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 試劑DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶（GIBCO公司，美國）；FBS（BIOCHROM公司，英國）；LIF細(xì)胞因子（CHEMICON公司，美國）；nestin抗體、β-tubulin III抗體（Abcam公司，英國）；熒光二抗（KPL公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶（TAKARA公司，日本）。益氣化瘀湯劑由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供（組成：黃芪15g，黨參12g，丹參9g，川芎9g，人工麝香0.03g。煎煮濃度為1g生藥/mL）。

1.3 細(xì)胞懸液的制備按前期的實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)Mash-1基因修飾的小鼠胚胎干細(xì)胞（CE3-Mash-1細(xì)胞）[5]。細(xì)胞移植注射前，采用0.125%胰酶消化，終止后吹打成單個細(xì)胞懸液，離心，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，通過計數(shù)板計數(shù)確定細(xì)胞總數(shù)，然后用生理鹽水重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/μL備用，移植前將細(xì)胞懸液置于冰上保存。

1.4 小鼠急性脊髓損傷模型建立、分組及治療給藥小鼠購買后適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、益氣化瘀方組（以下簡稱中藥組）、Mash-1修飾胚胎干細(xì)胞移植組（以下簡稱干細(xì)胞組）、益氣化瘀方聯(lián)合Mash-1修飾胚胎干細(xì)胞移植組（以下簡稱聯(lián)合組）。假手術(shù)組只暴露脊髓不予Dumont 5號鑷夾持損傷脊髓。其余各組按Plemel JR報道[11]的方法建立急性脊髓損傷模型，具體步驟如下：采用氯胺酮腹腔注射麻醉小鼠（給藥劑量0.05mL/10g體重），麻醉后將小鼠固定于俯臥位，逐層暴露T13節(jié)段脊髓，隨后采用Dumont 5號鑷從前后方向夾持脊髓15s，無菌紗布輕輕壓迫止血，逐層縫合。術(shù)后第1天，采用小鼠后肢運(yùn)動功能（Basso mouse scale，BMS）評分[8]驗(yàn)證模型是否成功。所有動物術(shù)后連續(xù)3天給予腹腔注射50,000U/kg的青霉素；擠壓膀胱輔助排尿至自身排尿反射恢復(fù)。

術(shù)后第3天，根據(jù)小鼠體重，采用氯胺酮麻醉小鼠，固定于俯臥位，碘伏常規(guī)消毒，拆除背部的縫線，直接暴露損傷的脊髓節(jié)段。暴露完成后，干細(xì)胞組及聯(lián)合組用10μL的微量進(jìn)樣器抽取之前準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，移植的細(xì)胞數(shù)目為1×105個，即2μL的細(xì)胞懸液，注射到脊髓損傷部位中心，垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度為1.5mm，以緩慢的速度注射，注射后留針2min；假手術(shù)組、模型組、中藥組給予注射2μL生理鹽水。

待小鼠蘇醒后，中藥組、聯(lián)合組給予益氣化瘀湯劑（0.1mL/10g體重）灌胃；假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞組給予等體積生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)給藥4周。各組小鼠分別于建模后的1、7、14、21、28天進(jìn)行BMS評分。

1.5 脊髓標(biāo)本的取材與固定分別于脊髓損傷建模后的14和28天，采用10%水合氯醛麻醉，每組處死6只小鼠。其中，3只小鼠的脊髓標(biāo)本放置于4%多聚甲醛中固定，另3只小鼠脊髓標(biāo)本放置于液氮中保存，擇期抽提總RNA。小鼠脊髓標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定16h后倒去固定液，清水沖洗2h后，將標(biāo)本放置于15%和25%蔗糖溶液中各脫水24h，最后去除蔗糖溶液，經(jīng)OCT膠包埋，冰凍切片機(jī)將小鼠脊髓切成5μm厚度組織切片，用防脫載玻片粘取組織。切片完成后放置于室溫通風(fēng)1天，晾干切片，裝入切片盒中，放置-20℃冰箱保存。

1.6 HE染色從-20℃冰箱取出切片，室溫放置10min；將切片放置于清水中5min；蘇木素2min；清水沖洗；0.04%的鹽酸酒精分化5s；清水沖洗；2%氨水返藍(lán)10min；清水沖洗；伊紅2min；清水沖洗；85%、95%、100%梯度乙醇各2min；二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III各2min；中性樹膠封片；60℃烤箱烘烤過夜；Olympus相差顯微鏡采片。

1.7 免疫熒光染色從-20℃冰箱中取出切片，放置于PBS中浸泡5min，取出切片放置于濕盒中，用紙巾擦除組織周圍的水分，蛋白酶K消化10min（修復(fù)抗原），PBS洗2min×3次，0.5%PBST通透20min，PBS洗2min×3次，加入5%BSA封閉20min，加一抗OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP（1：500稀釋），4℃過夜。37℃恒溫箱孵育1h，PBS洗5min×3次，紅色熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×3次，加入1μg/mL的DAPI室溫避光孵育10min，PBS洗2min×3次，熒光顯微鏡下采片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.8 RNA抽提及real-time PCR從液氮中取出脊髓組織，用分析天平秤取100mg脊髓組織，用去酶的眼科剪將脊髓組織剪碎，加入1mL TRIZOL，常規(guī)抽提總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度后，采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測BDNF、CNTF、NGF、NT3、IL-1、IL-6、TNF-α、MIP2、caspase-3、bax、bcl-2及β-actin的基因表達(dá)情況。

根據(jù)GenBank檢索目的基因序列設(shè)計引物，采用primer 5軟件設(shè)計擴(kuò)增引物序列，由華大基因公司合成引物序列。各基因名稱和序列見表1。PCR結(jié)果采用ΔCt法進(jìn)行分析（Ct為循環(huán)閾值）和2-ΔΔCt表示各組間各基因的表達(dá)差異。

表1 神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子和凋亡相關(guān)基因名稱和引物序列

1.9 統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)均以表示。先對各組數(shù)值變量進(jìn)行正態(tài)性分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步檢驗(yàn)方差齊性。方差齊時兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析LSD-t法檢驗(yàn)。方差不齊時，組間數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 功能評分術(shù)后第1天，假手術(shù)組的小鼠后肢的運(yùn)動功能均為正常，評分值為9分；造模后各造模組的小鼠后肢出現(xiàn)明顯運(yùn)動功能障礙，評分均為0。術(shù)后第7天，即細(xì)胞注射和給藥后第4天，干細(xì)胞組和聯(lián)合組的小鼠后肢運(yùn)動功能有部分恢復(fù)，與模型組和中藥組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在造模后的第14、21和28天，干細(xì)胞組和聯(lián)合組的小鼠后肢運(yùn)動功能進(jìn)一步恢復(fù)，與模型組和中藥組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。在造模后第21和28天時，聯(lián)合組小鼠后肢運(yùn)動功能明顯優(yōu)于單純細(xì)胞移植的干細(xì)胞組，比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組小鼠的后肢運(yùn)動功能評分略高于模型組，但無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 術(shù)后第28天各組小鼠的后肢運(yùn)動功能照片

表2 BMS評分（分，）

表2 BMS評分（分，）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中藥組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與干細(xì)胞組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01

2.2 脊髓橫切面HE染色從脊髓橫切面HE染色可見，在造模后的14天和28天時，模型組和中藥組小鼠的脊髓橫切面剩余面積明顯減少，與假手術(shù)組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。干細(xì)胞組和聯(lián)合組的小鼠脊髓剩余面積均有明顯的恢復(fù)，與模型組和中藥組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。假手術(shù)組、干細(xì)胞組和聯(lián)合組三組間的脊髓剩余面積無明顯差異（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 造模后14d和28d時各組脊髓橫切面HE染色圖

表3 脊髓橫切面剩余面積（μm2，）

表3 脊髓橫切面剩余面積（μm2，）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01

2.3 免疫熒光結(jié)果由于CE3胚胎干細(xì)胞帶有GFP，因此可在熒光顯微鏡下通過綠色熒光跟蹤移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活數(shù)量和所在位置，進(jìn)一步通過帶紅色熒光的二抗與不同的一抗結(jié)合可觀察到移植的細(xì)胞在體內(nèi)的存活和分化情況。免疫熒光染色結(jié)果顯示，干細(xì)胞組與聯(lián)合組的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四種細(xì)胞標(biāo)記蛋白的陽性細(xì)胞比例無明顯差別，見圖3和表4。但在造模后的第28天，聯(lián)合組的細(xì)胞存活數(shù)目明顯多于干細(xì)胞組。見圖4、表5。

圖3 術(shù)后第14d和28d，脊髓組織免疫熒光染色圖

表4 移植細(xì)胞在損傷脊髓部位的分化情況（%，）

表4 移植細(xì)胞在損傷脊髓部位的分化情況（%，）

注：兩各細(xì)胞移植組的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四種細(xì)胞標(biāo)記蛋白的陽性細(xì)胞比例無明顯差別（P＞0.05）

圖4 造模28d后干細(xì)胞組和聯(lián)合組的移植細(xì)胞在脊髓損傷部位的存活情況圖

表5 造模14和28d后兩組移植細(xì)胞的存活數(shù)量（個，）

表5 造模14和28d后兩組移植細(xì)胞的存活數(shù)量（個，）

注：與干細(xì)胞組比較，##P＜0.01

2.4 基因表達(dá)改變情況本實(shí)驗(yàn)主要檢測各組小鼠損傷脊髓的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、NT-3)、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2)和凋亡相關(guān)基因(caspase-3、bax、bcl-2)的表達(dá)情況。在造模14天時，模型組的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)明顯增高；中藥組的炎癥因子IL-1、TNF-α 和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)相對模型組減少，同時神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá)略微升高；干細(xì)胞組和聯(lián)合組小鼠的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)明顯降低，同時神經(jīng)營養(yǎng)因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表達(dá)均有升高。此時，干細(xì)胞組和聯(lián)合組在以上幾種基因的表達(dá)無明顯差別（見圖5 A）。在脊髓損傷28天時，模型組小鼠脊髓的炎癥因子TNF-α和神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3的表達(dá)相對假手術(shù)組均有升高；中藥組的炎癥因子TNF-α表達(dá)相對模型組降低，同時略微增加神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá)；干細(xì)胞組小鼠的炎癥因子TNF-α和神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NT-3的表達(dá)均升高；而聯(lián)合組的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NT-3的表達(dá)上升，且相對模型組和干細(xì)胞組其炎癥因子TNF-α表達(dá)明顯下降（見圖5 B）。

3 討論

益氣化瘀方能輕微改善小鼠脊髓損傷后的神經(jīng)功能，可能通過減少炎癥因子IL-1、TNF-α 和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3的表達(dá)，進(jìn)而減輕脊髓的繼發(fā)性損傷。文獻(xiàn)報道，益氣化瘀方可以減輕慢性脊髓損傷和椎間盤退變引起的炎癥反應(yīng)[7,12]。在之前的實(shí)驗(yàn)中，益氣化瘀方可減少的背根節(jié)神經(jīng)細(xì)胞[9]和椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞[13-14]、軟骨細(xì)胞[15]表達(dá)caspase-3和bax基因。本研究表明，益氣化瘀方聯(lián)合干細(xì)胞移植能顯著保留脊髓的橫切面剩余面積，減少炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，同時增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表達(dá)，增加移植細(xì)胞在損傷脊髓部位的存活，進(jìn)而提高小鼠后肢運(yùn)動功能。

圖5 造模后14 d和28d各組神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況圖

益氣化瘀方由黃芪、黨參、川芎、丹參、人工麝香組成。方中重用黃芪，其味甘，性微溫，入脾、肺，具有補(bǔ)中益氣、利水消腫之功，可大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，使氣旺血行、瘀去絡(luò)通而為君。黨參補(bǔ)中益氣，健脾益肺為臣，與黃芪合用以增強(qiáng)健脾益氣之功。川芎辛、溫，行氣開郁、活血止痛，善行血中之氣；丹參活血化瘀、行氣止痛，配合川芎則有行氣活血、祛瘀生新之效，共為佐藥。使以麝香辛香走竄,活血通絡(luò)、散瘀止痛，以助黃芪、丹參行氣化瘀之功。全方共奏益氣化瘀通絡(luò)之效。

脊髓損傷后炎癥因子的表達(dá)明顯上升，實(shí)驗(yàn)研究表明通過減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)具有一定的治療作用。中藥黃芪、丹參和川芎均具有提高SOD活性，減少繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[16-18]。而且，中藥有效組分麝香提取物、丹參酮IIA和黃芪總苷對神經(jīng)損傷后的多條信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而起到提高神經(jīng)元存活、促進(jìn)軸突再生、抑制細(xì)胞凋亡和抗炎等作用[19-22]。神經(jīng)營養(yǎng)因子主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，具有營養(yǎng)神經(jīng)元、促進(jìn)軸突生長等作用。文獻(xiàn)報道，中藥復(fù)方（痙證方[23]、補(bǔ)陽還五湯[24]、活血通督湯[[25]、通竅活血湯[26]、桃紅四物湯[27]）、單味中藥（黃芪[28-29]、丹參[16]）和中藥有效組分（川芎嗪[30]、麝香酮[31]）具有促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF、CNTF和NT-3的基因表達(dá)。脊髓損傷后的凋亡相關(guān)基因高表達(dá)，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致脊髓神經(jīng)功能障礙的主要原因之一。活血通督湯[32]、補(bǔ)陽還五湯[33]、活血醒腦方[34]、血府逐瘀湯[35]等活血化瘀復(fù)方均具有減少神經(jīng)凋亡的作用。黃芪配伍丹參或配伍川芎可減少大鼠出血或缺血模型的腦細(xì)胞凋亡[36-37]。在中藥單體方面，丹酚酸B[38]和川芎嗪[39-40]能調(diào)節(jié)自噬、氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少脊髓損傷后caspase-3的表達(dá)，保護(hù)線粒體，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。現(xiàn)代藥理還表明黃芪、丹參、黨參和川芎可以保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血流狀態(tài)、改善局部微循環(huán)、清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過氧化損害，并具有一定的調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛的作用[18,41-44]。脊髓損傷后，上述中藥一方面可以通過減輕炎癥反應(yīng)、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫等保護(hù)正常的神經(jīng)元和髓鞘，另一方面可以通過改善損傷微環(huán)境、增加血供，為存活的神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，為移植細(xì)胞提供有利的微環(huán)境，增加移植細(xì)胞的存活，從而促進(jìn)軸突和髓鞘的再生，最終達(dá)到促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能修復(fù)的作用。