CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)用于腫瘤細(xì)胞模型的研究進(jìn)展*

陳燕，劉芷兮 綜述，肖洪濤 審校

610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床藥學(xué)部(陳燕、劉芷兮、肖洪濤);610072成都，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(肖洪濤)

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列與長度相似的間隔序列排列組成。相關(guān)核酸酶9(Cas9)基因編碼的蛋白質(zhì)不僅具有與核酸結(jié)合的功能，還具有與核酸酶、聚合酶、解旋酶等酶結(jié)合的活性。基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理，研究人員通過體外人工合成引導(dǎo)RNA(guide RNA，gRNA)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因片段的精確靶向與剪切，由此開創(chuàng)了一種由gRNA的指導(dǎo)、Cas9定位于特定的基因序列上對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割的新型基因編輯技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)與傳統(tǒng)的鋅指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活樣因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nudeases,TALEN)基因編輯技術(shù)相比，具有編輯效率更高、操作步驟更簡單、價(jià)格更適宜以及編輯范圍更為廣泛等優(yōu)勢。

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)由多基因參與的、不同信號(hào)通路相互調(diào)控與作用的復(fù)雜過程。同一基因在不同腫瘤、不同階段、不同患者中時(shí)常發(fā)揮著截然不同的生物信息學(xué)作用。過去腫瘤的基因組學(xué)研究多局限于全基因組關(guān)聯(lián)分析等觀察層面上，近年來隨著CRIPSR-Cas9基因編輯技術(shù)的深入研究，使得腫瘤治療從基因治療層面上取得了較多的應(yīng)用成果。本文就CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在構(gòu)建腫瘤細(xì)胞模型研究與應(yīng)用中的新進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為腫瘤臨床前研究提供新的思路和策略。

1 CRISPR-Cas 9基因編輯技術(shù)

1.1 技術(shù)簡介

CRISPR-Cas系統(tǒng)在自然界中分為 3 種類型[1]，在基因編輯技術(shù)中最常使用的是Ⅱ型 CRISPR-Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含 3 個(gè)核心元件，CRISPR RNA(cr RNA)、Cas9 蛋白、反式激活RNA(trans-activating RNA，tracr RNA)。cr RNA和tracr RNA 部分互補(bǔ)配對(duì)形成一股雙鏈RNA，再由發(fā)揮引導(dǎo)作用的 Cas9 靶向切割目標(biāo)DNA，因此該雙鏈RNA通常又稱為導(dǎo)向RNA(gRNA)[1]。Jinek等[2]將CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的雙鏈gRNA創(chuàng)造性的改造為單鏈gRNA (single guide， sgRNA)，極大方便了該技術(shù)的應(yīng)用與拓展，使得該項(xiàng)技術(shù)具有同時(shí)編輯多個(gè)靶點(diǎn)基因的功能。其具體作用原理介紹如下[3]：sgRNA可與靶向序列互補(bǔ)配對(duì)形成雜交雙鏈，Cas9 識(shí)別同時(shí)切割靶點(diǎn)的 DNA 雙鏈，形成特異性 DNA 雙鏈斷裂。發(fā)生斷裂的DNA 雙鏈主要有2種修復(fù)方式[4]：一種是非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)，修復(fù)不需要同源模板鏈，利用NHEJ修復(fù)中堿基的插入或刪除可實(shí)現(xiàn)基因突變和基因敲除；另一種是同源直接修復(fù)，該種修復(fù)需同源模板鏈，可通過基因編輯提供外源性模板以實(shí)現(xiàn)基因突變、基因標(biāo)記以及目的基因插入等。CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別靶位點(diǎn)的關(guān)鍵在于sgRNA中與 DNA 互補(bǔ)配對(duì)的約 20 個(gè)堿基的引導(dǎo)序列。因此針對(duì)不同靶向位點(diǎn)，僅需設(shè)計(jì)相應(yīng)的引導(dǎo)序列。與ZFN和TALEN等傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比[5]，該技術(shù)具有操作簡單、快速且成本低的優(yōu)點(diǎn)。不僅如此，通過同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA，可靶向編輯全基因組序列多個(gè)位點(diǎn)，極大的提高了基因編輯效率。目前CRISPR-Cas9技術(shù)用于腫瘤細(xì)胞模型及動(dòng)物模型構(gòu)建，多采用sgRNA手段。

1.2 CRISPR-Cas 基因編輯過程

CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)于外源 DNA的作用機(jī)制分為三個(gè)過程[6](圖1)：1)組織編碼，即組織編碼Cas蛋白的基因和CRISPR序列，包括重復(fù)序列和間隔序列;2)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，即將新的間隔序列插入CRISPR序列中，并由crRNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，Cas9蛋白與加工成熟的crRNA進(jìn)行組裝并表達(dá);3)靶向剪切，通過Cas9破壞和裂解目標(biāo)DNA或RNA。具體而言，當(dāng)外源 DNA入侵宿主細(xì)胞，Cas 蛋白識(shí)別并將外源 DNA 整合于宿主的CRISPR 序列中，生成新的間隔序列，由此形成對(duì)外源DNA的第一次“記憶”(圖1A)。當(dāng)該外源 DNA 再次入侵時(shí)，該外源 DNA 片段的CRISPR 基因轉(zhuǎn)錄成前crRNA (pre-crRNA)，pre-crRNA 經(jīng)轉(zhuǎn)錄RNA、Cas 蛋白及RNA合成酶Ⅲ的加工、剪切，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓亩替?crRNA(圖1B)。該成熟的crRNA 與 tracr RNA 結(jié)合形成新的雙鏈 RNA，即gRNA。gRNA引導(dǎo)復(fù)合體識(shí)別外源 DNA 中的前間隔序列臨近基序(protospacer adjacent motif，PAM)。PAM通常由NGG三個(gè)堿基構(gòu)成(N為任意堿基)，并由Cas9 在 PAM 上游3個(gè)堿基處進(jìn)行靶向切割，造成DNA或RNA的雙鏈斷裂(圖1C)。由此，將設(shè)計(jì)合成的序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式，插入到原有的DNA或RNA中，形成新的DNR或RNA。已有研究表明，tracrRNA 和crRNA 已被簡化成一段大小約 100 個(gè)核苷酸的sgRNA。該sgRNA包含位于5'端 20個(gè)核苷酸的 DNA 互補(bǔ)區(qū)、crRNA以及位于3'端的70～80 個(gè)核苷酸的tracrRNA，且該sgRNA保留了DNA切割序列的特異性。

圖1 CRISPR-Cas9 作用機(jī)制圖Figure 1. Mechanism of CRISPR-Cas9

2 CRISPR-Cas9 技術(shù)在基因編輯腫瘤細(xì)胞模型上的應(yīng)用

CRISPR-Cas9 技術(shù)在編輯腫瘤細(xì)胞模型上，根據(jù)不同研究目的，對(duì)腫瘤細(xì)胞所采取的編輯策略有所不同，目前腫瘤細(xì)胞編輯主要有以下3種方式[6]：基因敲除、誘導(dǎo)突變和基因插入。通過編輯，可以建立新的腫瘤細(xì)胞模型、檢驗(yàn)體外治療效果、探討藥物作用機(jī)制、闡明發(fā)病機(jī)制。本文將按照2018年度全球腫瘤數(shù)據(jù)中臨床腫瘤疾病危害程度及CRISPR技術(shù)應(yīng)用于相應(yīng)腫瘤疾病的報(bào)道依次舉例闡明[7]。

2.1 基因編輯肺癌細(xì)胞模型

肺癌是我國常見的、發(fā)病率和致死率均居首位的惡性腫瘤[7]。miR-362是為于人基因組 Xp11.23位點(diǎn)且在乳腺癌、胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤發(fā)揮著重要的促癌因子[8]。羅丹等[9]為探討miR-362在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，以 pre-miR-362 作為模板設(shè)計(jì)建立CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，DNA 測序結(jié)果表明CRISPR-Cas9 系統(tǒng)作用后，在pre-miR-362 第 53 位和第 54 位核苷酸間插入了長為161bp 的堿基。插入的堿基對(duì)可能對(duì) pre-miRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響miR-362 成熟的生物加工過程，最終結(jié)果導(dǎo)致 miR-362 表達(dá)的顯著下調(diào)。研究以脂質(zhì)體為質(zhì)粒遞送載體，將含目標(biāo)基因的PX330-MIR362-sgRNA7 質(zhì)粒和 DONOR-362 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至95-D 細(xì)胞，通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)初步證明miR-362基因可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲。該研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)驗(yàn)證miR-362基因在肺癌細(xì)胞模型上的作用機(jī)制，為肺癌的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

2.2 基因編輯乳腺癌細(xì)胞模型

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤。BECN1基因被報(bào)道是乳腺癌治療中單倍體不足模型的癌基因[10-11]。Wu等[12]選擇BECN1 TSS下游的3個(gè)G(N19)NGG序列(B432, GTCCAACAACAGCACCATGCAGG；B497, GGACACGAGTTTCAA GATCCTGG；B525, GTCACCATCCAGGAACTCACAG G)作為潛在靶位點(diǎn)，以CRISPR-Cas9同源重組途徑將BECN1基因外顯子2在三陰性乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)進(jìn)行敲除。同時(shí)構(gòu)建B432、B497和B525 sgRNA慢病毒質(zhì)粒，分別以引物對(duì)為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以CRISPR-Cas9從人源上皮乳腺癌細(xì)胞株BT-474、人源胚胎腎細(xì)胞239T和293A 3株細(xì)胞株篩選出BECN1基因敲除穩(wěn)定表達(dá)型細(xì)胞株。通過體外細(xì)胞藥效學(xué)考察敲除BECN1基因的MDA-MB-231細(xì)胞在體外細(xì)胞增殖、菌落形成能力上與野生型細(xì)胞相比顯著降低(P<0.05)，且其作用機(jī)理為通過部分影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)通路，從而降低MDA-MB-231細(xì)胞增殖與侵襲功能。在BECN1基因敲除BT-474、239T、293A穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，敲除細(xì)胞株在G0/ G1期積累較多，而在細(xì)胞周期S期和G2/M期細(xì)胞比例降低。研究者Wu的結(jié)果與Li報(bào)道[13]的在宮頸癌Hela細(xì)胞株上敲除BECN1的結(jié)果相反;Li等研究結(jié)果表明BECN1敲除后，大部分Hela細(xì)胞積累在細(xì)胞周期G1/S期。因BECN1是染色體的聚集和外著絲點(diǎn)的聚集是必不可少的關(guān)鍵因素，其缺失通常將導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常和基因組不穩(wěn)定。因此，在不同細(xì)胞株上進(jìn)行BECN1基因的敲除，將對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生不同的影響。以上研究提示，CRISPR-Cas9 技術(shù)靶向敲除高危性乳腺癌相關(guān)癌基因，可為乳腺癌發(fā)病機(jī)理及治療方案提供技術(shù)支持。

2.3 基因編輯肝癌細(xì)胞模型

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界范圍內(nèi)第三大癌癥相關(guān)死亡原因[13]。由于大多數(shù)HCC被診斷出來已是晚期，因此包括手術(shù)在內(nèi)的傳統(tǒng)治療策略在控制或延長HCC生存期方面通常無效[14]。目前，基因治療和免疫治療[15]成為HCC治療的前沿并取得了一定的進(jìn)展。Liu等[16]利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞上進(jìn)行低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)外顯子1的敲除，結(jié)果顯示，HIF-1α基因敲除的SMMC-7721細(xì)胞其侵襲性和遷移性顯著降低，且以CoCl2模擬缺氧條件下可增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率。以上發(fā)現(xiàn)證實(shí)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的HIF-1α基因敲除可能是一種有效的治療肝癌的手段。

2.4 基因編輯宮頸癌細(xì)胞模型

最新研究表明，全球每年報(bào)告的新發(fā)宮頸癌病例超過5 000萬例，且宮頸癌的發(fā)病率有年輕化趨勢[17]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌高危致病因素， HPV16型HPV能將其自身的DNA傳遞到宿主細(xì)胞染色體中，這使得該型HPV病毒在宮頸癌患者中更難以清除[18]。在HPV基因中，E6和E7基因可以整合到宿主細(xì)胞染色體中，因此具有非常重要的研究意義[19]。Cheng等[20]通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)定位HPV16 型E6基因中T1位點(diǎn)，在其啟動(dòng)子上設(shè)計(jì)替換以實(shí)現(xiàn)敲除E6基因，以考察E6基因在宮頸癌SiHa細(xì)胞中的作用。同時(shí)構(gòu)建HPV16型假病毒質(zhì)粒、Cas9質(zhì)粒、E6-gRNA質(zhì)粒并將其分別轉(zhuǎn)入293TF細(xì)胞，確定表達(dá)后，將HPV16-E6gRNA-RFP(含紅色熒光的攜帶HPV16假病毒-E6gRNA質(zhì)粒)、Cas9-EGFP(含綠色熒光的-Cas9質(zhì)粒)及p16sheLL(HPV16 L1/L2結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)質(zhì)粒)以慢病毒為載體分別轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞，結(jié)果顯示，HPV16-E6gRNA-RFP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示HPV16假病毒確實(shí)具有遞送CRISPR-Cas9質(zhì)粒以及CRISPR-Cas9系統(tǒng)可準(zhǔn)確定位敲除E6基因的作用。該研究后期，將野生型SiHa細(xì)胞接種于裸鼠皮下，并以HPV16假病毒為載體將Cas9+E6-gRNA質(zhì)粒、Cas9質(zhì)粒、E6-gRNA質(zhì)粒注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明以HPV偽型病毒介導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在抑制人乳頭狀瘤病毒E6基因和治療子宮頸癌的具有顯著作用。

2.5 基因編輯胰腺癌細(xì)胞模型

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas，PDAC)是一種惡性程度較高的腫瘤[21]，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，到2030年它將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[22]。基因突變和黏液型O-糖基化(O-glycosylation)模式的異常變化是PDAC診斷與治療的重要指征之一，而糖蛋白N-乙酰半乳糖胺3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1 (glycoprotein-N-acetylgalactosamine 3-beta-galactosyltransferase 1, C1GALT1)抑癌基因失活將導(dǎo)致O-glycosylation的過表達(dá)[23]。因此為考察O-glycosylation與PDAC的發(fā)展和進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制，Chugh等[24]通過CRISPR-Cas9靶向C1GALT1抑癌基因啟動(dòng)子，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行敲除，以構(gòu)建C1GALT1敲除型胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞株(T3M4 和CD18/HPAF)。通過體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，C1GALT1敲除將導(dǎo)致PDAC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)量增加。由此，以CRISPR-Cas9構(gòu)建癌基因敲除型PDAC細(xì)胞，并結(jié)合基因編輯小鼠融合試驗(yàn)可為PDAC的治療提供一個(gè)全新的治療思路。

2.6 基因編輯甲狀腺癌細(xì)胞模型

甲狀腺再分化癌(anaplastic carcinoma of the thyroid，ATC)，又稱未分化甲狀腺癌，是所有甲狀腺腫瘤中最不常見但最具侵襲性和致死性的甲狀腺惡性腫瘤[25]。研究表明，對(duì)放射性碘有耐藥性的ATC患者目前沒有有效的治療方案[26]。Huang等[27]從腫瘤細(xì)胞庫[Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE-https://cancergenome.nih.gov/)]中篩選出1 036例腫瘤患者，并從癌癥基因組圖譜[Cancer Genome Atlas (TCGA-https://cancergenome.nih.gov/)]中收集8 215個(gè)腫瘤基因，經(jīng)篩選比較發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在甲狀腺癌中的表達(dá)量明顯高于其他類型的癌癥。課題組利用CRISPR-Cas9靶向EGFR外顯子9，將攜帶有編碼EGFR的 sgRNA慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)甲狀腺癌SW579細(xì)胞株中。通過基因插入的方式，編輯成具有高表達(dá)EGFR能力的SW579細(xì)胞株。以美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于靶向EGFR的阿法替尼作為陽性藥物，考察其對(duì)EGFR陽性的SW579細(xì)胞生長情況的影響，結(jié)果表明EGFR陽性的SW579對(duì)阿法替尼的治療更加靈敏。且該研究證實(shí)使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯的EGFR sgRNA無脫靶效應(yīng)。該研究以CRISPR-Cas9基因組編輯術(shù)，將EGFR基因插入ATC細(xì)胞株，提高靶向EGFR小分子靶向藥物治療敏感性，并闡釋藥物作用機(jī)制。

2.7 基因編輯髓系腫瘤細(xì)胞模型

髓系惡性腫瘤包括骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)、骨髓纖維化和慢性髓單胞白血病[28]。ASXL1癌基因參與細(xì)胞的表觀遺傳和調(diào)控[29]，且該基因的突變?cè)贛DS、AML、骨髓纖維化和慢性髓單胞白血病中較為常見[30]。鑒于此，Wu等[31]利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，靶向癌基因ASXL1外顯子5-10，構(gòu)建ASXL1基因突變型U937細(xì)胞系。通過與野生型U937細(xì)胞相比，ASXL1突變型細(xì)胞在細(xì)胞生長和細(xì)胞周期中并無明顯差異，但在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分化中表現(xiàn)出明顯缺陷，其分化缺陷機(jī)制與細(xì)胞色素b-245β鏈和c型凝集素域家族5成員A的改變有關(guān)。以上研究提示以CRISPR-Cas9構(gòu)建的突變型白血病細(xì)胞，可為闡明誘導(dǎo)白血病發(fā)生的潛在分子機(jī)制研究提供一定的支持。

2.8 基因編輯惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)細(xì)胞模型

MPM是一種起源于胸膜間皮細(xì)胞的侵襲性腫瘤，其發(fā)生于與石棉接觸有關(guān)[32]。由于缺乏早期診斷方法和藥物治療，目前臨床上罹患MPM的患者急需找到一種有效的治療手段[33]。NF2是一種抑癌基因，其在MPM中被證實(shí)突變發(fā)生率較高[34]。Wahiduzzaman課題組[35]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建了敲除NF2外顯子8的人內(nèi)皮細(xì)胞MeT-5A細(xì)胞模型。在NF2敲除細(xì)胞系中，細(xì)胞生長、克隆、遷移活性與野生型(NF2-WT)細(xì)胞株相比，其侵襲活性明顯降低。且在NF2-敲除細(xì)胞系中成纖維細(xì)胞生長上調(diào)因子受體2 (fibroblast growth factor receptor2,FGFR2)隨JNK、c-Jun和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中磷酸化水平增加而增加；而以上水平的增加可隨外源性增加NF2表達(dá)而降低。由此提示NF2基因缺失可能通過介導(dǎo)FGFR2表達(dá)缺失，從而在人胸膜內(nèi)皮中腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。以上研究表明，通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)靶向FGFR2的sgRNA可作為治療NF2抑癌基因缺失型MPM的一個(gè)候選治療方案。

2.9 基因編輯骨肉瘤細(xì)胞模型

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其在青春期的發(fā)病率較高[36]。骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)切除原發(fā)性病灶及肺損害聯(lián)合多藥化療方案，其中多藥化療耐藥率較高[37]。分化簇44(cluster of differentiation 44，CD44)癌基因是透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)的受體，通過與HA結(jié)合參與骨肉瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移[38]。Zheng等[39]通過收集56例骨肉瘤患者的96份骨肉瘤組織，對(duì)其進(jìn)行CD44表達(dá)的檢測，以評(píng)價(jià)骨肉瘤組織的CD44平均表達(dá)水平。以CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性敲除骨肉瘤耐藥細(xì)胞系(KHOSR2和U-2OSR2)中的CD44外顯子1。通過與非敲除型耐藥株相比，敲除CD44基因后，耐藥株的遷移和侵襲活性受到了顯著抑制，且敲除該基因可提高化療藥物治療敏感性。該發(fā)現(xiàn)證實(shí)CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除CD44基因的策略，可為改善骨肉瘤耐藥提供一種新的治療策略。

利用CRISPR-Cas9技術(shù)在前列腺癌[40]、鼻咽癌[41]、結(jié)直腸癌[42]、腎癌[43]等腫瘤中構(gòu)建基因編輯細(xì)胞均有所報(bào)道。本文將CRISPR-Cas9在不同腫瘤細(xì)胞模型中的研究歸納見表1。

表1 CRISPR-Cas9在不同腫瘤細(xì)胞模型中的研究與應(yīng)用Table 1. Research and Application of CRISPR-Cas9 in Different Tumor Cell Models

TumorcellmodelApplicationandresearchofCRISPRintumorcellsLivercancercellmodelCRISPR-Cas9technologyknocksoutexon1ofhypoxiainduciblefactor-1αonhumanlivercancerSMMC-7721cells.theknocked-outSMMC-7721cellshavesignificantlyreducedinvasivenessandmobility,andCoCl2canincreasetherateofin-ducedcellapoptosisundersimulatedhypoxiaconditions.CervicalcancercellmodelTheT1siteinHPV16E6genewaslocatedbyCRISPR-Cas9system,andthereplacementwasdesignedonitspromotertoknockoutE6gene.TheresultsshowthatCRISPR-Cas9systemmediatedbyHPVpseudotypevirushassignificanteffectoninhibitinghumanpapillomavirusE6geneandtreatingcervicalcancer.PancreaticcancercellmodelThepromoterofC1GALT1tumorsuppressorgenewastargetedbyCRISPR-Cas9andknockedouttoconstructC1GALT1knocked-outpancreaticductaladenocarcinomacelllines(T3M4andCD18/HPAF).InvitrocelltestsconfirmedthatC1GALT1knockoutwillleadtoincreasedgeneexpressionofPDACgenerationandtransfer.ThyroidcancercellmodelByusingCRISPR-Cas9genomeediting,EGFRgeneisinsertedintoATCcelllinetoimprovethesensitivityoftargetedEGFRsmallmoleculetargeteddrugtherapyandexplainthemechanismofdrugaction.MyeloidtumorcellmodelByusingCRISPR-Cas9genomeeditingtechnology,theASXL1genemutantU937celllinewasconstructedbytargetingexon5-10ofASXL1oncogene.Comparedwithwild-typeU937cells,itshowsobviousdefectsinmonocyte/macrophagedifferentia-tion.Themechanismofdifferentiationdefectsisrelatedtothechangesofcytochromeb-245βchainandC-typelectindomainfamily5memberA.MalignantPleuralMesotheliomaCellModelByusingCRISPR-Cas9system,aMeT-5AcellmodelofhumanendothelialcellswithNF2exon8knockedoutwasconstruc-ted.InNF2knockoutcelllines,theirinvasiveactivityissignificantlylowerthanthatofwild-typecelllines.InNF2-knock-outcelllines,fibroblastgrowthup-regulatingfactorreceptor2increaseswithincreasingphosphorylationlevelsinJNK,c-Junandretinoblastoma.However,theincreaseoftheabovelevelcanbedecreasedwiththeexogenousincreaseofNF2expres-sion.OsteosarcomacellmodelExon1ofCD44inosteosarcomadrug-resistantcelllines(KHOSR2andU-2OSR2)wasspecificallyknockedoutbyCRISPR-Cas9system.Comparedwithnon-knock-outdrug-resistantstrains,afterknockingoutCD44gene,themigrationandinvasionactivityofdrug-resistantstrainsaresignificantlyinhibited,andknockingoutthegenecanimprovethetherapeuticsensitivityofchemotherapydrugs.

3 展 望

CRISPR-Cas9是細(xì)菌的適應(yīng)性防御系統(tǒng)，通過RNA介導(dǎo)，可實(shí)現(xiàn)特異性地切割外源遺傳物質(zhì)的功能。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)除在構(gòu)建基因模型細(xì)胞模型上取得了一定的成績，在腫瘤免疫臨床治療及改善腫瘤藥物耐藥等相關(guān)研究方面亦獲得了一定認(rèn)可。但CRISPR-Cas9技術(shù)仍存在脫靶現(xiàn)象。由于 Cas9 蛋白能接受的 sgRNA與基因組 DNA 的不完全匹配，導(dǎo)致細(xì)胞中的 Cas9 蛋白濃度越高，脫靶現(xiàn)象越嚴(yán)重。目前已有許多學(xué)者致力于該項(xiàng)技術(shù)的改進(jìn)。隨著CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的完善，其可為研究基因功能的缺失、突變等與腫瘤表型的相關(guān)性、腫瘤基因致癌機(jī)理及腫瘤抑癌基因的研究、腫瘤的基因治療等提供新的方向與策略。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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